ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHAN HUÊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP NANO BẠC BẰNG SINH KHỐI VI KHUẨN B.subtilis và B.licheniformis LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHAN HUÊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP NANO BẠC BẰNG SINH KHỐI VI KHUẨN B.subtilis và B.licheniformis Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, khoa học và công nghệ nano đã phát triển như vũ bão. Các vật liệu nano với những đặc tính kì lạ, đặc biệt về quang, điện, từ, sinh học đã và đang thâm nhập vào toàn bộ lĩnh vực trong đời sống và kinh tế của thế giới. Với kích thước nano các loại vật liệu này có thể can thiệp đến từng phân tử -nguyên tử, điều này đặc biệt quan trọng trong ứng dụng Y-sinh học. Trong lĩnh vực Công nghệ nano, công nghệ nano bạc đóng vai trò khá quan trọng. Bạc ở kích thước nano là một kháng sinh tự nhiên và rất mạnh, có khả năng phòng ngừa nhiều bệnh truyền nhiễm trong đó có cả bệnh AIDS (virus HIV). Nano bạc có khả năng vô hiệu hóa hầu như tất cả các enzyme cần thiết cho sự trao đổi oxygen của vi khuẩn, virút và nấm. Nano bạc có khả năng giết chết hơn 650 loại vi khuẩn khác nhau chỉ trong vòng một phút [31]. Tất cả các vi khuẩn không bị lờn với kháng sinh bạc và vì thế, các hạt nano bạc không bị mất tác dụng. Ngoài ra, các hạt nano bạc cũng sẽ giúp tạo ra các oxygen hoạt tính từ trong không khí hoặc từ trong nước và từ đó phá hủy các màng tế bào của vi khuẩn. Hiện nay, các ứng dụng của bạc nano đang phát triển không ngừng đặc biệt là trong lĩnh vực y sinh, do đó nhu cầu về bạc nano trên thị trường sẽ không ngừng tăng lên. Trong khi đó, tổng hợp bạc nano theo các phương pháp cổ điển (hóa học, vật lý, hóa lý kết hợp) thường gây nhiều tác động xấu đến môi trường, chi phí đầu tư rất tốn kém, giá thành cao lại khó sản xuất rộng rãi, nên có thể nói phương pháp sinh tổng hợp là một xu hướng mang tính tất yếu. Phương pháp tổng hợp theo hướng này tạo ra các hạt nano bạc đạt tiêu chuẩn về kích thước và phân bố tốt hơn so với các phương pháp khác đồng thời mở ra triển vọng sản xuất với qui mô lớn. Các hạt nano cũng có thể được ổn định ngay trong quy trình sản xuất bởi các polymer sinh học. Nhằm tiếp cận với phương pháp mới này, tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc bằng vi khuẩn B.subtilis và B.licheniformis ” làm luận văn tốt nghiệp. Đề tài hướng đến các mục tiêu sau: 2 • Thu được vật liệu nano bạc có kích thước nhỏ, độ bền cao (trên 3 tháng) và hiệu suất kháng khuẩn cao (trên 90%) bởi vi khuẩn B.subtilis và B.licheniformis. • Xác định các điều kiện (lượng sinh khối, nồng độ AgNO 3 , thời gian phản ứng) thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp nano bạc ngoại bào (B.subtilis) và nội bào (B.licheniformis). • Dùng dung dịch nano bạc thu được để chế tạo vải kháng khuẩn Những mục tiêu nêu trên được cụ thể hóa qua nội dung thực hiện sau đây:  Khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu của B.subtilis và B.licheniformis  Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện (lượng sinh khối vi khuẩn, thời gian phản ứng, nồng độ AgNO 3 ) đến quá trình sinh tổng hợp bạc nano.  Phân tích đặc điểm hóa lý của các dung dịch nano bạc thu được (khảo sát hình dạng, sự phân bố kích thước hạt -TEM, giản đồ nhiễu xạ tia X-XRD)  Kiểm tra khả năng ổn định, hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch bạc nano được sinh tổng hợp từ chủng B.subtilis và B.licheniformis  Thử nghiệm ngâm tẩm vải non-woven với dung dịch nano bạc tổng hợp được và kiểm tra hiệu quả kháng khuẩn của mẫu vải sau khi ngâm. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tình hình nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc trong nước và trên thế giới 4 Công nghệ nano là một khoa học mới đang phát triển rất nhanh chóng và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuôc sống như điện tử, hóa học, y sinh học Trong đó nổi bật là công nghệ nano bạc vì bạc nano có hoạt tính diệt khuẩn cao, không độc hại với con người và môi trường. Hiện có nhiều phương pháp hóa, lý hoặc kết hợp hóa - lý được sử dụng để tổng hợp bạc nano. Nhìn chung các phương pháp này cho hiệu suất cao, thời gian tổng hợp ngắn nhưng lại gây tác động lớn đến môi trường, sử dụng các hóa chất thiết bị đắt tiền. Do đó, phương pháp tổng hợp theo hướng sinh học thân thiện với môi trường được đặc biệt chú ý. Ngoài nước: Vào năm 2001 Klaus-Joerger nhận thấy vi khuẩn Pseudomonas stutzeri AG259 phân lập từ mỏ bạc có thể khử Ag + trong dung dịch muối AgNO 3 thành các hạt Ag nano trong vùng chu chất của nó [13]. Tiếp sau đó, rất nhiều báo cáo cho thấy các chủng vi sinh đơn bào (vi khuẩn) hoặc đa bào (nấm sợi, nấm đảm) đều có khả năng khử Ag + tạo bạc nano theo các cơ chế ngoại bào hoặc nội bào. Cụ thế như A.Ahmad chứng minh khả năng tổng hợp nano bạc của nấm Fusariuim oxysporum [10]. Sastry và cộng sự nhận thấy Verticillium sp và Fusariuim oxysporum khi tiếp xúc với ion Au 3+ và Ag + sẽ nhanh chóng khử các ion này tạo thành hạt nano kim loại [32]. N.Duran nghiên cứu cơ chế khử Ag + thành Ag 0 của F.oxysporum [15]. S.Basavaraja khảo sát quá trình sinh tổng hợp bạc nano ngoại bào bởi nấm Fusarium semitectum [11]. K.C.Bhainsa xác định có sự hình thành nano bạc khi cho nấm Aspergillus flavus tiếp xúc với muối bạc nitrate [36]. K.Kalimuthu khảo sát khả năng tổng hợp nano bạc của vi khuẩn Bacillus licheniformis [19]. N.Saifuddin nghiên cứu phương pháp tổng hợp nano bạc nhờ Bacillus subtilis [31]. N.Mokhtari sử dụng Klebsiella pneumonia để thu nhận bạc nano [27] Các vi sinh vật sử dụng hệ enzyme khử nitrate để đưa AgNO 3 về Ag tạo nên những hạt nano có kích thước rất nhỏ, chỉ khoảng dưới 20nm, do đó làm tăng hiệu quả kháng khuẩn khi so sánh với phương pháp hoá – lý cổ điển [10]. 5 Trong nước: Hiện nay có rất ít công trình khoa học liên quan đến hướng sinh tổng hợp nano bạc. Nghiên cứu sinh tổng hợp bạc nano bằng nấm Fusarium oxysporum (Nguyễn Hoàng Ngọc Phương và cộng sự (2009)). 1.2.Vật liệu nano Để hiểu rõ khái niệm vật liệu nano, chúng ta cần biết hai khái niệm có liên quan là khoa học nano và công nghệ nano. Theo Viện hàn lâm hoàng gia Anh quốc: • Khoa học nano là ngành khoa học nghiên cứu về các hiện tượng và sự can thiệp vào vật liệu theo các quy mô nguyên tử, phân tử và đại phân tử. Với quy mô này, tính chất của vật liệu khác hẳn so với tính chất của chúng ở các quy mô lớn hơn. • Công nghệ nano là việc thiết kế, phân tích đặc trưng, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng và kích thước trên quy mô nano mét. Vật liệu nano là đối tượng của hai lĩnh vực là khoa học nano và công nghệ nano, nó liên kết hai lĩnh vực trên với nhau. Kích thước của vật liệu nano từ 0,1 nm đến 100 nm [2]. 1.2.1.Phân loại vật liệu nano Có rất nhiều cách phân loại vật liệu nano, mỗi cách phân loại cho ra rất nhiều loại nhỏ nên thường hay làm lẫn lộn các khái niệm. Sau đây là một vài cách phân loại thường dùng. Phân loại theo hình dáng của vật liệu • Vật liệu nano không chiều (cả ba chiều đều có kích thước nano), ví dụ đám nano, hạt nano. • Vật liệu nano một chiều là vật liệu trong đó một chiều tự do, hai chiều có kích thước nano, ví dụ dây nano, ống nano. 6 • Vật liệu nano hai chiều là vật liệu trong đó hai chiều tự do, một chiều có kích thước nano, ví dụ màng mỏng (có chiều dày kích thước nano). • Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có một phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có nano không chiều, một chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau. Cũng theo cách phân loại theo hình dáng của vật liệu, một số người đặt tên số chiều bị giới hạn ở kích thước nano. Nếu như thế thì hạt nano là vật liệu nano 3 chiều, dây nano là vật liệu nano 2 chiều và màng mỏng là vật liệu nano 1 chiều. Phân loại theo tính chất vật liệu thể hiện sự khác biệt ở kích thước nano • Vật liệu nano kim loại. • Vật liệu nano bán dẫn. • Vật liệu nano từ tính. • Vật liệu nano sinh học • Nhiều khi người ta phối hợp hai cách phân loại với nhau, hoặc phối hợp hai khái niệm nhỏ để tạo ra các khái niệm mới. Ví dụ, đối tượng chính của chúng ta sau đây là "hạt nano kim loại" trong đó "hạt" được phân loại theo hình dáng, "kim loại" được phân loại theo tính chất hoặc "vật liệu nano từ tính sinh học" trong đó cả "từ tính" và "sinh học" đều là khái niệm có được khi phân loại theo tính chất. 1.2.2.Hạt nano kim loại Hạt nano kim loại là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thước nano được tạo thành từ các kim loại. Người ta biết rằng hạt nano kim loại như hạt nano vàng, nano bạc được sử dụng từ hàng nghìn năm nay. Nổi tiếng nhất có thể là chiếc cốc Lycurgus được người La Mã chế tạo vào khoảng thế kỉ thứ tư trước Công nguyên và hiện nay được trưng bày ở Bảo tàng Anh. Chiếc cốc đó đổi màu tùy thuộc vào cách người ta nhìn nó. Nó có màu xanh lục khi nhìn ánh sáng phản xạ trên cốc và có màu đỏ khi nhìn ánh sáng đi từ trong cốc và xuyên qua thành cốc. Các phép phân 7 tích ngày nay cho thấy trong chiếc cốc đó có các hạt nano vàng và bạc có kích thước 70 nm và với tỉ phần mol là 14:1. Tuy nhiên, phải đến năm 1857, khi Michael Faraday nghiên cứu một cách hệ thống các hạt nano vàng thì các nghiên cứu về phương pháp chế tạo, tính chất và ứng dụng của các hạt nano kim loại mới thực sự được bắt đầu. Khi nghiên cứu, các nhà khoa học đã thiết lập các phương pháp chế tạo và hiểu được các tính chất thú vị của hạt nano. Một trong những tính chất đó là màu sắc của hạt nano phụ thuộc rất nhiều vào kích thước và hình dạng của chúng [4]. Ví dụ, ánh sáng phản xạ lên bề mặt vàng ở dạng khối có màu vàng. Tuy nhiên, ánh sáng truyền qua lại có màu xanh nước biển hoặc chuyển sang màu da cam khi kích thước của hạt thay đổi. Hiện tượng thay đổi màu sắc như vậy là do một hiệu ứng gọi là cộng hưởng plasmon bề mặt. Chỉ có các hạt nano kim loại, trong đó các điện tử tự do mới có hấp thụ ở vùng ánh sáng khả kiến làm cho chúng có hiện tượng quang học thú vị như trên [28], [44]. 1.2.3.Hạt nano bạc Bạc nano là những hạt bạc có kích thước nằm trong khoảng 0,1 đến 100nm. Bạc nano thường ở dưới dạng các dung dịch keo với các chất bảo vệ là các polymer (polyvinylalcol PVA, polyethylenglycol PEG, polyvinyl pyrolidone PVP) để các hạt nano bạc không bị kết tụ. Bạc ở kích thước nano có những đặc trưng rất khác so với bạc bình thường. Đó là một kháng sinh tự nhiên và rất mạnh, có khả năng phòng ngừa nhiều bệnh truyền nhiễm. Tính chất kháng khuẩn của dung dịch keo nano bạc đã được tìm hiểu một cách khoa học vào đầu thế kỷ 20, nhưng sự phát minh ra thuốc kháng sinh đã ngăn cản những nghiên cứu sâu trong lĩnh vực này. Những năm gần đây do công nghệ nano phát triển và do các kháng sinh càng ngày càng bị lờn với vi khuẩn, virus nên việc nghiên cứu ứng dụng nano bạc trong lĩnh vực Y sinh học được quan tâm nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ [28]. Nhìn chung, nano bạc có những đặc điểm đáng quan tâm sau đây: 8 • Diệt trên 650 loại vi khuẩn • Hiệu quả cao • Tác dụng nhanh • Không độc • Không kích thích • Không gây dị ứng Tính kháng khuẩn của nano bạc được giải thích theo một số cơ chế sau:  Với tính chất xúc tác, nano bạc vô hiệu hoá các enzyme mà vi khuẩn và nấm cần cho quá trình trao đổi chất của tế bào dẫn đến rối loạn quá trình biến dưỡng của vi khuẩn. Tác động này làm cho vi khuẩn bị tiêu diệt nhanh chóng [14], [22].  Hạt nano bạc liên kết với các nhóm chứa phospho trong phân tử DNA làm rối loạn quá trình sao chép DNA làm chết vi khuẩn [18], [33].  Các hạt bac nano tương tác với nhóm -SH của các protein, enzyme trên màng tế bào dẫn đến sự thay đổi hình thái và gia tăng tính thấm của màng. Sự vận chuyển vật chất qua màng tăng làm vỡ màng tế bào của vi khuẩn [18], [23].  Nano bạc giúp tạo ra các oxyen hoạt tính từ trong nước hoặc không khí tương tác với các lipid màng làm tổn thương màng [26]. Hình 1.1.Cơ chế diệt khuẩn của bạc 9 Nhờ có kích thước rất nhỏ (0,1 nm – 100nm), diện tích bề mặt tổng cộng của bạc nano rất lớn và hiệu quả hoạt động của bạc nano tăng đáng kể so với hạt bạc có kích thước lớn hơn (micro) [28]. Đây là ưu điểm của hạt nano bạc so với hạt bạc có kích thước lớn hơn và với ion. Theo tính toán lý thuyết bạc nano có hoạt tính mạnh hơn ít nhất 40 lần trên mỗi đơn vị bạc so những dung dịch keo bạc thông thường. Vì vậy, người ta có thể sử dụng ít bạc hơn để đạt được hiệu quả tương đương. Điều này rất có ý nghĩa vì theo EPA (Environmental Protection Agency), một người chỉ có thể dùng tối đa 350 µg/ liều dùng mỗi ngày, nếu nhiều hơn sẽ bị hiện tượng Argyria hay còn gọi là trúng độc bạc. Nếu dùng 1 – 2 muỗng càphê/ngày (20 ppm) tương đương 100 – 200 µg/ngày (thấp hơn so với khuyến cáo của EPA về hàm lượng bạc trong nguồn nước cung cấp ở Mỹ), ta sẽ có hiệu quả phòng bệnh rất tốt. Điều này đảm bảo cho người dùng có thể sử dụng nano bạc như một chất bổ sung trong bữa ăn hay trong nước uống mà không bị hiện tượng Argyria [28]. Về ảnh hưởng của nano bạc đến sức khoẻ con người, các nhà khoa học cho rằng nano bạc có khả năng diệt vi khuẩn, mà tiêu hóa của con nguời có được là do các vi khuẩn có lợi cho cơ thể và vì thế, họ vẫn nghi ngờ rằng các hạt nano bạc cũng có thể diệt các vi khuẩn này và ảnh hưởng đến sức khoẻ. Tuy nhiên cho đến nay chưa thấy công trình nào công bố sự tác hại của nano bạc. Các nghiên cứu tại Odense Universitets Hospital [28] cũng đã chứng minh rằng các hạt nano bạc được hấp thu vào trong cơ thể mà không hề gây ra một tác dụng phụ nào cũng như gây độc cho cơ thể. Các nhà khoa học còn chứng minh các hạt nano bạc sẽ được giải phóng ra khỏi cơ thể theo thời gian [28]. Các hãng sản xuất những sản phẩm chứa nano bạc chẳng hạn như Samsung phát biểu rằng các sản phẩm của họ đều được thử nghiệm và cho đến nay họ vẫn khẳng định tính an toàn của nó đối với sức khoẻ của người sử dụng [5]. [...]... khí và nó không phải là mầm bệnh trong môi trường [31] Với những đặc tính này, B subtilis là một đối tượng tốt để nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp nano bạc bởi vi khuẩn 1.6 Phương pháp xác định tính chất và kích thước hạt nano bạc Một vấn đề thiết yếu trong vi c nghiên cứu này là xác định và nghiên cứu các phần tử nano bạc Bước đầu tiên là xác định các hạt nano bạc có được tạo thành sau quá trình tổng. .. mật độ sinh khối ở đầu và cuối quá trình tăng trưởng t: độ dài thời gian của quá trình tăng trưởng 2.2.2 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp nano bạc 2.2.2.1 Khảo sát hàm lượng sinh khối vi khuẩn thích hợp Chủng B.subtilis, B.licheniformis được nuôi cấy lắc trong môi trường [MT1] ở 37oC, 200rpm; Sau 24 giờ, dịch vi khuẩn được ly tâm với tốc độ 3000 rpm, 15 phút; Loại bỏ dịch nổi, thu sinh khối và rửa... chứng N2 là số khuẩn lạc trong đĩa chứa nano bạc (2.3) 35 2.2.6 Khảo sát độ bền của dung dịch nano bạc tạo thành Tiến hành phản ứng sinh tổng hợp với: • 10g sinh khối B.subtilis trong 100ml dung dịch AgNO3 (2mM), sau 4 ngày ly tâm 5000 rpm trong 15 phút thu dịch nổi • 10g sinh khối B.licheniformis trong 100ml dung dịch AgNO3 (2mM), sau 5 ngày ly tâm thu sinh khối, rửa sạch và huyền phù sinh khối trong... màng tế bào bằng sóng siêu âm trong vòng 30 giây (lặp lại 5 lần); Dịch sau khi xử lý đem ly tâm ở tốc độ 10000 rpm trong 30 phút; Thu lấy dịch nổi sau ly tâm đem phân tích Tiến hành tương tự đối với mẫu đối chứng gồm: 10g sinh khối B.subtilis hoặc B.licheniformis và 100ml nước cất Dựa vào kết quả phân tích phổ UV-Vis để xác định lượng sinh khối vi khuẩn phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp nano bạc 2.2.2.2... thước và hình dạng hạt nano bạc tạo thành (TEM) Thực hiện phản ứng sinh tổng hợp với 100ml dung dịch AgNO3 (2mM) và 10g sinh khối B.subtilis (trong 4 ngày), B.licheniformis (5 ngày) Sau đó xử lý mẫu và thu lấy dịch nổi giống như trong phần [2.2.3] Dịch nổi thu được đem chụp TEM để xác định hình dạng và sự phân bố kích thước hạt nano bạc 2.2.5 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch nano bạc Nguyên... mặt sần sùi Vi khuẩn này thường được sử dụng trong công nghiệp chất tẩy, bột giặt, xử lý nước do có khả năng tiết enzyme protease, amylase ngoại bào Được dùng làm thuốc trừ nấm bệnh trên cây trồng do có khả năng tạo ra kháng sinh chống lại một số loại nấm [42] 19 1.4.4 Sinh tổng hợp nano bạc bởi B.licheniformis Một số nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp nano bạc nội bào... naphthoquinone và anthraquinone tìm thấy ở nấm Fusarium oxysporum cũng có thể đóng vai trò chất truyền điện tử trong quá trình khử kim loại bởi tính chất oxi hóa khử đặc trưng của chúng [10],[15] Hình 1.6 Cơ chế giả thuyết của quá trình sinh tổng hợp nano bạc 17 Dựa vào vị trí của các đám nguyên tử nano bạc được tổng hợp mà người ta chia quá trình tổng hợp sinh học thành hai dạng: Tổng hợp nội bào: sản phẩm nano. .. cho quá trình tổng hợp 2.2.2.3 Khảo sát thời gian sinh tổng hợp nano bạc Hai chủng B.subtilis và B.licheniformis được nhân sinh khối trong môi trường [MT1] ở 37oC, 200rpm trong 24 giờ; Dịch nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 3000 rpm trong 15 phút; Thu sinh khối và rửa với dung dịch đệm phosphate pH 7; Chuyển 10g sinh khối vào 100ml dung dịch AgNO3 2mM và ủ trong tối ở 37oC, 200 rpm trong vòng từ 1 đến... nồng độ AgNO3 đến quá trình sinh tổng hợp nano bạc Chủng B.subtilis, B.licheniformis được nuôi cấy lắc trong môi trường [MT1] ở 37oC, 200rpm; Sau 24 giờ, dịch vi khuẩn được ly tâm tốc độ 3000 rpm, 15 phút; Thu sinh khối và rửa với đệm phosphate pH 7,0; Chuyển 10g sinh khối vào bình chứa 100ml dung dịch AgNO3 có nồng độ lần lượt là 0.5mM, 1mM, 2mM, 3mM; Tiến hành ủ trong tối và lắc với tốc độ 200rpm,... chứng tương tự như mục 2.2.2.1 Dựa vào kết quả phân tích phổ UV-Vis của các mẫu theo thời gian để xác định thời gian tổng hợp nano bạc thích hợp nhất 33 2.2.3 Phân tích giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) Tiến hành phản ứng sinh tổng hợp với: • 10g sinh khối B.subtilis trong 100ml dung dịch AgNO3 (2mM), sau 4 ngày ly tâm 5000 rpm trong 15 phút thu dịch nổi • 10g sinh khối B.licheniformis trong 100ml dung dịch . trình sinh tổng hợp nano bạc 17 Dựa vào vị trí của các đám nguyên tử nano bạc được tổng hợp mà người ta chia quá trình tổng hợp sinh học thành hai dạng: Tổng hợp nội bào: sản phẩm nano bạc. hướng sinh tổng hợp nano bạc. Nghiên cứu sinh tổng hợp bạc nano bằng nấm Fusarium oxysporum (Nguyễn Hoàng Ngọc Phương và cộng sự (2009)). 1.2.Vật liệu nano Để hiểu rõ khái niệm vật liệu nano, . HỌC TỰ NHIÊN PHAN HUÊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP NANO BẠC BẰNG SINH KHỐI VI KHU N B.subtilis và B.licheniformis Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 1 MỞ