Đang tải... (xem toàn văn)
PHỤ LỤCPhụ lục 1: Pha TE 1XPha TE 10X :Cân 0,121g Tris base 100mM, chỉnh pH 8,0 bằng HCl Thêm 0,186g EDTA 50mM, rồi định mức 10ml ta có được TE 10X.Từ TE 10X pha thành TE 1X : 1ml TE10X và 9ml nước cất.Phụ lục 2: Pha 500ml TBE 1X từ TBE 10XTBE 10X chứa các thành phần: Tris 89mMAcid boric 89mMEDTA 2mM, pH 8,4. Lấy 10ml TBE 10X rồi định mức bằng nước cất đến 500ml ta có được TBE 1XPhụ lục 3: Thành phần dung dịch tải mẫu 5X (Loading dye)50 mM TrisHCl, pH 8,025% Glycerol5 mM EDTA0,2% Bromophenol Blue0,2% Xylene Cyanole FFPhụ lục 4: Thành phần đệm PCR (Pfu buffer)100 mM TrisHCl, pH 8.3 ở 25°C; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2; 0,01% gelatin.Phụ lục 5: Cách pha SDS 10%Cân chính xác 0,1g SDS hòa tan trong khoảng 1ml nước cất.Đun nóng dung dịch trong bể ổn nhiệt đến khi SDS tan hết.Phụ lục 6: Cách pha Tris HCl 0,5M pH 8,0; Tris HCl 20mM pH 7,0 Khối lượng Tris base cần dùng cho 250ml Tris HCl 0,5M: m = C.V.M = 0,5.0,25.121,1 = 15,1375gCân chính xác 15,1375g Tris base hòa tan vào trong khoảng 200ml nước cất.Chỉnh pH 8,0 bằng HCl.Định mức đến 250ml.Khối lượng Tris base cần dung cho 100ml Tris HCl 20nM :Cân chính xác 0,242g Tris base hòa tan vào 50ml nước cấtChỉnh pH 7,0 bằng HCl Định mức đến 100mlPhụ lục 7: Cách pha phenolĐun cách thủy chai phenol ở nhiệt độ khoảng 800C đến lúc thành thể lỏng. Lấy ra khoảng 100ml, thêm 100ml Tris HCl 0,5M pH 8,0 vào, khuấy trong 20 phút bằng máy khuấy từ. Chờ khoảng 30 phút, hút phần dung dịch ở trên bỏ đi.Thêm vào tiếp 100ml Tris HCl 0,1M pH 8,0, khuấy trong 20 phút. Chờ 30 phút để tách thành 2 pha rồi lại hút phần dung dịch ở trên bỏ đi.Lặp lại bước trên khoảng 3 – 4 lần, chuẩn độ bằng giấy quỳ, nếu pH của phenol trên 7 hay 8 là đạt.Chia ra cho vào các ống Falcol. Sau cùng thêm vào khoảng 10ml Tris HCl 0,1M và bảo quản ở 200C.Phụ lục 9: Cách pha NaCl 0,5M, NaCl 2MPha 100ml NaCl 0,5MCân chính xác 2,922g NaCl hòa tan vào khoảng 90ml nước cất.Định mức đến 100ml.Pha 10ml NaCl 2MCân chính xác 1,17g NaCl hòa tan vào 5ml nước cất.Định mức đến 10ml.Phụ lục 10: Cách pha ethanol 70%Lấy 70ml ethanol tuyệt đối cho vào bình tam giác, thêm vào 30ml nước cất ta được 100ml ethanol 70%.Phụ lục 12: Cách pha gel agarose 1%Đối với gel agarose 1%: Cân 0,5g agarose hòa vào 50ml TBE 1X, đun trong lò vi sóng đến khi agarose tan hết.Phụ lục 13: Cách pha mồi PCRMồi ở dạng đông khô, cần thêm nước cất vô trùng đã khử DNase, RNase (dH2O) vào để hòa tan mồi thành dạng lỏng.Thêm vào ống chứa mồi xuôi (P1 – F) 392µl dH2O (đã khử DNase, RNase) và ống chứa mồi ngược (P1 – R) 386 µl dH2O (theo hướng dẫn của nhà sản xuất SIGMA) ta được 2 mồi có nồng độ 100µM mỗi mồi.Ta dùng mồi có nồng độ 25µM mỗi mồi nên tiến hành pha loãng mồi ban đầu.Lấy 12,5µl mỗi mồi cho vào 1 ống eppendorf sạch DNase, RNase. Thêm vào 25µl dH2O (đã khử DNase, RNase), vortex đều ta được 50µl mồi (gồm cả mồi xuôi và mồi ngược) có nồng độ 25µM mỗi mồi.
Đồ án tốt nghiệp GVHD : TS.Đặng Đức Long MỞ ĐẦU Trong lĩnh vực khoa học công nghệ nano, sắt kim loại kích thước nano quan tâm nghiên cứu nhiều, có ứng dụng đa dạng sản xuất đời sống Gần hạt nano sắt từ ứng dụng nhiều vào công nghệ thông tin truyền thông chế tạo linh kiện điện tử cảm ứng Một nhánh quan trọng cơng nghệ nano, lý sinh học nano, đó, vật liệu nano sử dụng để chẩn đốn, điều trị bệnh nghiên cứu sinh học phân tử Trong sinh học phân tử, người ta thường xuyên phải tách phân tử DNA, RNA khỏi môi trường chúng để làm tăng nồng độ phân tích cho mục đích khác Cơng việc tách chiết DNA đảm bảo độ tinh quan trọng với phương pháp thông thường phải sử dụng nhiều hóa chất, dung mơi hữu cơ, tốn nhiều thời gian Trong đó, nước ngồi phân tách DNA sử dụng hạt nanơ từ tính phương pháp thường sử dụng Vì làm giảm thời gian xử lý, lượng hóa chất cần dùng, phân tách dễ dàng cách sử dụng nam châm Ngồi ra, hạt nano từ tính cịn ứng dụng nhiều xét nghiệm mẫu máu bệnh nhân nhiễm loại virus viêm gan B, bệnh ung thư, dẫn truyền thuốc … Hạt nano từ tính ứng dụng nhiều độ nhạy cao, dễ ứng dụng thu hồi lại Nhưng Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu cơng nghệ sản xuất hạt nano từ tính dùng cơng nghệ sinh học Vì chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo sử dụng hạt nano sắt từ để gắn kết với DNA” Mục tiêu đề tài tạo loại vật liệu ứng dụng cơng nghiệp, y sinh học Đồng thời tiến hành thử nghiệm ứng dụng vào nghiên cứu sinh học phân tử mà cụ thể gắn kết với DNA cho nhiều mục đích nghiên cứu khác SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp GVHD : TS.Đặng Đức Long CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp GVHD : TS.Đặng Đức Long 1.1 Giới thiệu hạt nano sắt từ Vật liệu nano sâu vào đời sống đại chiếm ý nghĩa lớn đời sống người nhờ vào tính chất đặc biệt chúng mà vật liệu truyền thống trước khơng có Tính đặc biệt vật liệu nano có nhờ kích thước nhỏ bé chúng.[3] Vật liệu nanơ xít sắt từ tính thường ứng dụng y sinh học có sẵn tự nhiên tổng hợp Hai loại xít sắt nghiên cứu ứng dụng nhiều magnetite Fe 3O4 maghemite γ - Fe2O3 Ngồi loại ferrite MO.Fe2O3 M = Ni, Co, Mn, Zn, Mg nghiên cứu nhiều.[7] 1.1.1 Các phương pháp tạo hạt nano sắt từ 1.1.1.1 Phương pháp nghiền Phương pháp nghiền phát triển từ sớm để chế tạo hạt nanô từ tính dùng cho ứng dụng vật lý truyền động từ mơi trường khơng khí vào buồng chân khơng, làm chất dẫn nhiệt loa công suất cao, Trong nghiên cứu chất liệu từ [18], vật liệu từ tính ơ-xít sắt Fe 3O4, nghiền với CHHBM (a-xít Oleic) dung mơi (dầu, hexane) CHHBM giúp cho trình nghiền dễ dàng đồng thời tránh hạt kết tụ với Sau nghiền, sản phẩm phải trải qua q trình phân tách hạt phức tạp để có hạt tương đối đồng nhất.[3] Phương pháp nghiền có ưu điểm đơn giản chế tạo vật liệu với khối lượng lớn Việc thay đổi CHHBM dung mơi khơng ảnh hưởng nhiều đến q trình chế tạo Tuy nhiên có nhược điểm tính đồng hạt nanơ khơng cao khó khống chế q trình hình thành hạt nanơ Hạt nanơ từ tính chế tạo phương pháp thường dùng cho ứng dụng vật lý.[3] SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp GVHD : TS.Đặng Đức Long 1.1.1.2 Phương pháp đồng kết tủa Phương pháp đồng kết tủa phương pháp thường dùng để tạo hạt ơ-xít sắt Có hai cách để tạo xít sắt phương pháp hydroxide sắt bị xi hóa phần chất xi hóa già hóa hỗn hợp dung dịch có tỉ phần hợp thức Fe +2 Fe+3 dung mơi nước Phương pháp thứ thu hạt nanơ có kích thước từ 30 nm – 100 nm Phương pháp thứ hai tạo hạt nanơ có kích thước từ nm – 15 nm Bằng cách thay đổi pH nồng độ ion dung dịch mà người ta có kích thước hạt mong muốn đồng thời làm thay đổi điện tích bề mặt hạt hình thành.[3] 1.1.1.3 Phương pháp sinh học Phương pháp sinh học phân tử protein chứa sắt ferritin phương pháp nghiên cứu kĩ lưỡng Ferritin gồm lõi Fe 3+ hydrate hóa bao nhiều lớp protein Do lõi Fe 3+ bị giam hãm mà người ta tạo hạt nano magnetite[10] magnetite/maghemite [24] với kích thước – nm cách xi hóa apoferritin (ferritin trống) trimethylamino-N-oxide [3] 1.1.1.4 Phương pháp hóa siêu âm Phương pháp hóa siêu âm phản ứng hóa học hỗ trợ sóng siêu âm dùng để tạo hạt nanơ xít sắt.[8] Hạt nanơ từ tính dựa xít sắt chế tạo hóa siêu âm.[19] Đây phương pháp đơn giản để tạo hạt nanơ từ tính với từ độ bão hòa cao.[12] Muối iron (II) acetate cho vào nước cất hai lần cho chiếu xạ siêu âm với công suất khoảng 200 W/2 h mơi trường bảo vệ Sóng siêu âm tác dụng dạng xung để tránh tượng nhiệt siêu âm tạo Khi tác dụng siêu âm, dung dịch xuất chất có tính khử tính ơxi hóa H2, hydrogen peroxide (H2O2) Các sản phẩm trung gian lượng cao HO2 (superoxide), hydro nguyên tử, hydroxyl điện tử Các chất ơxi hóa muối sắt biến chúng thành magnetite Fe 3O4 Sau phản ứng xảy SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp GVHD : TS.Đặng Đức Long ta thu hạt nanô Fe3O4 với từ độ bão hịa đến 80 emu/g, cao gần giá trị Fe3O4 dạng khối.[3] Khi chiếu xạ siêu âm dung dịch chứa muối iron (II) acetate xuất phản ứng sau: H2O → H· + OH· H· + H· → H2 OH· + OH· → H2O2 Fe(CH3COO)2 → Fe2+ + 2(CH3COO)Chất ơxi hóa mạnh hydrogen peroxide xi hóa Fe 2+ thành Fe3+ theo phản ứng sau: Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + 2OH Các ion Fe2 Fe3+ kết hợp với để tạo thành magnetite [3] Hình 1.1 : Bằng phương pháp hóa siêu âm tạo hạt que Fe3O4.[3] 1.1.1.5 Phương pháp điện hóa Phương pháp điện hóa dùng để chế tạo hạt nanơ xít sắt từ tính Dung dịch điện hóa dung dịch hữu Kích thước hạt nanơ từ – nm điều khiển mật độ dòng điện phân Sự phân tán hạt nanô nhờ vào CHHBM dương Phương pháp phức tạp hiệu suất không cao phương pháp khác nên nghiên cứu [3] SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp GVHD : TS.Đặng Đức Long 1.1.2 Yêu cầu hạt nano từ tính dùng y sinh học Hạt nanơ từ tính dùng y sinh học cần phải thỏa mãn ba điều kiện sau: - Tính đồng hạt cao - Từ độ bão hịa lớn - Vật liệu có tính tương hợp sinh học (khơng có độc tính).[3] Tính đồng kích thước tính chất liên quan nhiều đến phương pháp chế tạo từ độ bão hịa tính tương hợp sinh học liên quan đến chất vật liệu Trong tự nhiên, sắt (Fe) vật liệu có từ độ bão hịa lớn nhiệt độ phịng, sắt khơng độc thể người tính ổn định làm việc mơi trường khơng khí nên vật liệu ơ-xít sắt Fe 3O4 nghiên cứu nhiều để làm hạt nanơ từ tính [3] 1.2 Giới thiệu phân tử Deoxyribonucleic Acid (DNA ) 1.2.1 Khái niệm DNA DNA hay deoxyribonucleic acid nguyên liệu di truyền người hầu hết tất thể sống Mỗi tế bào người chứa lượng DNA Hầu hết DNA nằm nhân ( gọi DNA nhân), lượng nhỏ DNA tìm thấy ti thể ( gọi DNA ti thể hay mtDNA ) [25] 1.2.2 Lược sử nghiên cứu Năm 1890, từ nhân tế bào có mủ, Mise (Đức) phân tích phát phân tử DNA Sau đó, năm 1924, phương pháp hố nhuộm, Fenlgen phát DNA thể nhiễm sắc nhân tế bào Về sau năm 40 kỷ 20, cấu trúc DNA tìm thấy với đơn vị cấu trúc nuclêotit Các nucleotit xếp thành cặp Đến năm 1953,Watson (Mỹ) Crick (Anh) từ nghiên cứu kỹ lưỡng phương pháp lý, hoá đặc sắc đưa cấu trúc phân tử xác DNA Họ xác nhận DNA có dạng chuỗi xoắn kép.[30] SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp GVHD : TS.Đặng Đức Long 1.2.3 Thành phần cấu tạo DNA Về cấu trúc phân tử, DNA cao phân tử (polime), gồm nhiều đơn phân (monome) gọi nucleotit Mỗi nucleotit gồm thành phần: - Đường pentozơ gọi đêoxiribozơ (C5H10O4) - Nhóm photphat (axit phophoric) - Bazơ nitơ Nhóm photphat gắn cacbon 5' đường đêoxiribozơ, cịn bazơ nitơ gắn vào cacbon 1' Có loại bazơ nitơ:loại Adenin (A) Guanin (G) dẫn xuất bazơ purin; dẫn xuất bazơ pyrimidin có Timin (T) Xytozin (X) Các nucleotit nối với thành chuỗi polinucleotit qua nhóm photphat đường pentozơ Mỗi gốc axit photphoric liên kết với nguyên tử cácbon 5' gốc đường với nguyên tử cacbon 3' gốc đường khác qua liên kết photphođieste Hai chuỗi polinucleotit xoắn lại với thành chuỗi xoắn kép, bazơ nitơ chuỗi liên kết với chuỗi liên kết hiđro theo nguyên tắc bổ sung Rõ ràng DNA có cấu tạo đa phân, nhiều đơn phân hợp lại, có cấu tạo nhiều bậc Sự đa dạng sinh giới bắt nguồn từ Ở lồi riêng có trình tự xếp nucleotit riêng phân tử DNA lồi, có đặc thù số lượng nucleotit riêng Trong loài virus đơn giản có đến 5000 nucleotit, cịn 46 NST người có đến 5000 tỉ nucleotit Trong chuỗi polinucleotit, đường pentozơ photphat giống nhau, riêng bazơ nitơ có liên kết khác nhau.[27] SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp GVHD : TS.Đặng Đức Long Hình 1.2 : Cấu tạo DNA [26] 1.2.4 Tính chất DNA DNA có tính keo phân tử lớn có tính acid có chứa gốc acid phosphoric tích điện âm Dưới tác dụng tác nhân nhiệt hay chất hóa học (formamide, urea), hai sợi đơn phân tử DNA bị tách rời liên kết hydro bazơ bổ sung bị phá vỡ - tượng gọi biến tính DNA (Các liên kết hydro giữ hai chuỗi xoắn kép liên kết yếu khiến chúng dễ dàng tách nhờ enzyme (trong điều kiện in vitro) nhiệt độ 90°C (điều kiện in vitro, PCR) Giá trị trung bình khoảng nhiệt độ q trình biến tính gọi nhiệt độ nóng chảy DNA (Tm - melting Temperature) Sau hai mạch đơn phân tử DNA tách rời ra, ta giảm nhiệt độ từ từ, cộng với điều kiện thích hợp hai mạch bắt cặp trở lại - tượng gọi hồi tính Nếu ta giảm nhiệt độ cách đột ngột bắt cặp trở lại không diễn [6] SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp GVHD : TS.Đặng Đức Long 1.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số Tách DNA cần thiết thực nghiệm công nghệ gen tiến hành với DNA DNA tách chiết cần phải đảm bảo độ tinh khiết nguyên vẹn cấu trúc để thực khâu nghiên cứu công nghệ gen Có nhiều phương pháp tách chiết DNA, tùy thuộc mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp tách DNA cho phù hợp [4] 1.3.1 Tách chiết DNA thực vật Tế bào thực vật màng tế bào cịn có lớp thành cellulose vững bên ngồi Do việc tách chiết DNA từ tế bào thực vật gặp phải khó khăn, phức tạp định Cho đến nay, có nhiều phương pháp tách chiết, tinh Dna khác từ nhiều đối tượng thực vật nhiên, việc tách chiết thực vật có nguyên tắc chung : - Nghiền mơ, tế bào biện pháp học : Nghiền mô đá khô, ni tơ lỏng cối, chày sứ để phá vỡ thành cellulose, giải phóng thành phần bên tế bào - Sử dụng đệm có chất tẩy để phá vỡ màng bào, giải phóng DNA - Sử dụng hóa chất (phổ biến EDTA) để bảo vệ DNA khỏi phân hủy enzyme nuclease nội bào - Sử dụng hóa chất chloroform, isoamyl alcohol, phenol … để loại protein tạp chất khỏi DNA - Thu hồi DNA cách kết tủa DNA cồn, isopropanol, sau ly tâm thu lấy kết tủa DNA - Hòa tan DNA nước cất dung dịch đệm.[4] 1.3.2 Tách chiết DNA động vật vi khuẩn Có thể tách chiết DNA động vật từ nguyên liệu khác máu, nước bọt, mơ cơ, lơng, tóc loại mơ khác Đối với vi khuẩn phải tiến hành ni vi khuẩn để thu sinh khối tế bào Có nhiều phương pháp tách chiết SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 10 GVHD : TS.Đặng Đức Long khác nhau[4] Tuy tách chiết DNA động vật vi khuẩn có chung nguyên tắc gồm giai đoạn : Phá bỏ màng tế bào Có thể phá bỏ màng tế bào màng nhân phương pháp hóa học, vật lý học Đối với phương pháp hóa học thường sử dụng chất tẩy rửa SDS, Triton 100 với nồng độ thích hợp Đối với phương pháp vật lý người ta thường sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ màng tế bào Loại bỏ protein Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng protein Sự tách chiết dựa nguyên tắc hòa tan khác phân tử khác (nucleic acid/protein) hai pha khơng hịa tan (phenol, chloroform/nước) Tủa nucleic acid Mục đích cơng đoạn nhằm thu nhận nucleic acid dạng cô đặc, mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi phân hủy enzyme cần hịa lại nước theo nồng độ mong muốn.[5] Thơng thường phương pháp tách chiết DNA sử dụng nhiều hóa chất để xử lý qua nhiều bước ly tâm nên nhiều thời gian 1.4 Cở sở việc cố định DNA lên hạt nano sắt từ Bất vật liệu có hưởng ứng với từ trường (H), thể độ từ hóa (từ độ - M) Tỷ số c = M/H gọi độ cảm từ Tùy thuộc vào giá trị, độ cảm từ phân làm loại vật liệu từ khác - Vật liệu có c < (~ -10-6) gọi vật liệu nghịch từ - Vật liệu có c > (~10-6) gọi vật liệu thuận từ - Vật liệu có c > với giá trị lớn vật liệu sắt từ, ferri từ Ở đây, vật liệu từ tính ngụ ý vật liệu sắt từ, ferri từ siêu thuận từ Ngoài độ cảm từ, số thống số khác quan trọng việc xác định tính chất vật liệu, ví dụ như: từ độ bão hịa Ms (từ độ đạt cực đại từ trường SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 31 GVHD : TS.Đặng Đức Long Sau thời gian bảo quản cho thấy hạt oxit sắt có bọc CA phân tán nước cất tốt so với hạt oxit sắt khơng có CA Nhờ có lớp CA bao phủ mà hạt sắt từ phân tán tốt hơn, hạt khơng bị kết dính, thời gian lắng xuống lâu Hình 3.6: Hạt nano sắt từ phân tán nước 3.1.1 Kích thước hạt nano sắt từ Kết phân tích kích thước hạt nano sắt từ kính hiển vi điện tử dẫn (TEM) khoảng 20nm đến 30nm Hình ảnh chụp Phịng Phân tích Trung tâm Phân tích Đo lường Hải quan miền Trung Hình 3.7: Hình ảnh hạt nano sắt từ khơng bọc CA chụp qua hệ thống TEM với độ phân giải x80000 SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 32 GVHD : TS.Đặng Đức Long Hình 3.8 : Hình ảnh hạt nano sắt từ có bọc CA chụp qua hệ thống TEM với độ phân giải x80000 Kích thước hạt nano phản ứng đồng kết tủa phụ thuộc vào độ pH nồng độ ion Khi thay đổi nồng độ ion cố định pH kích thước hạt thay đổi từ nhỏ đến lớn nồng độ từ loãng đến đặc[1] Kết thực nghiệm cho thấy với nồng độ 0.1 ion sắt (II) mẫu không gia nhiệt khơng có CA kết tủa sau nghiền mịn đũa thủy tinh có kích hạt lớn Bằng thị giác nhận thấy khác biệt rõ ràng hai mẫu hạt có nồng độ ion sắt (II) 0,1 0,05 phân tán chúng nước cất Mẫu sắt từ có nồng độ ion sắt (II) 0,1 kích thước hạt lớn, dễ dàng lắng xuống đáy thời gian ngắn so với mẫu sắt từ có nồng độ 0,05 Vì chúng tơi loại bỏ mẫu có nồng độ ion sắt (II) 0,1 mol khơng tiến hành phân tích kích thước hạt hệ thống TEM Tuy nhiên với nồng độ 0,1 ion sắt (II) mẫu hạt Fe 3O4 có gia nhiệt bổ sung CA kích thước hạt nhỏ hơn, hạt khơng bị kết dính với dung dịch, thời gian lắng xuống đáy lâu (hình 3.6) Sự khác biệt kích thước pH nồng độ gia nhiệt Trong trình hình thành hạt Fe3O4 từ nhiệt độ phịng nâng lên 80oC 30 phút sau tiếp tục SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 33 GVHD : TS.Đặng Đức Long khuấy nâng nhiệt lên 95oC 90 phút Khi nhiệt độ cao với khuấy trộn phân tử ln chuyển động nhanh khó kết tụ với nên kích thước hạt tạo thành nhỏ Sau bao phủ thêm lớp CA bên ngồi qua hình ảnh chụp cho thấy kích thước hạt tương đương với kích thước hạt có nồng độ ion sắt (II) 0,05 dễ nhìn chúng khơng kết dính lại mẫu khơng có bọc CA (hình 3.8) Kích thước hạt tạo thành không đồng đều, nằm khoảng 2030nm Đối với phương pháp đồng kết tủa để điều chỉnh kích thước hạt đồng điều khó khăn, nhược điểm phương pháp Hình 3.9: Hình ảnh bề mặt hạt nano sắt từ khơng bọc CA chụp qua kính hiển vi điện tử quét (SEM) 3.1.2 Kiểm tra tính từ hạt nano sắt từ Kiểm tra khả từ tính sản phẩm sắt từ tạo thành cách đặt chúng vào mơi trường có từ tính nam châm tạo Và cho thấy chúng phân bố theo đường cong từ trường (hình 3.10 ) Điều cho thấy hạt nano oxit sắt mà chúng tơi tổng hợp có từ tính SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 34 GVHD : TS.Đặng Đức Long Hình 3.10 : Tính từ hạt Fe3O4 Ở chúng tơi dừng lại phép thử từ tính hạt nano nam châm điều kiện cịn khó khăn Nếu nên đo tính chất từ hạt từ kế mẫu rung để thấy rõ tính siêu thuận từ, đặc điểm quan trọng dùng vật liệu cho ứng dụng y sinh học 3.2 Chức hóa bề mặt hạt nano sắt từ Để hấp thụ DNA lên hạt nano cần phải chức hóa bề mặt Hạt oxit sắt từ phân tán nước chúng có bao phủ lớp –OH, nhóm chức quan trọng việc tạo liên kết với chất hoạt hóa bề mặt cần thiết cho ứng dụng sinh học Để có nhóm chức bề mặt hạt nano, sử dụng nguyên tắc thủy phân organosilane để tạo lớp polymer bề mặt hạt nano Organosilane phân tử có hai nhóm chức có cơng thức tổng qt : X-(CH2)n –SiRn (OR‘)3-n Trong : - X nhóm chức cần thiết để tiếp hợp với đối tượng sinh học SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 35 GVHD : TS.Đặng Đức Long - (CH2)n lớp đệm hữu cơ, phụ thuộc vào n mà lớp đệm dày hay mỏng - SiRn nhóm liên kết với nhóm chức hydroxyl bề mặt hạt nano Alkoxysilane với nhiều nhóm chức X khác thương mại hóa Nhóm amino sử dụng nghiều ứng dụng sinh học [29] N N N SiO2 Fe3O N N N N N Hình 3.11 : Nguyên lí chức hóa bề mặt hạt nanơ từ tính có cấu trúc vỏ/lõi Lõi hạt xít sắt, vỏ lớp silica, nhóm chức bên ngồi amino Chúng tơi sử dụng ATPS để tạo nhóm chức bề mặt hạt nano sắt từ Trong q trình chức hóa bề mặt, xảy hai phản ứng đồng thời q trình thủy phân nhóm silane thành nhóm silanol hoạt tính q trình hóa rắn silanol với nhóm -OH tự bề mặt hạt nano để tạo liên kết Si-O-Si bền vững (hình 3.11) Sự liên kết tạo thành lớp vỏ silica bao quanh, đồng thời thủy phân tạo nhóm amino bề mặt hạt Fe 3O4 Chính nhóm amino gắn kết với DNA SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 36 GVHD : TS.Đặng Đức Long Hình 3.12 : Hạt Fe3O4 sau chức hóa bề mặt 3.3 Kết đo độ tinh DNA Mẫu DNA xem protein tỷ số A260/A280 nằm khoảng từ 1,8 đến Nếu tỷ số nhỏ 1,8 mẫu DNA cịn lẫn protein Sau tách chiết DNA từ vi khuẩn B subtillis tiến hành đo độ hấp thụ quang hai bước sóng 260 nm 280nm mẫu DNA hai phương pháp Kết đo bảng 3.1 Qua bảng kết 3.1 cho thấy mẫu số phương pháp tách DNA hạt amino-NP có độ tinh protein 1,8 1,82, kết cho thấy hai mẫu protein Mẫu số có tỷ số 1,76; mẫu cịn lại tỷ số thấp nên mẫu cịn lẫn protein cao Tuy có 2/6 mẫu có độ tinh protein đạt yêu cầu điều chứng tỏ hạt amino-NP tách DNA Kết thu khơng đồng ảnh hưởng trình thao tác tách rửa Tris HCl pH nam châm chưa đảm bảo nên kéo theo protein Mặt khác, bước rửa hỗn hợp hạt SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 37 GVHD : TS.Đặng Đức Long DNA (bước 6) sử dụng kết hợp rửa 3-[2-(2-aminoethyl)-ethylamino]propyltrimethoxysilane (AEEA) với Tris HCl pH sau tách DNA khởi hạt sắt từ cho độ tinh protein cao (tỷ lệ A260/A280 1,9) [7] Bảng 3.1: Kết đo độ tinh mẫu DNA A260/A280 0,292 0,163 1,79 0,301 0,151 1,99 0,332 0,184 1,80 0,421 0,239 1,76 0,314 0,173 1,82 0,149 0,113 1,31 0,218 0,210 1,04 hạt A280 pháp thông Mẫu DNA tách thường A260 phương TTM Mẫu DNA tách 0,209 0,187 1,12 3.4 Kết điện di DNA tách chiết sản phẩm PCR từ B.subtilis Để kiểm tra mẫu DNA tách chiết sản phẩm PCR từ mẫu DNA tách hạt amino-NP, từ bảng kết 3.1 lấy mẫu DNA số có độ tinh protein 1,82 tiến hành điện di, mẫu DNA tách phương pháp thông thường, sản phẩm PCR với thang DNA Các mẫu DNA nạp vào giếng nằm phía cực âm buồng điện di, cuối gel Dưới tác dụng điện trường, DNA di chuyển phía cực dương Khi nhuộm DNA chạy gel agarose EtBr, chất gắn xen vào bazơ DNA phát huỳnh quang tác dụng tia tử ngoại Như dễ dàng cho phép phát vị trí DNA gel Kết điện di gel agarose hình 3.13 cho thấy băng điện di thu có dạng vệt dài (smear) rõ nét gel Hiện tượng xuất mẫu điện di chứa nhiều DNA chứa DNA có trọng lượng phân tử lớn Khi đó, gel agarose cản trở chuyển động DNA, làm cho DNA SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 38 GVHD : TS.Đặng Đức Long di chuyển khó khăn băng DNA có dạng vệt dài gel, đậm dần từ xuống Trên hình 3.13 ta thấy DNA tách hạt amino-NP giếng thứ hình ảnh DNA nhìn thấy rõ, tương đương với mẫu DNA tách phương pháp thông thường giếng thứ 4 Hình 3.13 : Kết điện di DNA B.subtilis Giếng sản phẩm PCR; Giếng thang DNA, Giếng mẫu DNA tách hạt amoni-NP; Giếng mẫu DNA tách phương pháp thơng thường Sau có DNA tiến hành phản ứng PCR nhằm để kiểm tra xem DNA có đảm bảo khơng để ứng dụng cho nghiên cứu sau Kết sản phẩm PCR gel cho thấy có kích thước đoạn gen khuếch đại 680 bp, với trình tự mồi thiết kế Qua hình điện di cho thấy tách chiết DNA tổng số hạt nano sắt từ mang lại kết khả quan, không khác nhiều so với phương pháp tách chiết DNA thơng thường Mặt khác cịn có ưu điểm tốn hóa SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 39 GVHD : TS.Đặng Đức Long chất phenol, chloroform nên giảm bớt kinh phí giảm khó khăn thao tác hóa chất độc hại 3.5 Giải thích hấp thụ DNA lên hạt nano sắt từ Sau hạt sắt từ hoạt hóa, thủy phân ATPS nên bề mặt chúng có nhóm amino (NH3+) Chính nhóm amino tạo nên bề mặt điện tích dương Trong đó, tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, phân tử DNA tồn trộn lẫn với vật thể sinh học khác xác tế bào, protein,…và DNA có khung phot phat nên mang điện tích âm Các hạt sắt từ với kích thước nhỏ bé ưu việt nên len lõi bám vào phân tử DNA mang điện tích trái dấu (hình 3.14) Sự hấp thụ DNA hạt sắt từ liên kết ion mang điện tích trái dấu DNA amoni -NP Hình 3.14 : Sơ đồ mô tả hấp thụ DNA lên hạt nano sắt từ [20] Trên sở hấp thụ gắn DNA lên hạt sắt từ để tạo nên đầu dò phản ứng lai Để tiến hành tạo đầu dị phải tạo liên kết bền vững cần cần gắn DNA liên kết hóa trị lên hạt nano sắt từ Do cần có thêm loại hóa chất để hoạt hóa đầu 5’ DNA đồng thời làm chất xúc tác 1- ethyl-3 (3-dimethylaminopropy) carbodiimide (EDC) Tuy nhiên SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 40 GVHD : TS.Đặng Đức Long chưa có loại hóa chất (EDC) nên chúng tơi dừng lại thí nghiệm dùng hạt nano sắt từ tổng hợp để tách DNA tổng số từ tế bào vi khuẩn B.subtilis cho kết thích hợp Đây hướng nghiên cứu tiếp cho đề tài Hình 3.15: Hạt nano sắt từ hỗn hợp chứa DNA SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 41 GVHD : TS.Đặng Đức Long CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua tháng nghiên cứu thực đề tài “Nghiên cứu chế tạo sử dụng hạt nano sắt từ để gắn kết với DNA” Phịng Thí nghiệm Bộ mơn, chúng tơi thu kết sau : SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 42 GVHD : TS.Đặng Đức Long - Đã tổng hợp hạt nano sắt từ có kích thước 20nm đến 30nm phương pháp đồng kết tủa FeCl2.4H2O, FeCl3.6H2O NH4OH 25% Đồng thời có thêm gia nhiệt để tạo hạt nano có kích thước nhỏ bổ sung CA để giúp hạt phân tán dung môi tốt - Tính từ hạt nano sắt từ tổng hợp xác định nam châm - Chức hóa bề mặt hạt nano sắt từ tổng hợp ATPS tạo nhóm amino bề mặt hạt để dễ dàng gắn kết với phân tử DNA - Sử dụng hạt nano sắt từ tổng hợp để tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩn B.subtillis có độ tinh protein (A260/A280) chấp nhận 1,8; 1,82 - Việc tách lọc DNA từ hạt nano sắt từ tiến hành từ trường nam châm nên thao tác dễ dàng hơn, đỡ tốn hóa chất thiết bị li tâm 4.2 Kiến nghị Vì thời gian điều kiện phịng thí nghiệm cịn hạn chế nên đề tài vấn đề tồn sau : - Cần tiến hành xác định tính siêu thuận từ hạt nano sắt từ từ kế mẫu rung để ứng dụng vào nghiên cứu sinh học phân tử - Nghiên cứu tối ưu hóa thời gian giai đoạn hấp thụ DNA lên hạt nano sắt từ - Nghiên cứu cố định đoạn phân tử DNA lên hạt nano sắt từ để tạo đầu dò phương pháp lai DNA để thấy rõ ưu việt hạt nano sắt từ ứng dụng sinh học phân tử TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 43 GVHD : TS.Đặng Đức Long Nguyễn Hữu Đức, Trần Mậu Danh, Trần Thị Dung Chế tạo nghiên cứu tính chất từ hạt nano Fe3O4 ứng dụng y sinh học Tạp chí Khoa học Đại học quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ 23.2007 Nguyễn Hồng Hải, Cấn Văn Thạch, Nguyễn Hoàng Lương, Nguyễn Châu, Khuất Thị Thu Nga, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa Sử dụng hạt nano từ tính mang thuốc để tăng cường khả ức chế vi khuẩn thuốc kháng sinh Chloramphenicol Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 2008 Nguyễn Hoàng Hải, Khoa Vật lý Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Chế tạo hạt nano oxit sắt từ tính 2007 TS Trịnh Đình Đạt, Cơng nghệ sinh học- tập 4, Cơng nghệ Di truyền, 2006 NXB Giáo dục Ngô Thái Bích Vân, Bài giảng thí nghiệm Cơ sở di truyền Cơng nghệ gen 2011 Khoa Hóa Trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng PGS TS Trần Thị Xô, ThS Nguyễn Thị Lan Cơ sở di truyền công nghệ gene.2005 NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Brandon Yoza, Mitsufumi Matsumoto, Tadashi matsunaga DNA extraction using modified bacterial magnetic particles in the presence of amino silane compound Department of Biotechnology, Tokyo University of Agriculture and Technology, 2-24-16, koganei Tokyo 184-8588, Japan 2001 Cao X, Koltypin Y, Katabi G, Prozorov R, Felner I and Gedanken A 1997 J Mater Res 12 402 L H Hoang, N T Hien, N H Hai, N T Khoi, I S Yang, Journal of Raman Spectroscopy 40 (2009) 1525 10 M.A.Tuan, N.H.Hai, Journal of Physics : Conference Series 187 (2009) 012059 11 Meldrum F C, Heywood B R and Mann S 1992 Science 257 522 SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 44 GVHD : TS.Đặng Đức Long 12 N H Hai, N H Luong, N N Long, N Chau, N D Phu, S Theerdhala, A Gedanken, Proc Natl Conf Solid State Phys V, Vungtau, Vietnam (2007), 140 (Vietnamese) 13 N H Luong, N N long, L V Vu, N H Hai, T N Phan, V A T Nguyen, International Journal of nanotechnology (2010) accepted 14 N D Phu, P C Phong, N.Chau, N H.Luong, L H Hoang, N H Hai, Jourmal of Experimental Nanoscience (2009) 253 15 N.H.Hai, C.V.Thach, N.T.Ha, N.Chau, V.A.T.Nguyen, T.N Phan, Internatinal Conference on Engineering Physics, Hanoi (2006) p 95 16 N.H.Hai, N.Chau, N.H.Luong, V A T Nguyen, T.N Phan, Journal of the Korean Physical Society 53 (2008) 1601 17 Ronald M Atlas.2004, Handbook of microbiogical media third edition, USA 18 Rosensweig, R.E., Ferrohydrodynamics 1985, Cambridge : Cambridge University Press 19 R Vijayakumar, Y Koltypin, I Felner, A Gedanken, Sonochemical synthesis and characterization of pure nanometer-sized Fe3O4 particles, Mater Sci Engineer A 286 (2000) 101-105 20 T.Q.Tuan, N.H.Luong, N.H.Hai, Journal of Hazadous Materials (2011) tobe published 21 V.A.T.Nguyen, T.N Phan, T Q Tuan, N.H.Hai, N.N Long, N.H.Luong, (2011) to be published 22 Yudhisthira Sahoo, Alireza Goodarzi, Mark T.Swihart, Tymish Y Ohulchanskyy, Navjot Kaur, Edward P Furlani, and Paras n Prasad Aqueous Ferrofluid of Magnetite Nanoparticles : Fluoresence Labeling and magnetophoretic Control Department of Chemistry, Department of Chemical and Biological Engineering, Institute for Lasers, Photonics and biophotonics, University at Buffalo (SUNY), Buffalo, New York 14260 2004 SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT Đồ án tốt nghiệp 45 GVHD : TS.Đặng Đức Long 23 Takaaki Kojima, Yoshiaki Takei, Miharu Ohtsuka, Yasuaki Kawarasaki, Tsuneo Yamane and Hideo Nakano PCR amplification from single DNA molecules on magnetic beads in emulsion : application for high-throughput screening of transcription factor targets Laboratory of Molecular Biotechnology, Graduate School of Biogricultural Sciences, Nagoya University, Furo-cho, Chikusa-ku, Nagoya 464-8601, Japan 2005 24 Wong K K W, Douglas T, Gider S, Awschalom D D and Mann S 1998 Chem Mater 10 279 Tài liệu Internet 25 http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/DNA_l%C3%A0_g%C3%AC%3F 26 http://daihocsuphamkythuat-thuduc.com/Genetically_modified_plant.html 27 http://olympiavn.org/forum/index.php?topic=77.0 28.http://www.google.com.vn/search?hl=vi&q=DNA%20extraction%20using %20modified%20bacterial%20magnetic%20particles%20in%20the%20presence %20of%20amino%20silane%20compound&bav=on.2,or.r_gc.r_pw 29 http://user.hus.edu.vn/nguyenhoanghai/physical-science 30 http://giaoan.violet.vn/present/show/entry_id/2135513 SVTH : Võ Thị Ái Lớp : 10SHLT ... từ hạt nano sắt từ tổng hợp xác định nam châm - Chức hóa bề mặt hạt nano sắt từ tổng hợp ATPS tạo nhóm amino bề mặt hạt để dễ dàng gắn kết với phân tử DNA - Sử dụng hạt nano sắt từ tổng hợp để. .. Đức Long CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua tháng nghiên cứu thực đề tài ? ?Nghiên cứu chế tạo sử dụng hạt nano sắt từ để gắn kết với DNA? ?? Phịng Thí nghiệm Bộ mơn, thu kết sau : SVTH... giai đoạn hấp thụ DNA lên hạt nano sắt từ - Nghiên cứu cố định đoạn phân tử DNA lên hạt nano sắt từ để tạo đầu dò phương pháp lai DNA để thấy rõ ưu việt hạt nano sắt từ ứng dụng sinh học phân