1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chì xâm nhập vào thể gây nhiều tổn thương đa dạng phức tạp hầu hết quan, tổ chức Cơ chế gây bệnh chì cho ức chế liên kết đặc hiệu với enzym, chất sinh học có chứa nhóm -SH chưa giải thích thỏa đáng tổn thương mang tính chất tồn thân chì gây Một số nghiên cứu cho rằng, chì vào thể có khả kích thích tạo gốc tự làm giảm chức hệ thống chống gốc tự Làm rõ vấn đề này, cần đánh giá thay đổi enzym chống oxy hóa thể Sâm Ngọc Linh sinh khối (SNLSK) cho có khả chống oxy hóa, bảo vệ thể chống lại stress oxy hóa Việc ứng dụng đánh giá hiệu bảo vệ SNLSK đối tượng tiếp xúc với chì vấn đề thực tế chưa nghiên cứu Xuất phát từ thực tế chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biến đổi số số chống oxy hóa người tiếp xúc nghề nghiệp với chì vơ cơ, tác dụng bảo vệ sâm Ngọc Linh động vật thực nghiệm” Mục tiêu: - Xác định thay đổi số thông số chống oxy hóa hóa sinh máu người tiếp xúc nghề nghiệp với chì vơ động vật thực nghiệm - Đánh giá tác dụng bảo vệ sâm Ngọc Linh sinh khối động vật gây nhiễm độc bán trường diễn với chì acetat Tính cấp thiết: Chì ngun liệu khơng thể thay nhiều ngành công nghiệp, số lượng người tiếp xúc với chì khơng khơng giảm mà cịn có xu hướng tăng lên chì có nhiều tác hại với sức khỏe người Khi chì xâm nhập vào thể chì gây nhiễm độc nghề nghiệp stress oxy hóa Trong nhiễm độc chì, sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu hiệu mang lại chưa mong muốn nhiễm độc mạn tính SNLSK chế phẩm có tác dụng chống oxy hóa bảo vệ thể, làm giảm tác hại chì gây với thể Xuất phát từ thực tế chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài Những đóng góp luận án: Chì có tác hại thể gây stress oxy hóa dẫn đến làm biến đổi số chống oxy hóa Luận án nghiên cứu tồn diện số chống oxy hóa cơng nhân tiếp xúc nghề nghiệp với chì vơ động vật thực nghiệm Đánh giá tác dụng bảo vệ SNLSK động vật thực nghiệm bị gây độc bán trường diễn với chì acetat Kết nghiên cứu giúp cho nhà máy, xí nghiệp có sử dụng chì sản xuất tăng cường biện pháp bảo vệ sức khỏe người lao động đồng thời nghiên cứu thêm để lựa chọn SNLSK bảo vệ cho công nhân tiếp xúc nghề nghiệp với chì Bố cục luận án: Luận án trình bày 135 trang bao gồm: đặt vấn đề trang, tổng quan 38 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 20 trang, kết nghiên cứu 41 trang, bàn luận 31 trang, kết luận trang, kiến nghị trang Luận án có 37 bảng, 21 biểu đồ, sơ đồ, gồm 161 tài liệu tham khảo có 27 tài liệu tiếng Việt 134 tài liệu tiếng Anh CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Gốc tự hệ thống chống gốc tự thể 1.1.1 Khái niệm gốc tự dạng oxy hoạt động Gốc tự nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử mà lớp chứa điện tử không ghép cặp (điện tử đơn độc) Gốc tự thường bất ổn lượng động học có khuynh hướng đạt tới ổn định, thời gian tồn ngắn, hoạt tính mạnh Các dạng oxy hoạt động (reactive oxygen species - ROS) gốc tự do, ion hoạt động, phân tử có chứa nguyên tử oxy, có khả sinh gốc tự hoạt hóa gốc tự 3 1.1.2 Stress oxy hóa Stress oxy cân trình tạo thành dạng oxy hoạt động với hệ thống chống oxy hóa Stress oxy hóa kết suy giảm hệ thống chống oxy hóa, tăng tạo thành dạng oxy hoạt động thiếu khả sửa chữa tổn thương trình oxy hóa thể 1.1.3 Q trình hình thành gốc tự Các gốc tự thể tạo từ: chuỗi hô hấp tế bào, tác nhân phóng xạ, hội chứng viêm, tượng thiếu máu cục - tưới máu lại, tác nhân xenobiotic số tác nhân khác Các chất xenobiotic có chì xâm nhập vào thể bị chuyển hóa cấu trúc xenobiotic bị biến đổi rõ rệt, chúng gắn thêm nhóm -OH, -NH2, -SH, -COOH tạo thành chất dễ tan nước tiếp tục liên hợp với chất, đào thải khỏi thể; • đồng thời tạo dạng ROS O , 1O2 có độc tính cao gây tình trạng stress oxy hóa Các chất chống oxy hóa thể như: SOD, catalase, protein có nhóm SH, ceruloplasmin hồng cầu gan nhạy cảm với xenobiotic 1.1.4 Hệ thống chống oxy hóa thể 1.1.4.1 Hệ thống chống oxy hóa có chất enzym - Superoxid dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) enzym chống oxy hóa có chứa kim loại thuộc loại oxidoreductase, xúc tác cho phản ứng chuyển hóa superoxid thành O2 H2O2: O• + 2H+ SOD  → H2O2 + O2 SOD có hoạt tính cao O2• có hoạt tính nhỏ, SOD chất chống oxy hóa bản, làm hạ thấp nồng độ tiền chất • O , mà từ sản sinh tất dạng oxy hoạt động khác - Catalase (CAT, EC 1.15.1.1) enzym xúc tác phản ứng phân hủy H2O2: H2O2 Catalase →   H2O + ½ O2 - Peroxidase (EC 1.11.1.7) nhóm enzym xúc tác phản ứng oxy hóa khử, thuộc lớp oxidoreductase, xúc tác cho phản ứng sau peroxidase AH2 + H2O2 A + 2H2O → - Glutathion peroxidase (GPx) (E C.1.11.1.9) enzym xúc tác cho phản ứng loại bỏ loại peroxid, hoạt động mô hồng cầu nồng độ H2O2 thấp GPx ROOH + 2GSH GSSG + ROH + H 2O 1.1.4.2 Hệ thống chống oxy hóa có chất khơng enzym Gồm ba nhóm chính: nhóm polyphenol, phối tử sắt đồng, thiol Các nhóm tồn tế bào Hệ thống hỗ trợ hệ thống chất chống oxy hóa có chất enzym - Trạng thái chống oxy hóa tồn phần (total antioxidant status: TAS) trạng thái chống oxy hóa tồn phần huyết tương dựa khả ức chế chống lại chất oxy hóa chất chống oxy hóa, bao gồm tất chất chống oxy hóa có thể, gồm nhiều hệ thống bảo vệ nhằm chống lại ảnh hưởng có hại gốc tự tượng peroxid thể 1.2 Cơ chế tác dụng, khả sinh gốc tự do, ức chế hệ thống chống oxy hóa chì vơ 1.2.1 Cơ chế tác dụng chung Chì vào thể ức chế liên kết chọn lọc hệ thống enzym, phân tử sinh học có nhóm -SH gây nhiều rối loạn sinh hóa quan trọng tế bào 1.2.2 Cơ chế sinh gốc tự do, ức chế hệ thống chống oxy hóa chì vơ Chì vơ gây stress oxy hóa chế đối lập liên quan chặt chẽ đến nhau: kích thích tạo gốc tự giảm khả chống oxy hóa thể - Kích thích tạo gốc tự do: Gốc tự tạo thành từ nguồn (1) trình enol hóa oxy hóa acid aminolevulinic (ALA), (2) q trình tự oxy hóa oxyhemoglobin, (3) tăng cường hoạt tính enzym oxy hóa, (4) oxy hóa nitric oxid gốc tự - Ức chế hệ thống chống oxy hóa: Chì gắn kết với nhóm -SH làm giảm mức GSH, GR, hoạt tính G6PD, GSH tỉ lệ GSH/GSSH Chì làm giảm hấp thu yếu tố vi lượng selen, Cu, Zn, làm giảm hoạt tính enzym chống oxy hóa GPx, SOD, CAT tăng tính phản ứng màng tế bào với công oxy hóa 1.3 Tác dụng chống oxy hóa Sâm Ngọc Linh sinh khối 1.3.1 Thành phần hóa học SNLSK có thành phần hóa học chủ yếu saponin, hàm lượng saponin tồn phần đạt 2,01% Trong đó, hàm lượng ginsennosid Rg1, Rb1, Rd Rg1 = 0,31%; Rb1 = 0,36%; Rd = 0,15% 1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa Saponin tồn phần hoạt chất MR-2 SNL có tác dụng chống oxy hóa Dịch chiết sâm có khả ức chế tạo thành gốc OH• từ phản ứng Fenton chế tạo phức với ion kim loại, đồng thời trực tiếp thu dọn gốc OH•, có tác dụng chống oxy hóa mơi trường dầu nước, có khả tham gia vào tất giai đoạn trình POL Một số tác giả cho rằng, tác dụng chống oxy hóa SNL thành phần khống có sâm CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nghiên cứu môi trường lao động Nghiên cứu đặc điểm vi khí hậu nồng độ chì khơng khí MTLĐ 6 2.1.2 Nghiên cứu người - Đối tượng: 165 công nhân làm việc phân xưởng sản xuất thuốc gợi nổ (nhà máy Zx); phân xưởng lắp ắc quy, phân xưởng cực (công ty cổ phần pin ắc quy Vĩnh Phú) trực tiếp tiếp xúc với chì, chia làm nhóm: + Nhóm I (55 cơng nhân) nhóm có nồng độ chì máu ≤ 10 µg/dL + Nhóm II (110 cơng nhân) nhóm có nồng độ chì máu > 10 µg/dL + Nhóm II chia làm nhóm: Nhóm IIA (86 cơng nhân): nồng độ chì máu từ 10 µg/dL đến < 40 µg/dL nhóm IIB (24 cơng nhân): nồng độ chì máu ≥ 40 µg/dL - Tiêu chuẩn chọn: + Có thời gian làm việc mơi trường trực tiếp tiếp xúc với chì ≥ năm, thời gian tiếp xúc liên tục Không tiếp xúc với yếu tố độc hại khác Tự nguyện tham gia nghiên cứu + Tiêu chuẩn loại trừ: đợt cấp bệnh mạn tính, bệnh ác tính, đái tháo đường, tăng huyết áp, bệnh thận tiết niệu, viêm gan cấp mạn, suy gan, bệnh tự miễn dịch - Chọn tồn cơng nhân nằm tiêu chuẩn chọn không nằm tiêu chuẩn loại trừ vào nghiên cứu 2.1.3 Nghiên cứu động vật * Động vật thực nghiệm: 360 chuột nhắt trắng đực, trọng lượng: 20 - 25 gam, chia thành lô - Lô đối chứng (108 chuột) (lô 1) - Lô bị gây nhiễm độc chì acetat (108 chuột) (lơ 2) - Lơ bị gây độc chì acetat uống SNLSK để bảo vệ (108 chuột) (lô 3) - 36 chuột bị giết lấy máu xét nghiệm thời điểm trước tiến hành xét nghiệm 7 * Vật liệu nghiên cứu Dung dịch chì acetat Phòng Trang bị kỹ thuật - Học viện Quân y cung cấp (được sản xuất công ty: Lucheng Qinda plastic injection Factory - Trung Quốc) SNLSK Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Y dược học Quân - Học viện Quân y sản xuất cung cấp Dụng cụ nghiên cứu đầy đủ đảm bảo cho thí nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu mơi trường lao động: Khảo sát vi khí hậu nồng độ bụi chì MTLĐ 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu người lao động - Thiết kế nghiên cứu: mô tả, cắt ngang - Chỉ tiêu kỹ thuật nghiên cứu + Xét nghiệm nồng độ chì máu + Xét nghiệm công thức máu ngoại vi + Xét nghiệm số hóa sinh máu + Xác định hàm lượng nhóm -SH tự máu, hoạt độ peroxidase huyết tương, hoạt độ superoxide dismutase (SOD) hồng cầu, glutathion peroxidase (GPx) hồng cầu, hàm lượng malondialdehyde (MDA) huyết tương, trạng thái chống oxy hóa tồn phần (TAS) huyết tương 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu động vật Thiết kế nghiên cứu: thực nghiệm, có can thiệp * Pha chì acetat cao đặc SNLSK: Pha 2,592g (2.592mg) chì acetat 1,296L (1.296mL) nước cất, thu dung dịch chì acetat Pha 24,30g (24.300mg) cao đặc SNLSK 0,324L (324mL) nước cất, thu dung dịch cao đặc SNLSK * Phương pháp gây độc: Phương pháp gây độc bán trường diễn theo mơ hình gây độc El-Sayed I H, Lotfy M cs (2006); Flora G, Gupta D cs (2013) 8 - Lô (n = 108): cho chuột uống 0,2mL nước cất vào buổi sáng ngày tuần, thời gian uống liên tục 15 ngày, 30 ngày, 45 ngày - Lô (n = 108): cho chuột uống 0,2mL dung dịch chì acetat (20 mg/kg/ngày) vào buổi sáng ngày tuần, thời gian uống liên tục 15 ngày, 30 ngày, 45 ngày - Lô (n = 108): cho chuột uống 0,1ml dung dịch SNLSK (375 mg/kg/ngày) vào buổi sáng ngày tuần Một sau uống SNLSK, chuột cho uống 0,2mL dung dịch chì acetat (20 mg/kg/ngày), thời gian uống liên tục 15 ngày, 30 ngày, 45 ngày * Phương pháp lấy máu xét nghiệm: Chuột bị giết thời điểm nghiên cứu máu lấy bên hốc mắt * Ở thời điểm trước tiến hành thực nghiệm: (36 chuột) - 12 chuột chọn ngẫu nhiên, lấy máu chia làm phần: xét nghiệm cơng thức máu nồng độ chì máu - 12 chuột chọn ngẫu nhiên số lại, lấy máu chia làm phần: xét nghiệm hoạt độ SOD, GPx hồng cầu nồng độ TAS, hoạt độ peroxidase, nồng độ MDA, -SH huyết tương - 12 chuột lại, lấy máu để xét nghiệm số hóa sinh * Ở thời điểm sau tiến hành thực nghiệm: (324 chuột) - Tại thời điểm 15 ngày, 30 ngày, 45 ngày sau tiến hành thực nghiệm, thời điểm 108 chuột (mỗi lô: 36 chuột) chọn ngẫu nhiên, bị giết lấy máu xét nghiệm * Các tiêu kỹ thuật nghiên cứu: người 2.3 Xử lý số liệu Số liệu xử lý phương pháp thống kê y học, sử dụng phần mềm EpiInfo 2005 (Version 3.3.2), EpiCalc 2000 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu Đảm bảo y đức nghiên cứu 9 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết nghiên cứu người 3.1.1 Nồng độ chì máu trung bình nhóm đối tượng nghiên cứu Bảng 3.3 Nồng độ chì máu nhóm nghiên cứu Nhóm Nồng độ chì máu (µg/dL) Nhóm I (n=55) Nhóm II (n=110) 4,26±2,28 36,54±18,36 Nhóm II Nhóm IIA Nhóm IIB (n=86) (n=24) ( X ±SD) ( X ±SD) 23,82±7,54 57,66±9,73 Nồng độ chì máu nhóm II, IIB có độ dao động lớn 3.1.2 Kết xét nghiệm SOD, GPx, peroxidase, -SH, MDA, TAS nhóm nghiên cứu Bảng 3.8 Sự biến đổi số số chống oxy hóa nhóm I II Nhóm Nhóm I (n=55) Nhóm II Chỉ tiêu ( X ±SD) (n=110)( X ±SD) SOD (U/g Hb) 1212,87±180,70 1578,26±180,65 GPx (U/g Hb) 64,46±8,57 54,29±7,82 Peroxidase (µg/mg) 0,019±0,006 0,021±0,008 - SH (mmol/mg) 0,685±0,092 0,461±0,120 MDA (µmol/L) 3,19±0,42 4,01±0,49 TAS (mmol/L) 1,58±0,22 1,42±0,21 p p