NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN (PROTOPLAST) Tạ Ngọc Ly Chương 5 CẢI TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG NCMTBTV www.themegallery.com  Protoplast là gì?  Đặc điểm của protoplast  Mục đích nghiên cứu protoplast? www.themegallery.com Phương pháp tách Protoplast  Nguyên liệu:  2 phương thức phân lập protoplast - Cơ học (không dùng các enzyme). - Sử dụng enzyme : +tuần tự (qua hai bước). +Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời). * Kỹ thuật từng bước của Hanaka www.themegallery.com Phương pháp cơ học www.themegallery.com Phương pháp cơ bản tách protoplast bằng enzyme  Khử trùng mẫu lá  Ngâm trong dung dịch thẩm thấu  Tách lớp mặt dưới lá  Ngâm trong hỗn hợp enzyme  Tinh sạch tế bào trần  Nuôi trong môi trường thích hợp www.themegallery.com Hỗn hợp enzyme  Pectinase phân hủy pectin.  Macease  Macerozyme R-10  Pectolyase Y-23  Pectinase (Sigma)  Cellulase phân hủy cellulose  Cellulase Onozuka (R-10, RS)  Cellulysin  Meicelase (CESB, CMB)  Driselase  Hemicellulase phân hủy hemicellulose.  Rhyzyme HP-150  Hemicellulase (Sigma) Phối hợp các enzym phân hủy màng tế bào đã được thực hiện trên một số cây trồng  Hemerocallis Cellulysin (1%) + Rhozyme (1%) + Macease (0,5%) (Huyền phù tế bào)  Pisum sativum Onozuka R-10 (2%) + Driselase (2%) + Rhozyme (2%) + Pectinase (1%) (Tế bào thịt lá)  Solanum sp. Onozuka R-10 (1%) + Macerozyme R-10 (0,02%) + Pectolyase Y-23 (0,013%) (Tế bào thịt lá)  Medicago sativa Meicelase (4%) + Rhozyme (2%) + Macerozyme R-10 (0,03%) (Rễ, lá mầm) www.themegallery.com www.themegallery.com Thành phần dịch enzyme (trên lít) gồm có: - Các enzyme (pectinase, cellulase, hemicellulase) từ 0,1-2% - Sorbitol (0,15 M) 27,3 g’ - Mannitol (0,15 M) 27,3 g - Glucose (0,1 M) 18 g - CaCl 2 .2H 2 O (6 mM) 441 mg - KH 2 PO 4 (0,7 mM) 95 mg - Đệm MES: 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (3 mM) 650 mg - Điều chỉnh pH 5,6 và khử trùng dung dịch enzyme bằng màng lọc Millipore. Tinh sạch protoplast www.themegallery.com Xác định chất lượng của protoplast  Phát hiện thành tế bào: calcoflour  Xác định khả năng sống sót của protoplast + quan sát trực tiếp + FDA( Fluorescein diacetate) + nhuộm xanh Evan www.themegallery.com [...]... trùng) và để trong 10 phút -Tế bào trần được dung hợp bằng cách pha loãng PEG mỗi 5 phút bằng cách thêm môi trường nuôi cấy tế bào trần - Hỗn hợp được ly tâm ở 100 g trong 10 phút rồi tế bào trần được rửa trong môi trường nuôi cấy không PEG, ly tâm - Huyền phù tế bào trần được sắp lớp trên môi trường agarose www.themegallery.com Dung hợp giữa protoplast của huyền phù tế bào nuôi cấy với protoplast từ lá... quanh chuỗi ngọc Sau đó là sự dung hợp bào chất  - Huyền phù tế bào trần được dàn mỏng như trước www.themegallery.com Dung hợp protoplast bằng polyethylen glycol (PEG) - cho 4 ml huyền phù tế bào trần với độ đặc tế bào xấp xỉ 2.105 trong môi trường vô cơ dùng để phân lập tế bào trần, có 13% mannitol được trộn rồi ly tâm ở 100 g trong 10 phút để còn lại tế bào trần trong khoảng 0,5 ml môi trường - Màng... www.themegallery.com Điều kiện nuôi cấy  - Hệ thống nuôi cấy: nuôi cấy trên môi trường lỏng nuôi cấy trên môi trường bán rắn Nuôi cấy trong giá thể cố định (alginate, đĩa petri)  Điện trường kích thích sự phát triển của protoplast  Bổ sung kháng sinh, chất bề mặt và polyamine www.themegallery.com Nuôi cấy tái sinh cây bằng protoplast từ lá cây www.themegallery.com Nuôi cấy tái sinh cây bằng protoplast... với protoplast từ lá dưới tác dụng của PEG www.themegallery.com Cơ sở tế bào học của dung hợp  Dung hợp tế bào trần bao gồm 3 pha: - Pha kết dính: Màng sinh chất của 2 hay nhiều tế bào trần tiến sát nhau - Pha dung hợp: Dung hợp màng tại những vùng nhỏ liên kết chặt dẫn đến hình thành tế bào chất liên tục hoặc cầu giữa các tế bào trần - Pha giãn nở:Giãn nở của các cầu nguyên sinh chất và hình thành... thấu - Các chất phân li  Mật độ dàn trải protoplast - 1×104 đến 1×105 tế bào/ mL www.themegallery.com Kỹ thuật nuôi cấy protoplast  Kỹ thuật tầng nuôi dưỡng  Đồng nuôi cấy các protoplast  Nuôi cấy vi giọt www.themegallery.com Tái sinh cây từ protoplast  Tạo vách tế bào  Tăng trưởng và phân chia tế bào  Phát triển callus/cây hoàn chỉnh www.themegallery.com Sử dụng chất... nguyên sinh chất Tách lớp mặt dưới lá Ngâm mẫu trong hỗn hợp enzym Tinh sạch protoplast Nuôi cấy protoplast trong môi trường thích hợp www.themegallery.com Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển protoplast  Môi trường nuôi cấy  Điều kiện nuôi cấy  Mật độ nuôi cấy www.themegallery.com Môi trường nuôi cấy protoplast - Thành phần dinh dưỡng - MS hoặc B5 có cải tiến ( giảm Fe, Zn, NH4+,... bằng điện www.themegallery.com  - Huyền phù tế bao trần để dung hợp được đặtt giữa hai điệc cực Một dòng AC yếu (400000 Hz, 1,5V) được cho qua điện cực làm cho tế bào trần tích điện dương dồn về một phía và tích điện âm về một phía khác  - Sau thời gian 90 giây, trường AC được thay thế bởi xung điện áp cao một chiều khoảng 1000V/cm Khi những tế bào trần tiếp xúc với nhau, vách sinh chất vỡ và dung... dưới kính hiển vi với đèn huỳnh quang hoặc /UV Tế bào không thấm đối với Evans blue chứng tỏ tế bào đang sống  Sự chuyển động vòng hay sự sự xắp xếp của nguyên sinh chất thể hiện khả năng sống được của protoplast www.themegallery.com Phương pháp cơ bản để tách protoplast từ lá cây       Khử trùng mẫu lá Ngâm mẫu trong dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh chất Tách lớp mặt dưới lá Ngâm... www.themegallery.com Dung hợp protoplast  Dung hợp Protoplast phải xuất hiện trước khi thành tế bào mới được hình thành  Thành tế bào mới tái sinh sau vài giờ  Xác định bằng kính hiển vi với tia UV sử dụng dung dịch nhuộm  Nguyên phân xuất hiện khoảng 2-7 ngày sau khi protoplast được phân lập  Khuẩn lạc nuôi cấy protoplast có thể nhìn thấy sau 1-3 tuần www.themegallery.com www.themegallery.com  Có... hoặc dị nhân hình cầu www.themegallery.com Sản phẩm dung hợp  Protoplast bố mẹ 2n 2n  Sản phẩm Hybrid (con lai tứ bội) Cybrid (thể lai tế bào chất) N 4n 2n 2n www.themegallery.com Lục lạp Ty thể Dung hợp Nhân Thể dị nhân Thể lai tế bào chất Con lai Con lai Thể lai tế bào chất www.themegallery.com . khoáng NH 4 NO 3 KNO 3 CaCl 2 .2H 2 O MgSO 4 .7H 2 O KH 2 PO 4 KCl Sequestrence 330 Fe KI H 3 BO 3 MnSO 4 .H 2 O ZnSO 4 .7H 2 O Na 2 MoO 4 .2H 2 O CuSO 4 .5H 2 O CoCl 2 .6H 2 O 600 1900 600 300 170 300 28 0, 75 3 10 2 0, 25 0,0 25 0,0 25 Các acid. hemicellulase) từ 0,1 -2% - Sorbitol (0, 15 M) 27 ,3 g’ - Mannitol (0, 15 M) 27 ,3 g - Glucose (0,1 M) 18 g - CaCl 2 .2H 2 O (6 mM) 441 mg - KH 2 PO 4 (0,7 mM) 95 mg - Đệm MES: 2- (N-Morpholino)ethanesulfonic. 2- (N-Morpholino)ethanesulfonic acid (3 mM) 650 mg - Điều chỉnh pH 5, 6 và khử trùng dung di ch enzyme bằng màng lọc Millipore. Tinh s ch protoplast www.themegallery.com Xác định ch t lượng của protoplast  Phát