7 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ THANH THANH TẠO CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KNOCKOUT GEN wzz (O – ANTIGEN CHAIN LENGTH DETERMINANT GENE) Chuyên ngành: Vi sinh Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN QUỐC BÌNH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, động viên, giúp đỡ của ba mẹ, thầy cô, anh chị và các bạn. Con xin cảm ơn gia đình đã luôn ủng hộ và động viên con trong cuộc sống cũng như trên con đường học vấn. Em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Quốc Bình. Thầy đã định hướng và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tố t khóa luận. Cảm ơn Thầy đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu. Xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng CNSH Thủy Sản, phòng CNSH Y Dược đã nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian qua. Cảm ơn những người bạn của tôi đã luôn bên cạnh chia sẽ, động viên và cổ vũ tinh thần cho tôi trong thời gian thực hiện khóa luận. Trần Thị Thanh Thanh Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học i MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH x DANH MỤC SƠ ĐỒ xiv MỞ ĐẦU 1 Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra 3 1.2. Tình hình nghiên cứu vaccine cho cá kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 4 1.2.1. Những nghiên cứu trên thế giới 4 1.2.2. Những nghiên cứu ở Việt Nam 6 1.3. Lipopolysacharide (LPS) và vai trò của gen wzz trong quá trình tổng hợp LPS 7 1.3.1. Cấu trúc và chức năng của LPS 7 1.3.2. Quá trình tổng hợp LPS và vai trò của gen wzz 9 1.3.3. Một số nghiên cứu về gen wzz 11 1.4. Phương pháp knockout gen sử dụng hệ thống tái tổ hợp tương đồ ng λ Red 12 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học ii 1.5. Tạo chủng E. icataluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen và triển vọng làm vaccine 13 Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thiết bị, hóa chất, vật liệu 15 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ 15 2.1.2. Hóa chất 1 5 2.1.2.1. Hóa chất dùng để tách chiết plasmid 15 2.1.2.2. Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm PCR 15 2.1.2.3. Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose 16 2.1.2.4. Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn 16 2.1.2.5. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 16 2.1.2.6. Hóa chất dùng cho điện di DNA 16 2.1.2.7. Thang DNA 17 2.1.2.8. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp hóa biến nạp 17 2.1.2.9. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp điện biến nạp 17 2.1.3. Môi trường 18 2.1.3.1. Môi trường LB (Luria Bertami) 18 2.1.3.2. Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) 18 2.1.4. Chủng vi sinh vật 18 2.1.5. Plasmid 18 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học iii 2.1.5.1. Plasmid pKD4 18 2.1.5.2. Plasmid pCAMBIA 1300 19 2.1.5.3. Plasmid pGEM-T Easy 20 2.1.5.4. Plasmid pJET1.2/blunt 20 2.1.5.5. Plasmid pKD46 21 2.1.5.6. Plasmid pGP704 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang đoạn gen wzz của E. ictaluri 23 2.2.1.1. Thiết kế mồi 23 2.2.1.2. Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E. ictaluri 23 2.2.1.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy mang đoạn gen wzz (pGEMT::wzz) 24 2.2.1.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp 24 2.2.1.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGEM-T::wzz vào E. coli DH5α 25 2.2.1.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc 25 2.2.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn 26 2.2.1.8. Giải trình tự gen wzz 26 2.2.2. Tạo chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46 27 2.2.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri bằng phương pháp điện biến nạp 27 2.2.2.2. Biến nạp plasmid pKD46 vào E. ictaluri 27 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học iv 2.2.2.3. Kiểm tra dòng tế bào E. ictaluri mang pKD6 bằng phản ứng cắt giới hạn 28 2.2.2.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri mang plasmid pKD46 bằng phương pháp điện biến nạp 28 2.2.3. Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 29 2.2.3.1. Thiết kế mồi 29 2.2.3.2. Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP 30 2.2.3.3. Biến nạp cassette 1 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 30 2.2.4. Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP 30 2.2.4.1. Thiết kế mồi 32 2.2.4.2. Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP 32 2.2.4.3. Biến nạp cassette 2 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 33 2.2.5. Knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 34 2.2.5.1. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu của gen wzz 35 2.2.5.2. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn cuối của gen wzz 37 2.2.5.3. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu (Hwzz) và đoạn cuối (Twzz) của gen wzz 38 2.2.5.4. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn gen kháng kanamycin từ pCAMBIA 1300 40 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học v 2.2.5.5. Tạo dòng E. coli DH5α mang plasmid chứa cassette HTK (pJET::HTK) 42 2.2.5.6. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α λpir mang plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK 43 2.2.5.7. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E. ictaluri::pKD46 để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 45 2.2.5.8. Tạo dòng E. coli SM10 λpir chứa plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK 45 2.2.5.9. Tạo chủng E. ictalruri đột biến gen wzz bằng phương pháp tiếp hợp 46 2.2.6. Loại bỏ plamid pKD46 ra khỏi chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 47 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Nuôi cấy chủng E. ictaluri hoang dại 48 3.2. Tạo dòng E. coli DH5α mang đoạn gen wzz của E. ictaluri 49 3.2.1. Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E. ictaluri 49 3.2.2. Kết quả nhân dòng gen wzz trong E. coli DH5α bằng vector pGEM-T Easy 50 3.3. Tạo chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46 53 3.4. Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 54 3.4.1. Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP 54 3.4.2. Biến nạp cassette 1 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 55 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học vi 3.5. Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP 55 3.5.1. Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP 55 3.5.2. Biến nạp cassette 2 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 57 3.6. Knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 58 3.6.1. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu của gen wzz 58 3.6.1.1. Khuếch đại và thu nhận đoạn đầu gen wzz 58 3.6.1.2. Nhân dòng đoạn đầu của gen wzz trong E. coli DH5α bằng vector pJET1.2/blunt 59 3.6.2. Tạ o dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn cuối của gen wzz 61 3.6.2.1.Khuếch đại và thu nhận đoạn cuối gen wzz 61 3.6.2.2. Nhân dòng đoạn cuối của gen wzz trong E. coli DH5α bằng vector pJET1.2/blunt 62 3.6.3. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu và đoạn cuối của gen wzz 64 3.6.4. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn gen kháng kanamycin từ pCAMBIA 1300 66 3.6.4.1. Khuếch đại và thu nhận đoạn gen kháng kanamycin từ pCAMBIA 1300 66 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học vii 3.6.4.2. Nhân dòng đoạn gen kháng kanamycin trong E. coli DH5α bằng vector pJET1.2/blunt 67 3.6.5. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang cassette HTK (pJET::HTK) 69 3.6.6. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α λpir mang plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK 71 3.6.7. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E. ictaluri::pKD46 để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 73 3.6.8. Tạo dòng E. coli SM10 λpir chứa plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK 77 3.6.9. Tạo chủng E. ictalruri đột biến gen wzz bằng phương pháp tiếp hợ p 78 3.7. Loại bỏ plamid pKD46 ra khỏi chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 82 Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận 83 4.2. Đề nghị 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 PHỤ LỤC 89 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học viii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT BHI Brain heart infusion CD14 Cluster of differentiation 14 CNSH Công nghệ sinh học CFU Colony forming units DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate FRT Flippase Recognition Target LB Luria bertani LPS Lipopolysaccharide MCS Multi cloning site NCBI National Center for Biotechnology Information OMP Outer membrane protein OD Optical density PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid TCR T cell receptor [...]... tiêu của đề tài - Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen Nội dung đề tài bao gồm - Tạo dòng đoạn gen wzz của E ictaluri trong E coli DH5α - Tạo chủng E ictaluri mang plasmid pKD46 - Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP - Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 2 STEP - Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide... agarose 1% .81 xiii Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 29 Sơ đồ 2.2 Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 2 STEP .31 Sơ đồ 2.3 Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 .34 xiv Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học... PAO1, chủng hoang dại chủ yếu biểu hiện hai loại O antigen dài và rất dài được điều hòa bởi hai gen wzz1 và wzz2 Đột biến gen wzz1 làm giảm sự biểu hiện của chuỗi O antigen dài, đột biến gen wzz2 dẫn đến Trang 11 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học không biểu hiện chuỗi O antigen rất dài Chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2 giảm biểu hiện cả hai loại chuỗi O antigen Các chủng đột biến đã... chủng đột biến gen wzzfepE và chủng đột biến cả hai gen wzzst/wzzfepE Kết quả cho thấy chủng đột biến cả hai gen wzzst/wzzfepE cho kết quả chuỗi O antigen ngắn hơn, nhạy với huyết thanh hơn và có độc lực thấp nhất Chủng đột biến gen wzzst không biểu hiện chuỗi O antigen dài, nhạy cảm với huyết thanh và có độc lực thấp hơn so với chủng hoang dại Đột biến gen wzzfepE không khác nhiều so với chủng hoang dại... antigen và được điều hòa bởi hai gen wzz khác nhau [15] Salmonella enterica hoang dại biểu hiện hai kiểu chuỗi O antigen: chuỗi O antigen dài (16 đến 35 unit) được điều hòa bởi gen wzzst; chuỗi O antigen rất dài ( > 100 unit) được điều hòa bởi gen wzzfepE Murray và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm trên chuột với 3 chủng Salmonella enterica đột biến gen wzz: chủng đột biến gen wzzst; chủng đột biến gen. .. (vi khuẩn đã chết) bằng phương pháp ngâm và cho ăn 2 lần thì tỉ lệ sống là 52% [20] Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh đang tiến hành nghiên cứu tạo các chủng E ictaluri đột biến nhược độc bằng phương pháp knockout gen và phương pháp sử dụng kháng sinh rifampicin Hiện nay, trung tâm đã tạo được 4 chủng E ictaluri đột biến bao gồm: Chủng E ictaluri kháng rifampicin; Chủng E ictaluri đột. .. của Oantigen đối với độc tính của vi khuẩn Yersinia enterocolitica O:8 Tiến hành tiêm cho thỏ với 3 chủng đột biến: (i) Chủng đột biến bị mất hoàn toàn O antigen, (ii) chủng đột biến gen wzy bị mất protein Wzy nên biểu hiện LPS với chỉ một O unit duy nhất, (iii) chủng đột biến gen wzz bị mất protein Wzz nên biểu hiện LPS với chiều dài O antigen phân bố một cách ngẫu nhiên Kết quả cho thấy chủng đột biến. .. quả chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2 có độc lực thấp nhất Đối với chủng hoang dại, tất cả chuột đều chết ở liều gây độc khoảng 5.5 × 105 CFU nhưng đối với chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2 thì ở liều lượng này, chúng hoàn toàn không gây độc Chủng đột biến gen wzz1 cho kết quả giảm độc lực đáng kể Liều gây chết 50% của chủng này cao gấp 4,5 lần so với chủng hoang dại Chủng đột biến gen wzz2 ... Samonella, Yersinia… cho thấy khi chủng vi khuẩn đột Trang 1 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học biến gen wzz thì O antigen sẽ phân bố chiều dài chuỗi một cách ngẫu nhiên và có độc tính thấp hơn so với chủng hoang dại Từ những thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài Tạo chủng Edwardsiella ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen nhằm làm cơ sở cho vi c sản xuất vaccine nhược... chủng vi khuẩn đột biến nhược độc Đối với vi khuẩn E ictaluri, nhiều nghiên cứu đã xác định O antigen một kháng nguyên mạnh và là một yếu tố gây độc quan trọng E ictaluri biểu hiện O antigen dài và chiều dài của O antigen được điều hòa bởi gen wzz Ở các loài vi khuẩn Gram âm khác như E coli, Samonella, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, các nhà nghiên cứu đã tạo được chủng đột biến gen wzz