ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ DIỆU THU PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH Klebsiella pneumoniae MANG GEN BLAKPC KHÁNG CARBAPENEM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - năm 2011 LỜI CÁM ƠN Tơi xin dành lời cám ơn chân thành gửi đến tất người bên cạnh tôi, giúp tơi có thành cơng ngày hơm Lời đầu tiên, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.BS Phạm Hùng Vân, người thầy trực tiếp hướng dẫn khoa học, truyền đạt cho kiến thức bổ ích kinh nghiệm quý báu Thầy động viên tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa luận Cũng lời tri ân này, xin gửi tới thầy cô trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – người trang bị cho tảng kiến thức vững để tự tin bước vào đường nghiên cứu Tơi có may mắn đề nằm luận án tiến sĩ Th.S Trần Nhật Phương nên nhận nhiều hỗ trợ từ Anh Cám ơn Anh cung cấp cho tơi chủng để tiến hành thí nghiệm theo sát bước tơi, cho tơi góp ý chân thành, giúp đề tài đuợc hoàn thiện thời gian sớm Xin gửi lời cảm ơn đến anh chị, bạn bè cơng ty Nam Khoa nhiệt tình giúp đỡ tạo môi trường làm việc thân thiện giúp tơi có động lực làm việc tốt Cảm ơn nhiều người bạn sát cánh, dõi theo tôi, người chia sẻ buồn vui năm tháng học, người mà thiếu họ tơi khó lịng hồn thành luận văn cách trọn vẹn Và cuối cùng, từ tận đáy lòng, biết ơn bố mẹ dành cho đời Gia đình điểm tựa vững cho lúc khó khăn nhất, giúp có thêm động lực, niềm tin vào làm, giúp nên người trưởng thành ngày hơm Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng năm 2011 Vũ Diệu Thu Trang v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ASTS Antibiotics Sensitivity Testing Surveillance CLSI Clinical and Laboratory Standards Insitute dNTP deoxyribonucleotide triphosphate ESBL Expanded Spectrum Beta-lactamase FDA Food and Drug Administration ICARE Intensive Care Antimicrobial Resisstance Epidemiology K pneumoniae Klebsiella pneumoniae KIA Kligler Iron Agar KPC Klebsiella pneumonia Carbapenemase MC agar Mac Conkey agar MH Mueller Hinton MHA Mueller Hinton Agar MIC Minium Inhibitory Concentration NCBI National Center for Borotechnology Information ONPG o-nitrophenyl-D-galactopyranoside PBP penicillin-binding protein PCR Polymerase Chain Reaction TBE Tris/Borate/EDTA DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Trang viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số thử nghiệm sinh hóa loài chi Klebsiella Bảng 1.2 Nguồn phân lập Klebsiella Bảng 1.3 Phân lớp kháng sinh beta-lactam .10 Bảng 1.4 Các men beta-lactamase chọn lọc vi khuẩn gram âm 12 Bảng 1.5 Phân bố gen blaKPC theo thời gian vùng địa lý 21 Bảng 2.1 Hướng dẫn đọc kết phản ứng sinh hóa IDS14 GNR® 35 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA 38 Bảng 2.3 Hướng dẫn biện luận tính kháng nhóm Enterobacteriacea theo CLSI 2011 .44 Bảng 2.4 Trình tự mồi sử dụng khuyếch đại gen blaKPC .47 Bảng 2.5 Chương trình luân nhiệt Tm55 Tm60 48 Bảng 2.6 Tên nồng độ kháng sinh kháng sinh đồ 52 Bảng 3.1 Kết định danh hóa chất IDS14 GNR® 54 Bảng 3.2 Nồng độ, kích thước sản phẩm PCR gen 16S rRNA sau tinh 56 Bảng 3.3 Kết xác định chủng tiết ESBL 58 Bảng 3.4 Kết biện luận tính kháng carbapenem dựa vào đường kính vịng vơ khuẩn quanh đĩa carbapenem 60 Bảng 3.5 So sánh kết biện luận tính kháng carbapenem dựa vào MIC dựa vào đường kính vịng vơ khuẩn .63 Bảng 3.6 Bảng tổng kết kết thu .67 Bảng 3.7 Nồng độ kích thước sản phẩm PCR gen KPC sau tinh 72 Bảng 3.8 Đánh giá kết thử nghiệm Hodge cải biên (MHT) 81 DANH MỤC BẢNG Trang vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình kính hiển vi quét khuẩn lạc K pneumoniae Hình 1.2 Cấu trúc penicillin carbapenem Hình 1.3 Vị trí gen blaKPC K pneumoniae số lồi khác 16 Hình 1.4 Sự khác biệt KPC-1, KPC-2 KPC-3 17 Hình 1.5 Phân bố dịch tễ gen blaKPC (năm 2009) 23 Hình 2.1 Hướng dẫn định danh vi khuẩn gram âm dễ mọc nhờ IDS14 GNR® 36 Hình 2.2 Thử nghiệm Hodge cải biên môi trường MHA 46 Hình 2.3 Sơ đồ đặt đĩa kháng sinh 52 Hình 3.1 Kết ni cấy quan sát kính hiển vi điện tử 53 Hình 3.2 Hình ảnh điện di chip gen 16S rRNA 56 Hình 3.3 Kết kháng sinh đồ chủng 17 59 Hình 3.4 Kết xác định MIC meropenem phương pháp vi pha loãng môi trường lỏng chủng 04, 05, 13, 18, 20 62 Hình 3.5 Kết thử nghiệm Hodge cải biên (MHT) 65 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR khuyếch đại gen KPCu KPC chủng chứng âm chứng dương 68 Hình 3.7 Kết điện di gen KPC KPCu 21 chủng thí nghiệm 70 Hình 3.8 Kết điện chip sản phẩm PCR gen blaKPC tinh 72 Hình 3.9 Kết giải trình tự gen blaKPC chủng K pneumoniae ATCC ® 1705 với cặp mồi blaKPC-F 74 Hình 3.10 Kết giải trình tự gen blaKPC chủng K pneumoniae ATCC ® 1705 với cặp mồi blaKPC-R 74 DANH MỤC HÌNH Trang vii Hình 3.11 Kết tra cứu trình tự tương đồng với chủng K pneumoniae ATCC ® 1705 dùng thí nghiệm cơng cụ BLAST NCBI 75 Hình 3.12 Tìm vị trí cắt giới hạn trình tự gen blaKPC phần mềm Primer premier 5.0 77 DANH MỤC HÌNH Trang i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG viii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 TỒNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae 1.1.1 Đặc điểm phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa phân bố 1.1.3 Các nhân tố gây bệnh 1.1.4 Đặc điểm gây bệnh tình hình đề kháng kháng sinh 1.2 Carbapenem chế kháng carbapenem 1.2.1 Carbapenem 1.2.2 Cơ chế kháng carbapenem 11 1.2.3 Carbapenemase 12 1.3 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) 15 1.3.1 Klebsiella pneumonia carbapenemase (KPC) 15 1.3.2 Phát điều trị nhiễm khuẩn kháng carbapenem 17 1.3.3 Tình hình dịch tễ học 19 1.4 Một số nghiên cứu thực 23 1.4.1 Trên giới 23 MỤC LỤC Trang ii 1.4.2 Trong nước 25 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 27 2.1 Vật liệu 27 2.1.1 Các chủng thí nghiệm 27 2.1.2 Thiết bị 27 2.1.3 Hóa chất 28 2.2 Phương pháp 28 2.2.1 Phương pháp nhuộm gram 29 2.2.2 Phương pháp định danh sinh hóa 29 2.2.2.1 Nguyên tắc phản ứng sinh hóa định danh nhóm trực khuẩn Gram âm 30 2.2.2.2 Cách tiến hành 33 2.2.3 Phương pháp giải trình tự gen 16S RNA 36 2.2.3.1 Tách chiết DNA vi khuẩn 37 2.2.3.2 Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rRNA 37 2.2.3.3 Tinh sản phẩm PCR 38 2.2.3.4 Xác định nồng độ DNA sau tinh 40 2.2.3.5 PCR giải trình tự 40 2.2.3.6 Tủa tinh sản phẩm PCR giải trình tự 41 2.2.3.7 Điện di mao quản DNA 42 2.2.3.8 Xử lý kết giải trình tự 42 2.2.4 Phương pháp phát vi khuẩn có kiểu hình tiết ESBL 42 2.2.4.1 Phương pháp đĩa đôi 42 MỤC LỤC Trang iii 2.2.4.2 Phương pháp đĩa kết hợp 43 2.2.5 Phương pháp phát vi khuẩn có khả sinh carbapenmase 44 2.2.5.1 Phương pháp khuyếch tán kháng sinh 45 2.2.5.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 45 2.2.5.3 Thử nghiệm Hodge cải biên 45 2.2.5 Phương pháp xác định vi khuẩn mang gen blaKPC 47 2.2.5.1 Phương pháp PCR 47 2.2.5.2 Điện di gel agarose 48 2.2.5.3 Phương pháp giải trình tự gen 49 2.2.5.4 Xác định kiểu gen blaKPC 50 2.3 Qui trình thí nghiệm 51 KẾT QUẢ BIỆN LUẬN 53 3.1 Kết định danh vi khuẩn 53 3.1.1 Kết định danh sinh hóa 53 3.1.2 Kết giải trình tự 16S rRNA 56 3.2 Kiểm tra kiểu hình tiết ESBL 57 3.3 Kiểm tra kiểu hình kháng carbapenem 59 3.3.1 Biện luận tính kháng dựa vào đường kính vịng vơ khuẩn 59 3.3.2 Biện luận tính kháng dựa vào MIC 61 3.3.3 Kết thử nghiệm Hodge cải biên 64 3.4 Xác định gen blaKPC 68 3.4.1 Kết PCR 68 MỤC LỤC Trang iv 3.4.2 Kết giải trình tự 71 3.4.3 Xác định kiểu gen blaKPC 76 3.5 Tổng kết kết thu 79 3.5.1 Đánh giá tính kháng chủng thí nghiệm 79 3.5.2 Đánh giá thử nghiệm Hodge cải biên 81 KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 83 4.1 Kết luận 83 4.2 Đề nghị 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 Tài liệu tiếng Việt 85 Tài liệu tiếng Anh 86 Tài liệu Internet 93 PHỤ LỤC Phu lục 1: Kết định danh IDS 14 ® GNR Phu lục 2: Kết giải trình tự gen 16S rRNA Phu lục 3: Hình ảnh kháng sinh đồ 21 chủng thí nghiệm Phu lục 4: Kết giải trình tự gen blaKPC chủng thí nghiệm MỤC LỤC Trang 70 Hình 3.7 Kết điện di gen KPC KPCu 21 chủng thí nghiệm Ghi chú: L: thang chuẩn 1000 bp 1705: chủng chứng dương K pneumoniae ATCC ® 1705 mang gen KPC 1706: chủng chứng âm K pneumoniae ATCC ® 1706 không mang gen KPC   KẾT QUẢ BIỆN LUẬN Trang 71 Hình 3.7 Kết di gen K KPCu 21 c iện KPC chủng thí nghiệm (tiếp n p) 3.4.2 Kết giải t trình tự ẳng c phẩm khuyế đại thu gen KP ếch h PC Để khẳ định vạch sản p tơi tiến hành giải trình tự trự tiếp sản phẩm PCR Sản phẩm PCR trướ úng n ực R m ớc đem giải tr i rình tự phải tinh để có tín hi trình tự tốt Sả i iệu ản phẩ PCR sa tinh b hóa chấ QIAquick PCR Puri ẩm au ất k ification Ki its (QU UIAGEN, M kiểm tra n Mỹ) nồng độ độ tinh điện DN đ NA chi Kết điện di DN chip trê máy Alig ip NA ên gent 2100 A Analyser đư trình bà ược ày ởh hình 3.8, bả 3.7 Kế cho t ảng ết thấy sản ph hẩm đạt độ tinh c cao, thu đượ ợc mộ loại sản p ột phẩm n với kíc thước kh ch hoảng 408-4 bp, khơ có nhữn 411 ơng ng băn phụ kèm theo Nồn độ sản p ng m ng phẩm sau ti đạ từ 18,21inh ạt -24,05 ng/µ µl Để thu k giải trình tự tố điều quan trọng l tối ưu thành phầ kết i ốt q ần a g rong lượ DNA n giữ vai trò qua ợng an phản ứng PCR giải trình tự, tr trọn Theo kh ng huyến cáo nhà sản xuất, với kích thước khoảng từ 200-500 b n c bp lượng DNA cần c phả ứng PCR giải trình tự 13-18 ng Dựa A cho ản R uyến cáo kết q nồng đ DNA thu sau tinh b độ u bổ khu sun thể tích thích hợp phản ứng PCR giải trình tự ng t g   K KẾT QUẢ BIỆN LUẬ B ẬN Trang 72 Hình 3.8 Kết điện chip sản phẩm PCR gen blaKPC tinh Bảng 3.7 Nồng độ kích thước sản phẩm PCR gen blaKPC sau tinh Kích thước Nồng độ (bp) [ng/µl] 09 409 18,23 20,73 12 408 19,92 410 22,42 13 410 23,61 04 410 19,18 18 409 22,96 06 408 20,59 20 409 24,05 07 410 18,21 Kích thước Nồng độ (bp) [ng/µl] 1705 410 18,72 02 411 03 ID ID   KẾT QUẢ BIỆN LUẬN Trang 73 Sau có sản phản PCR tinh sạch, tiến hành phản ứng PCR giải trình tự với cặp mồi blaKPC-F blaKPC-R để thu chuỗi trình tự hồn chỉnh có chiều dài mong muốn Sản phẩm PCR giải trình tự tủa tinh phương pháp sử dụng nồng độ muối cao ethanol tuyệt đối để loại bỏ Bigdye terminator dư thành phần dư khác trước điện di mao quản máy ABI 3130 XL Genetic Analyser Kết phân tích phần mầm Sequencing analysis xử lý phần mềm Bioedit nhằm đưa chuỗi trình tự tốt Chuỗi trình tự so sánh trình tự tham khảo ngân hàng gen NCBI Qui trình giải trình tự thực chủng chứng dương K pneumoniae ATCC ® 1705 trước áp dụng cho chủng thí nghiệm để kiểm tra ổn định qui trình Kết giải trình tự gen blaKPC-F KPC-R chủng K pneumoniae ATCC ® 1705 trình bày hình 3.10 3.11 Trình tự gen blaKPC hồn chỉnh K pneumoniae ATCC ® 1705 thu sau xử lý với phần mềm Bioedit sau: TTTGGCCTTGGACGCCTCACATACCGTGCCGTTTACTGATCGGCAGCAG ACCGGGTGACCCGCGCGTGGATAAACGGGCAACCTCGGGTTAGGGAG CTCGCGCTCAGATCGGCGTCGCCGCTACTGCCGGAGCGACACGAACAG TAGGAACAATCCGCGGGCCCACATCTGCCGGTTGTGTTATCCACGCGC GGGTCACCCGGTCTGCTGCCGTATCAGTAAACGGCACGGTATGTGAGG CGTCCAAGGCCAAAACAGAGGCTGACGGGTCAGACGGCCGTGGCGGC GCGCCTACGCCACCAACGGCCAGCACAAAGGGAAATCGGTTAGTTGTT TGACGACGGCGACGCCGCGTCGGTCACGTCTCGGGTCACAGTCAAAAA CATTCGAAAGGCAGTGCCGCGCGCCGCTACTCCATAGCGCGCGTAGCG GACCCTACCGCCTCAAGTCGAGGTCGAGGGTCGCCAGGTCTT So sánh trình tự với trình tự tham khảo ngân hàng NCBI, kết giải trình tự có độ tương đồng 99% so với trình tự K pneumoniae ATCC ® 1705 gửi lên ngân hàng NCBI trước với mã số GI 224384176 (hình 3.12) Như qui trình giải trình tự ổn định, dùng để áp dụng cho chủng lại Kết cho thấy trình tự sản phẩm PCR chủng thí nghiệm trình tự gen blaKPC với độ tương đồng với trình tự tham khảo từ 98-100% Kết giải trình tự trình bày phần phụ lục   KẾT QUẢ BIỆN LUẬN Trang 74 A Trình tự giải B Hình ảnh liệu thơ Hình 3.9 Kết giải trình tự gen blaKPC chủng K pneumoniae ATCC ® 1705 với cặp mồi blaKPC-F A Trình tự giải B Hình ảnh liệu thơ Hình 3.10 Kết giải trình tự gen blaKPC chủng K pneumoniae ATCC ® 1705 với cặp mồi blaKPC-R   KẾT QUẢ BIỆN LUẬN Trang 75 > gi|224384176|gb|FJ665695.1| Klebsiella pneumoniae strain ATCC BAA- 1705 carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase (blaKPC-2) gene, partial cds Length=842 Sort alignments for this subject sequence by: E value Score Percent identity Query start position Subject start position Score = 726 bits (393), Expect = 0.0 Identities = 398/400 (99%), Gaps = 2/400 (1%) Strand=Plus/Plus Query Sbjct 412 Query 62 Sbjct 472 Query 122 Sbjct 532 Query 182 Sbjct 592 Query 242 Sbjct 652 Query 302 Sbjct 712 Query 362 Sbjct 772 TCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAGGCGATGCGCGCGATACCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAGGCGATGCGCGCGATACCTC 61 ATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGGGCTCTGCACTGGCTGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGGGCTCTGCACTGGCTGC 121 GCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGACCGGCAACCACCGCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGACCGGCAACCACCGCAT 181 CCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCGGAACCTGCGGAGTGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCGGAACCTGCGGAGTGTA 241 TGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCGCACCTATTGTGTTGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCGCACCTATTGTGTTGGC 301 CGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGGCCGTCATCGCCGCTGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGGCCGTCATCGCCGCTGC 361 GGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGC-TCCAACGGGCA |||||||||||||||||||||||||||| || |||||||| GGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTC-AACGGGCA 471 531 591 651 711 771 400 810 Hình 3.11 Kết tra cứu trình tự tương đồng với chủng K pneumoniae ATCC ® 1705 dùng thí nghiệm cơng cụ BLAST NCBI   KẾT QUẢ BIỆN LUẬN Trang 76 3.4.3 Xác định kiểu gen blaKPC Việc xác định kiểu gen blaKPC giúp nhà dịch tễ học đánh giá mức độ lan truyền loại blaKPC dự đoán nguồn gốc của chủng mang gen blaKPC Tuy có nhiều biến thể gen blaKPC (từ đến 11) có loại thơng thường nhận thấy K pneumoniae blaKPC-1, blaKPC-2 blaKPC-3 Các isozyme khác nu trình tự dẫn đến thay đổi axít amin Các nghiên cứu trước thường phân biệt loại isozyme dựa vào kết điện di sản phẩm PCR gen blaKPC sau ủ với enzyme cắt giới hạn BstNI RsaI (hình 1.3), bảng điện di có vạch blaKPC-1, có vạch trình tự có vị trí cắt giới hạn BstNI blaKPC-2 blaKPC-3 bảng điện di có vạch trình tự có vị trí cắt giới hạn BstNI RsaI Dựa vào sở đó, chúng tơi sử dụng phần mềm Primer premier 5.0 tìm vị trí cắt giới hạn enzyme trình tự gen blaKPC thu để xác định kiểu gen blaKPC Kết cho thấy chủng chứng dương K pneumoniae ATCC ®1705 có trình tự enzyme cắt giới hạn BstNI, tức chủng mang gen blaKPC-2, kết phù hợp với với cơng bố trình tự gen ngân hàng NCBI Trình tự 10 chủng thí nghiệm có trình tự enzyme cắt giới hạn BstNI (hình 3.12) Như tất chủng mang gen blaKPC loại blaKPC-2 Kiểu gen blaKPC-2 lần phát chủng K pneumoniae phân lập Maryland [62] sau bùng phát sang bang khác Mỹ [16, 19, 31] Isarel [37], năm gần xuất rải rác Pháp [44], Hy Lạp [23], Anh [70], Brazil [61],… đáng lưu ý nước láng giềng Trung Quốc [68] Gen blaKPC-2 có khả lây lan nhanh blaKPC-1 lan truyền qua dung hợp plasmid [62] Sự xuất chủng mang gen blaKPC2 Việt Nam điều đáng báo động   KẾT QUẢ BIỆN LUẬN Trang 77 Hình 3.12 Tìm vị trí cắt giới hạn trình tự gen blaK p h KPC phần mềm mer Prim premier 5.0   K KẾT QUẢ BIỆN LUẬ B ẬN Trang 78 Hình 3.12 Tìm vị trí cắt giới hạn trình tự gen blaK p h KPC phần mềm premier 5.0 (tiếp) Primer p   K KẾT QUẢ BIỆN LUẬ B ẬN Trang 79 Hình 3.12 Tìm vị trí c giới hạn trình tự gen blaK p H cắt h KPC phần mềm premier 5.0 (tiếp) Primer p ng q ược 3.5 Tổn kết kết thu đư 3.5.1 Đ Đánh giá tín kháng c chủ thí ngh nh ủng hiệm Dựa bảng tổn kết kết q 3.6, ch ng húng tơi chi 21 chủng thí nghiệm ia g nhóm nhỏ để phân tích nh sau: ành m p hư   K KẾT QUẢ BIỆN LUẬ B ẬN Trang 80 - Nhóm 1: bao gồm 10 chủng mang gen blaKPC (02, 03, 04, 06, 07, 09, 12, 13, 18, 20) có MHT dương tính, kháng hay trung gian với loại carbapenem thử nghiệm Chủng 03 20 có ESBL dương tính., chủng cịn lại ESBL âm tính Tính kháng carbapenem chủng 03 20 xuất phát từ việc dùng carbapenem để điều trị, áp lực sử dụng thuốc kháng sinh chọn lọc vi khuẩn có khả sinh men KPC kháng carbapenem để tự vệ Còn nguồn gốc gen blaKPC chủng lại dự đốn lan truyền qua trung gian plasmid từ chủng chủ kháng thuốc ban đầu - Nhóm 2: bao gồm chủng 11, 14, 17 với khơng mang gen blaKPC, MHT âm tính, ESBL dương tính nhạy với tất loại carbapenem Để đối phó với chủng vũ khí carbapenem cịn cơng hiệu Tuy nhiên, việc xuất tính kháng carbapenem áp lực chọn lọc thuốc điều khó tránh khỏi - Nhóm 3: bao gồm chủng 01, 19, 21 khơng mang gen blaKPC, MHT âm tính, cộng thêm ESBL âm tính lại kháng với hầu hết tất loại carbapenem Thử nghiệm MHT phần lớn dựa đánh giá chủng Enterobacteriaceae phân lập từ Mỹ cho thấy thử nghiệm có độ nhạy độ chuyên biệt cao (> 90%) để phát carbapenemase loại KPC, cịn metallo-beta-lactamase chưa rõ [67] Vì vậy, tính kháng carbapenem chủng 01, 19, 21 tiết loại carbapenemase khác với KPC (ví dụ: metallo-carbapenemase) chế đặc biệt khác chế sản xuất AmpC cephalosporinase cộng thêm giảm tính thấm màng nghiên cứu trước [72] - Nhóm 4: bao gồm chủng 08, 10, 15, 16 không mang gen blaKPC, MHT âm tính, ESBL dương kháng với loại carbapenem Ở K pneumoniae, kênh porin màng OmpK35và OmpK36 giữ vai trò quan trọng, thiếu hay thay hai protein đóng góp vào tính kháng carbapenem [36] Như tính kháng chủng tăng cường tính kháng khả tiết ESBL với với thay đổi kênh porin làm thay đổi   KẾT QUẢ BIỆN LUẬN Trang 81 tính thấm qua màng làm cho kháng sinh carba h a m g apenem khô vào đư bên tron ông ược ng tế b vi khuẩn Để khẳ định đư giả thiế cần phải tiến h bào ẳng ược ết hành phươn ng phá phân tử k áp kiểm tra diện c protein màng Omp ự pK35, Omp pK36 phâ ân tích trình tự ge để phát h biến đổi bê trìn tự h en ên nh - Nhóm 5: gồm c chủng 10 có kết đặc biệt Chủn 05 khôn m 05, k c ng ng ma gen bla ang aKPC lại có kết thử n g t nghiệm MH dương v ESBL âm HT m Tín kháng chủng với carbapene tiết lo nh g em ể oại car rbapenemas khác metallo-ca se arbapenema (ví dụ: VIM, IPM NDM, … ase M, …) Còn chủng 10 không ma gen bla ang aKPC Công cụ phân tử phát gen nói g n n thực để tìm hiểu t tính kháng c chủ ủng cần phải t Đánh giá th nghiệm H Hodge cải biên 3.5.2 Đ Dựa bảng so sánh kết qu thử nghi uả iệm MHT v kết PCR gi với iải trìn tự gen blaKPC đượ thống kê bảng 3.8 chúng tô đánh giá độ đặ nh b ợc ê 8, ôi ặc hiệ thử nghiệm Hod cải biên (MHT) để phát gen blaKP côn ệu n dge n ể PC ng thứ ức: h ả m ải HT) Bảng 3.8 Đánh giá kết thử nghiệm Hodge biên (MH Kết PCR v giải trìn tự (tiêu chuẩn vàng nh c g) Kết th nghiệm MH HT Có mang gen blaKPC K Không mang gen blaK g KPC Dương tính (11) t Dươ tính thật (10) ơng t Dương tí giả (1) ính Âm tín (10) nh Âm tính giả ( m (0) Âm tính thật (10) h   K KẾT QUẢ BIỆN LUẬ B ẬN Trang 82 Như vậy, thử nghiệm MHT phát men KPC nghiên cứu đạt độ nhạy 100% độ đặc hiệu 90,91% Kết thu phù hợp với đánh giá MHT thử nghiệm có độ nhạy độ đặc hiệu cao (>90%) để phát vi khuẩn tiết men KPC Tuy nhiên, CLSI từ năm 2010 khơng khuyến cáo phịng thí nghiệm vi sinh lâm sàng sử dụng MHT xét nghiệm thường qui để xác định vi khuẩn kháng carbapenem theo chế tiết carbapenemase Hơn nữa, số lượng mẫu nghiên cứu đề tài thấp (n = 21) chủng Việt Nam cịn gặp, cần phải tiến hành nghiên cứu số lượng mẫu lớn để đánh giá xác Mặt khác thử nghiệm MHT thử nghiệm kiểu hình nên kết phụ thuộc vào chủ quan người đọc kết xem thử nghiệm nhạy để phát men KPC thử nghiệm MHT không phân biệt kiểu gen blaKPC Hơn nữa, công cụ khơng đủ giúp nhà nghiên cứu tìm hiểu chế kháng thuốc Vì vậy, phương pháp phân tử “công cụ vàng” nghiên cứu   KẾT QUẢ BIỆN LUẬN Trang 83 KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Trong 21 chủng nghi ngờ K pneumoniae có tính đa kháng đưa vào thí nghiệm có 18 chủng định danh lại K pneumoniae, chủng Enterobacter asbureae, chủng Enterobacter hormaecheii, chủng Shigella boydii Có 11/21 chủng có thử nghiệm Hodge dương tính, chủng kháng trung gian với tất loại carbapenem thử nghiệm (imipenem, meropenem, doripenem, ertapenem) Đánh giá thử nghiệm Hodge cải biên thực 21 chủng thí nghiệm cho thấy thử nghiệm có độ nhạy 100% độ đặc hiệu 90,91% để phát chủng mang gen blaKPC Khẳng định diện gen blaKPC 10 chủng thơng qua phương pháp PCR giải trình tự, có chủng K pneumoniae, chủng Enterobacter hormaechei, tất khẳng định mang gen blaKPC-2 Phương pháp PCR giải trình tự “công cụ vàng” để xác định phát có mặt gen blaKPC kiểu gen blaKPC Đây nghiên cứu Việt Nam phát gen blaKPC K pneumoniae, vật chủ có khả tích lũy lan truyền tác nhân kháng cao Khả lan truyền diện rộng đối tượng trở thành mối đe dọa cho cộng đồng gen blaKPC định vị yếu tố di truyền di động plasmid Sự xuất 10 chủng mang gen blaKPC chủng K pneumoniae chủng Enterobacter hormaechei Việt Nam nghiên cứu tiếng chuông cảnh tỉnh nhà điều trị lâm sàng Chủ quan vi khuẩn mang gen blaKPC phân bố chủ yếu vùng bờ biển phía Đơng, Việt Nam chưa có nghiên cứu tìm hiểu phân bố lan truyền chủng kháng thuốc Nghiên cứu giúp nhà điều trị lâm sàng Việt Nam có nhìn thực tế mơ hình lan truyền tính kháng carbapenem gen blaKPC Việt Nam nói riêng mà cịn góp phần minh chứng cho bùng phát KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ Trang 84 qui mơ tồn cầu chủng mang gen blaKPC, K pneumoniae mang gen blaKPC 4.2 Đề nghị Những “siêu vi khuẩn” kháng thuốc mang gen blaKPC gần trở thành bất trị lại thêm khả lây truyền nhanh Cho đến nay, việc kiểm soát phát chủng vi khuẩn mang gen blaKPC thách thức Từ nghiên cứu thực hiện, đề nghị: - Mở rộng nghiên cứu có mặt gen blaKPC tất địa bàn dịch tễ khác để kiểm soát nhiễm khuẩn, quản lý kháng sinh ngăn chặn kịp thời lây lan chủng - Tìm hiểu chế kháng carbapenem chủng không mang gen blaKPC cách nghiên cứu có mặt gen kháng khác gen đặc trưng (ví dụ: thay đổi kênh porin màng, protein gắn penicillin PBPs) - Tiến hành khảo sát nhiều chủng để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu thử nghiệm Hodge cải biên - Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu thử nghiệm Hodge cải biên để phát loại carbapenemase khác - Ứng dụng qui trình PCR với điều kiện tối ưu để phát nhanh chủng mang gen blaKPC đơn vị nghiên cứu KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ ... vi khuẩn ĐẶT VẤN ĐỀ Trang Đề tài ? ?Phát xác định Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem? ?? thực nhằm phát số chủng Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC số bệnh viện Việt Nam Qua... đại PCR nhằm xác định xác kiểu gen blaKPC [25] Nhìn chung, việc phát vi khuẩn mang gen blaKPC kháng carbapenem khó khăn giá trị MIC carbapenem cao nằm khoảng xác định trung gian xác định theo CLSI... phần: + Định danh lại chủng nghi ngờ Klebsiella pneumoniae có tính đa kháng thu từ số bệnh viện Việt Nam + Xác định kiểu hình tiết ESBL carbapenemase + Phát gen blaKPC phương pháp PCR + Xác định