Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - - 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM    NGUYỄN THỊ HOA PHÂN TÍCH ĐA HÌNH MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR-RFLP LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - - 2 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM    NGUYỄN THỊ HOA PHÂN TÍCH ĐA HÌNH MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR-RFLP Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Văn Cƣờng Thái Nguyên - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - - 3 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Cường, phòng Công nghệ gen động vật, viện Công nghệ sinh học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam; PGS đã nhiệt tình chỉ bảo, định hướng và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình công tác, học tập và nghiên cứu để thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các nghiên cứu viên, các cán bộ phòng Công nghệ gen động vật đã chỉ bảo, hướng dẫn tôi về mặt kỹ thuật, chuyên môn, giúp đỡ tôi học tập và làm việc. Để hoàn thành tốt luận văn, tôi cũng đã nhận được sự ủng hộ, động viên khuyến khích của gia đình, bạn bè trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn‼ Thái Nguyên, ngày 22 tháng 8 năm 1010 Tác giả Nguyễn Thị Hoa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - - 4 CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu chữ Tên Tiếng Anh Tên Tiếng Việt AFLP bp BF dNTP DGAT H-FABP EDTA EtBt IMF Lpin1 LB OD PAP PPARα PGC-1α QTL RAPD RFLP RNase SDS TAG TE TBE Amplifed Fragment Length Polymorphism Base paire Backfat Deoxynucleoside triphosphate Diacyl glycerol acyltransferase Heart fatty acid binding protein Ethylene diamine tetracetic acid Ethidium bromid Intramuscular fat content Lipin1 gene Loading buffer Optical density Phosphatidate phosphatase Peroxisome proliferator Coactivator-1α Quantitative trait loci Random Amplified Polymorphic DNA Restriction Fragment Length Polymorphism Ribonucleasa Sodium dodecyl sulfate Triacylglycerol Tris- EDTA Tris boric acid- EDTA Đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuyếch đại cặp bazơ Độ dày mỡ lưng Deoxynucleosit triphotphat Enzyme Diacyl glycerol acyltransferase Protein liên kết acid béo ở tim Axit ethylen diamin tetracetic Ethiđium bromit Hàm lượng mỡ giắt trong cơ Gen Lpin1 DNA vi vệ tinh Mật độ quang học Enzyme Phosphatidate phosphatase Thụ thể Peroxisome Coactivator-1α Vị trí tính trạng số lượng Đa hình DNA được khuyếch đại ngẫu nhiên Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn Ribonucleaza Sodium dodexyl sunfat Triacylglycerol Đệm TE Đệm TBE Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - - 5 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài 2. Mục tiêu và nhiệm vụ của đề tài CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Chỉ thị di truyền (Genetic marker) 1.1.1. Chỉ thị loại 1 (known function) 1.1.2. Chỉ thị loại 2 (unknown function) 1.2. Ứng dụng các chỉ thị di truyền đến các tính trạng số lượng ở lợn 1.2.1. Nghiên cứu gen lợn ở nước ngoài 1.2.2. Nghiên cứu gen lợn ở Việt Nam 1.3. Gen Heart- fatty acid binding protein (H-FABP) 1.3.1. Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen H-FABP 1.3.2. Đa hình di truyền gen H-FABP 1.4. Gen Lipin 1 (Lpin1) 1.4.1. Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen Lpin1 1.4.2. Đa hình di truyền gen Lpin1 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hoá chất và trang thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu 2.1.2. Hoá chất 2.1.3. Máy móc, trang thiết bị 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô tai lợn 2.2.2. Phương pháp kiểm tra DNA bằng điện di gel agarose 1 1 2 3 3 5 5 6 7 9 11 11 15 18 18 25 28 28 28 28 30 30 32 33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - - 6 2.2.3. Định lượng DNA bằng quang phổ kế 2.2.4. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.2.5. Phương pháp phân tích đa hình đoạn cắt giới hạn (RFLP) CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu mô tai lợn 3.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phương pháp PCR-RFLP 3.2.1. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phương pháp PCR 3.2.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng enzyme cắt giới hạn HaeIII 3.3. Phân tích gen Lpin1 bằng phương pháp PCR- RFLP 3.3.1. Phương pháp phân tích gen Lpin1 bằng phương pháp PCR 3.3.2. Phân tích gen Lpin1 bằng enzyme cắt giới hạn MspI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN 2. ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. TIẾNG VIỆT 2. TIẾNG ANH PHỤ LỤC 35 36 38 40 40 41 41 42 47 47 48 51 51 52 53 53 55 61 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - - 7 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1. Bảng 1.2 Bảng 1.3. Bảng 2.1. Bảng 2.2. Bảng 2.3. Bảng 2.4. Bảng 2.5. Bảng 2.6. Bảng 2.7. Bảng 2.8. Bảng 3.1. Bảng 3.2. Bảng 3.3. Bảng 3.4. Bảng 3.5. Các loại chỉ thị di truyền phân tử chính ở động vật Một số gen và các chỉ thị di truyền phân tử có tương quan với các tính trạng quan trọng ở lợn. Vị trí của các yếu tố phiên mã bám trên vùng phía trước đầu 5’ của gen mã hóa H-FABP Danh mục hoá chất đã sử dụng trong luận văn Trình tự mồi và điều kiện phản ứng Đệm và các dung dịch pha chế Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Tương quan giữa nồng độ gel agarose và kích thước đoạn DNA cần phân tích theo Sambrook và CS Thành phần phản ứng PCR của gen H-FABP và Lpin1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR của gen H-FABP và Lpin1 Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR Tần số các alen ở cả 3 vị trí RFLP của gen H-FABP của một số giống lợn Các điểm cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H- FABP Kết quả phân tích đa hình RFLP kiểu gen H-FABP bằng enzyme HaeIII. Điểm cắt của MspI ở đoạn gen Lpin1 Tần số alen và tần số kiểu gen Lpin1 6 8 12 28 29 29 30 34 37 38 39 43 44 45 48 49 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - - 8 Hình Tên hình vẽ, Bảng biểu Trang Hình 1.1. Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4. Hình 1.5. Hình 1.6. Hình 1.7. Sơ đồ Hình 3.1. Hình 3.2. Hình 3.3. Sơ đồ Hình 3.4. Đồ thị Hình 3.5. Sơ đồ Hình 3.6. Đồ thị Vị trí gen mã hóa H-FABP trên nhiễm sắc thể số 6 ở lợn Trình tự aminoacid của các loại F-ABP Cơ chế hoạt động của H-FABP trong tế bào Vị trí gen Lpin1 của lợn trên nhiễm sắc thể số 3 Chức năng phân tử của gen Lipin 1, 2, 3 Các loại Lpins: Lpin-1A, Lpin-1B, Lpin-2, Lpin-3. Gen Lpin1 trong các loại tế bào. Quy trình thí nghiệm Điện di đồ sản phẩm DNA tách chiết từ mô tai lợn Phổ hấp thụ tử ngoại của DNA của lợn Móng cái và Yorshire Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen H- FABP Vị trí cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H- FABP Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen H-FABP bằng enzyme HaeIII Tần số kiểu gen H-FABP Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen Lpin1 Vị trí cắt của MspI trên đoạn gen Lpin1 Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen Lpin1 bằng enzyme MspI Tần số kiểu gen của Lpin1 11 14 15 19 20 25 26 31 40 41 42 44 44 46 47 48 49 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - - 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngành chăn nuôi lợn của Việt Nam đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp với sản lượng thịt chiếm 80% lượng thịt được tiêu thụ và chiếm 25% giá trị sản suất nông nghiệp của Việt Nam [7]. Từ nhiều năm qua sự phát triển của nghành chăn nuôi lợn đã góp phần đáng kể trong việc nâng cao chất lượng cuộc sống cho người dân. Theo thông báo của FAO, 55% số lượng lợn trên thế giới thuộc về vùng Châu Á – Thái Bình Dương. Trong đó, Việt Nam có số lượng lợn lớn nhất với khoảng 12 triệu con. Các giống lợn nội ở Việt Nam rất đa dạng, chiếm 60 – 90% về mặt số lượng chúng thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới và điều kiện chăn nuôi của các vùng nông thôn nghèo [26]. Các giống lợn thường cho chất lượng thịt tốt, ngon khi chế biến. Song nhược điểm của các giống lợn này là tăng trưởng chậm, trọng lượng thấp, thành phần mỡ nhiều, trong thịt xẻ và tỷ lệ tiêu tốn thức ăn cao. Do vậy, các hướng nghiên cứu nhằm cải thiện giống vật nuôi cho năng suất cao mà vẫn giữ được chất lượng thịt ngon, phù hợp với điều kiện khí hậu ở Việt Nam có ý nghĩa rất quan trọng trong sản xuất. Trong công tác lai tạo và chọn giống truyền thống ở lợn, các chỉ tiêu chọn lọc thuộc về kiểu hình mà chủ yếu là các chỉ tiêu về hình thái và một số chỉ tiêu về hóa sinh như: tốc độ sinh trưởng được xác định bằng cân, đo; chất lượng thịt được xác định bằng màu sắc thịt, số lượng cơ, độ pH [17]. Phương pháp trên đã góp phần vào việc cải tạo giống lợn nuôi ở Việt Nam. Tuy nhiên việc lựa chọn bằng ngoại hình có trở ngại là đòi hỏi nhiều thời gian, thường không ổn định và nhiều khi không chính xác hoặc không thể thực hiện được. Những thành tựu về giải mã gen người và động vật đã làm sáng tỏ nhiều locus tính trạng số lượng có ý nghĩa kinh tế. Thành tựu này mở ra khả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - - 2 năng ứng dụng chỉ thị di truyền phân tử hỗ trợ chọn giống trong ngành công nghiệp chăn nuôi lợn. Phương pháp này cho phép khắc phục những hạn chế của phương pháp chọn lọc truyền thống như: rút ngắn thời gian chọn lọc, chọn lọc chính xác hơn, thực hiện chọn lọc được đối với những tính trạng khó xác định dựa vào ngoại hình. Do tính ưu việt trên nên thời gian qua hướng nghiên cứu này phát triển rất mạnh mẽ. Đến nay đã có 4928 QTLs liên quan đến 499 tính trạng khác nhau đã được xác định chủ yếu tập chung vào các tính trạng có ý nghĩa kinh tế như: chất lượng thịt, tốc độ tăng trọng, số con sinh trong một lứa, gen kháng bệnh [27]. Để nâng cao năng xuất, trong những năm vừa qua tiến hành lai giữa lợn thuần ngoại với lợn nội. Trong chương trình nghiên cứu này, lợn ngoại được sử dụng là Yorshire cho lai với lợn nội là Móng Cái. Với mục đích xác định tính đa hình của một số ứng cử gen liên quan đến chất lượng thịt lợn, góp phần phát triển chỉ thị di truyền phân tử phục vụ cho công tác chọn giống chúng tôi tiến hành nghiên cứu “ Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng phương pháp PCR -RFLP’’. 2. Mục tiêu và nhiệm vụ của đề tài Mục tiêu Xác định các biến thể DNA của gen Lpin1, H-FABP liên quan đến chất lượng thịt lợn, nhằm hỗ trợ công tác chọn giống. Nhiệm vụ Phân tích đa hình gen Lpin1, H-FABP ở lợn Móng Cái và Yorshire bằng phương pháp PCR-RFLP. [...]... quả phân tích cho thấy là kiểu gen: CC có hàm lượng mỡ lá và mỡ giắt thấp hơn so với hàm lượng mỡ lá và mỡ giắt của lợn có kiểu gen TT, TC Trên đối tượng là con người, đa hình gen Lpin1 liên quan với nhiều đặc điểm trao đổi chất, hàm lượng insulin, mức độ glucose [52], quá trình trao đổi chất và ảnh hưởng đến huyết áp tâm thu Đa hình gen Lpin1 có liên quan đến bệnh nhân tiểu đường loại 2 Một đa hình. .. hàng dữ liệu bản đồ gen lợn đã có 4928 QTLs liên quan đến 499 tính trạng khác nhau, trong đó 3711 QTLs liên quan đến tính trạng chất lượng thịt, 494 QTLs liên quan đến tính trạng sản lượng thịt, 199 QTLs liên quan đến khả năng sinh sản [27] http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/summary 1.2.2 Nghiên cứu gen lợn ở Việt Nam Nghiên cứu trong nước về lĩnh vực này đã được bắt đầu quan tâm, tuy nhiên... trên 136 lợn lai với khoảng 65 kg trọng lượng, chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm được cho ăn với khẩu phần khác nhau Sau 35 ngày nuôi, lợn thịt khoảng 95 kg trọng lượng cơ thể và chất lượng thịt lợn được đánh giá Đa hình gen H-FABP được phân tích Các kết quả thu được: (1) nguồn thức ăn có tác dụng rất lớn đến màu thịt (MC), pH24, chất béo trong cơ (IMF,%), và protein trong cơ bắp (IMP,%); (2) đa hình gen H-FABP... H-FABP liên quan đến hàm lượng mỡ trong cơ [15] Ở lợn Calabrese đã chứng minh là lợn mang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn 17 kiểu gen mã hóa H-FABP là AaddHh có hàm lượng mỡ lưng cao hơn lợn mang kiểu gen aaddHH; lợn có kiểu gen Aaddhh có độ dày mỡ lưng dày hơn lợn mang kiểu gen AaddHh, lợn mang kiểu gen HH có màu sắc thịt sáng hơn so với kiểu gen khác... sự biến đổi của độ dày mỡ lưng Đã có những bằng chứng cho thấy ảnh hưởng của đa hình gen HFABP liên quan đến tốc độ phát triển của lợn Tóm lại, H-FABP ảnh hưởng đến hàm lượng IMF, độ dày mỡ lưng và tốc độ sinh trưởng của quần thể lợn [21] Ảnh hưởng hàm lượng mỡ cơ với đa hình gen mã hóa H-FABP cũng được nghiên cứu ở lợn: Landrace, Large White, và một số giống lợn nội ở Trung Quốc: Neijiang, Rongchang,... thiếu Lpin1, có liên quan không chỉ đến mất chức năng enzyme PAP mà còn ảnh hưởng tích tụ trong tế bào phosphatidate [13] 1.4.2 Đa hình di truyền gen Lpin1 Lợn là động vật rất quan trọng trong nền kinh tế cung cấp cho con người nguồn thực phẩm và cũng là một mô hình nghiên cứu cho sức khỏe của con người, một trong những chỉ tiêu về chất lượng thịt đó là sự lắng đọng mỡ ở thịt lợn [53] Số hóa bởi Trung... được phân tích và chủ yếu tập trung vào những tính trạng sinh trưởng nhanh, tỷ lệ nạc cao, chất lượng thịt tốt, khả năng sinh sản và chống được bệnh tật tốt Dưới đây là một số gen và các chỉ thị di truyền phân tử chính liên quan đến các tính trạng: tăng trưởng, khả năng sinh sản, chất lượng thịt đã được nghiên cứu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 Một số. .. lượng thông tin đa hình (Polymorphism Information Content) 1.2 Ứng dụng các chỉ thị di truyền đến các tính trạng số lƣợng ở lợn Trong chọn giống ở lợn và nhiều gia súc khác, thường các chỉ thị di truyền được sử dụng có liên quan đến các tính trạng năng suất, chất lượng thịt, sức sống cao, khả năng kháng bệnh…Đó là các tính trạng số lượng (quantitative trait) hay còn gọi là các tính trạng liên tục (vì... Trình tự nucleotid của gen hormone sinh trưởng của một số giống lợn nội Việt Nam như lợn Móng Cái, lợn Ỉ, lợn H’mông đã được xác định trong công trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Diệu Thúy, Geldermann H (2004) [9] Bằng kỹ thuật PCR Nguyễn Văn Cường và cs (2003) [2], Nguyễn Thị Diệu Thúy và cs (2003, 2004) [10, 11] cũng xác định kiểu gen liên quan đến số con/lứa đẻ qua phân tích gen FSH Việc xác định tần... và chất lượng thịt lợn Hàm lượng mỡ cơ tương ứng của kiểu gen DD . DNA tổng số từ các mẫu mô tai lợn 3.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phương pháp PCR- RFLP 3.2.1. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phương pháp PCR 3.2.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng enzyme. enzyme cắt giới hạn HaeIII 3.3. Phân tích gen Lpin1 bằng phương pháp PCR- RFLP 3.3.1. Phương pháp phân tích gen Lpin1 bằng phương pháp PCR 3.3.2. Phân tích gen Lpin1 bằng enzyme cắt giới hạn MspI. chỉ thị di truyền phân tử phục vụ cho công tác chọn giống chúng tôi tiến hành nghiên cứu “ Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng phương pháp PCR -RFLP ’. 2. Mục