TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALOLACTIC RƯỢU VANG CHANH DÂY CBHD: PGS. TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG SVTH : HOÀNG THỊ KIM THOA MSSV:60604391 ĐẶNG MAI HUYỀN ANH MSSV:60604008 TP HỒ CHÍ MINH, 01/2011 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên chúng em xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp chúng em hoàn thành tốt luận văn này. Chúng em xin cảm ơn cô Nguyễn Thúy Hương – người đã tận tình theo sát, chỉ bảo, giúp đỡ, tạo cho chúng em sự say mê trong học tập và nghiên cứu. Xin cảm ơn các anh chị lớp cao học CH2008, CH2009 đã nhiệt tình giúp đỡ. Xin cảm ơn tất cả các thành viên của lớp HC06BSH, những người bạn đã đồng hành cùng chúng mình trong suốt những năm tháng đại học, đã quan tâm, chia sẻ, động viên, đặc biệt là luôn tạo một không khí vui vẻ để thời gian làm luận văn thật đáng nhớ. Chúng con xin cám ơn gia đình đã luôn theo sát, ủng hộ, khích lệ và động viên trong suốt quãng đường mà chúng con đã đi. Cám ơn các thành viên của nhóm A&T – những người bạn thân thiết nhất đã cùng nhau trải qua mọi niềm vui, nỗi buồn để đạt được kết quả như ngày hôm nay. Cuối cùng, xin gửi những lời thân thương nhất đến tất cả những người đã sát cánh cùng chúng tôi trong thời gian qua. TP. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2010 Hoàng Thị Kim Thoa Đặng Mai Huyền Anh ii TÓM TẮT Rượu vang chanh dây sau quá trình lên men rượu vẫn còn một lượng lớn acid malic làm cho rượu có vị chua gắt. Lên men malolactic là quá trình chuyển hóa acid malic thành acid lactic nhằm cải thiện chất lượng cảm quan của rượu. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quá trình lên men malolactic ở rượu vang chanh dây bằng tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni tự do và cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC), kết quả thu được như sau: - Xác định được tỉ lệ giống vi khuẩn Oenococcus oeni thích hợp bổ sung cho quá trình lên men malolactic là 7%, thời điểm bổ sung giống thích hợp nhất là ngay sau khi kết thúc quá trình lên men rượu (ngày thứ 7 của quá trình lên men rượu), thời gian lên men malolactic thích hợp đối với rượu chanh dây là 4 ngày. - Cố định được tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni trên chất mang BC bằng hai phương pháp: bẫy – hấp phụ và nhốt chủ động. Sử dụng chế phẩm vi khuẩn cố định bằng phương pháp bẫy – hấp phụ sau 5 ngày ủ với mật độ là 7.1 x 10 9 CFU/cm 3 để tiến hành lên men. Kết quả thu được cho thấy khi sử dụng chế phẩm vi khuẩn Oenococcus oeni cố định trên chất mang BC để lên men malolactic đối với rượu vang chanh dây thì hiệu quả lên men vẫn đảm bảo sau 8 lần tái sử dụng. Đồng thời chúng tôi cũng khảo sát hiệu quả của quá trình lên men khi sử dụng đồng thời 2 chế phẩm cố định trên chất mang BC: nấm men Saccharomyces cerevisiae ứng dụng trong lên men rượu và vi khuẩn Oenococcus oeni ứng dụng trong lên men malolactic thì nhận thấy hiệu quả của quá trình lên men vẫn ổn định. Điều này được thể hiện thông qua độ cồn và nồng độ acid malic chuyển hóa được. - Sau khi tối ưu các điều kiện, tiến hành lên men rượu, malolactic và tàng trữ. Chúng tôi tiến hành đánh giá cảm quan và nhận thấy: chất lượng cảm quan của rượu đã được cải thiện, đặc biệt là về mùi vị. Rượu sau quá trình lên men malolactic có vị chua hài hòa hơn mà vẫn giữ được hương vị đặc trưng của rượu chanh dây. iii MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC SƠ ĐỒ ix DANH MỤC ĐỒ THỊ ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu về chanh dây 3 2.1.1 Nguồn gốc 3 2.1.2 Đặc điểm sinh học 3 2.1.3 Thành phần hóa học 4 2.1.4 Ứng dụng 5 2.2 Lên men rượu vang 6 2.2.1 Giới thiệu sơ lược về rượu vang 6 2.2.2 Tác nhân vi sinh vật 7 2.2.3 Cơ sở hóa sinh 8 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 9 2.2.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu 10 2.3 Lên men malolactic 11 2.3.1 Định nghĩa lên men malolactic 11 2.3.2 Vị trí của lên men malolactic trong sản xuất rượu vang 14 2.3.3 Phân loại vi khuẩn lên men malolactic 14 2.3.4 Vai trò của quá trình lên men malolactic 18 2.3.5 Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men malolactic 18 2.4 Kỹ thuật cố định 42 iv 2.4.1 Lịch sử phát triển 42 2.4.2 Định nghĩa 43 2.4.3 Chất mang 43 2.4.4 Phương pháp cố định 58 2.4.5 Ưu nhược điểm của cố định tế bào 66 2.4.6 Yêu cầu đối với vi sinh vật cố định 67 2.4.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến cố định vi sinh vật 68 2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài 69 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 72 3.1 Vật liệu 72 3.1.1 Chanh dây 72 3.1.2 Giống vi sinh vật 72 3.1.3 Môi trường nuôi cấy 72 3.1.4 Vật liệu, hóa chất 74 3.1.5 Thiết bị và dụng cụ 74 3.2 Phương pháp thí nghiệm 74 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 74 3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 76 3.2.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm 82 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 86 4.1 Kiểm tra đặc điểm giống vi sinh vật: 86 4.1.1 Saccharomyces cerevisiae 86 4.1.2 Oenococcus oeni 88 4.1.3 Acetobacter xylinum 90 4.2 Lên men tạo BC 91 v 4.2.1 Lên men thu nhận BC 91 4.2.2 Xử lý chế phẩm BC thô 91 4.3 Khảo sát quá trình lên men malolactic bằng chủng Oenococcus oeni tự do 91 4.3.1 Khảo sát tỉ lệ giống Oenococcus oeni thích hợp để lên men malolactic 91 4.3.2 Khảo sát thời điểm thích hợp để bổ sung giống Oenococcus oeni trong lên men malolactic. 95 4.3.3 Khảo sát thời gian lên men malolactic 101 4.4 Khảo sát các phương pháp cố định Oenococcus oeni trên chất mang BC 104 4.4.1 Phương pháp bẫy- hấp phụ: 104 4.4.2 Phương pháp nhốt chủ động 108 4.5 Lên men malolactic sử dụng chế phẩm Oenococcus oeni cố định trên chất mang BC… 111 4.5.1 Lên men rượu sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae tự do và lên men malolactic sử dụng vi khuẩn Oenococcus oeni cố định 111 4.5.2 Lên men rượu sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định và lên men malolactic sử dụng vi khuẩn Oenococcus oeni cố định 113 4.6 Kết quả cảm quan 115 4.7 Kết quả kiểm tra vi sinh 116 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 117 5.1 Kết luận 117 5.2 Kiến nghị 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO 119 PHỤ LỤC 124 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1: Một số nước sản xuất rượu vang hàng đầu thế giới 6 Bảng 2. 2 Phân loại vi khuẩn Lactobacillus 16 Bảng 2. 3 Tốc độ phát triển của vi khuẩn malolactic theo nhiệt độ 28 Bảng 2. 4: Thành phần của vang trước và sau khi lên men malolactic 31 Bảng 2. 5: Sự thay đổi hàm lượng các acid amin có trong dịch lên men vang Shiraz trước và sau khi lên men malolactic với pH ban đầu là 3.7. 34 Bảng 2. 6: Hàm lượng acid dễ bay hơi (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men malolactic 35 Bảng 2. 7: Hàm lượng rượu bậc cao (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men malolactic. 37 Bảng 2. 8: Hàm lượng các ester (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men malolactic. 39 Bảng 2. 9: Hàm lượng các hợp chất chứa lưu huỳnh và nitơ (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men malolactic 40 Bảng 2. 10 Ưu nhược điểm của từng loại chất mang 46 Bảng 2. 11Cấu trúc BC của một số loài vi sinh vật 47 Bảng 2. 12 Bảng so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp cố định tế bào thông dụng 65 Bảng 2. 13 So sánh một số tính chất của việc lên men sử dụng nấm men cố định trên gel alginate và nấm men cố định trên BC 66 Bảng 3. 1 Thành phần môi trường Hansen 72 Bảng 3. 2 Thành phần môi trường MLA 73 Bảng 3. 3 Thành phần môi trường MT5 73 Bảng 3. 4 Thành phần môi trường MT6 74 Bảng 3. 5 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian lên men malolactic 77 Bảng 4. 1 Kết quả lập đường chuẩn Saccharomyces cerevisiae 87 Bảng 4. 2 Sự thay đổi các yếu tố sau quá trình lên men malolactic ứng với các tỉ lệ giống khác nhau 92 vii Bảng 4. 3 Sự biến đổi pH khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. 95 Bảng 4. 4 Sự thay đổi nồng độ chất khô khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. 96 Bảng 4. 5 Sự thay đổi nồng độ acid tổng khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. 97 Bảng 4. 6 Sự thay đổi độ rượu khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. 98 Bảng 4. 7 Sự thay đổi hàm lượng acid malic và acid lactic khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. 100 Bảng 4. 8 Sự thay đổi các yếu tố theo thời gian lên men malolactic 101 Bảng 4. 9 Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các chất mang BC1, BC2 và BC3 105 Bảng 4. 10 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào vi khuẩn được cố định trên chất mang BC. 107 Bảng 4. 11 Kết quả cố định bằng phương pháp nhốt 109 Bảng 4. 12 So sánh 2 phương pháp cố định 110 Bảng 4. 13 Các thông số của dịch chanh dây thí nghiệm 111 Bảng 4. 14 Sự biến động acid malic và acid lactic sau mỗi chu kì lên men malolactic 112 Bảng 4. 15 Các thông số của chế phẩm cố định Saccharomyces cerevisiae trên BC: 114 Bảng 4. 16 Sự biến động acid malic và acid lactic sau mỗi chu kì lên men malolactic ……………………………………………………………………………………….114 Bảng 4. 17: Kết quả kiểm tra vi sinh 116 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2. 1 Trái chanh dây 4 Hình 2. 2 Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae 7 Hình 2. 3 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus, Leuconosto 14 Hình 2. 4 Hình thái vi khuẩn Oenococcus oeni 18 Hình 2. 5 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic. 29 Hình 2. 6: Quá trình tạo diaceryl 35 Hình 2. 7: Phản ứng giữa SO 2 và các hợp chất carbonyl 38 Hình 2. 8 Acetobacter xylinum 47 Hình 2. 9 A-BC được tạo ra từ môi trường lắc (a) và S-BC được tạo ra từ môi trường tĩnh (b) 50 Hình 2. 10 Cấu trúc của cellulose (a) Cellulose vi khuẩn (x 20000) và (b) cellulose của thực vật (x200) 51 Hình 2. 11 Vị trí – quá trình biến dưỡng carbon và tổng hợp cellulose ở A. xylinum 54 Hình 2. 12 Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose khi glucose được tế bào A. xylinum hấp thụ từ bên ngoài 54 Hình 2. 13 Sự tổng hợp vi sợi bởi Acetobacter xylinum 55 Hình 2. 14 Con đường chuyển hóa carbon của Acetobacter xylinum 57 Hình 2. 15 Các phương pháp cố định vi sinh vật 59 Hình 2. 16 Cố định tế bào trên bề mặt chất mang 59 Hình 2. 17 Cố định tế bào trong lòng chất mang 61 Hình 2. 18 Liên kết giữa các tế bào 62 Hình 2. 19 Cố định tế bào bằng màng membrane 62 Hình 4. 1 Hình ảnh đại thể Saccharomyces cerevisiae trên môi trường đặc 86 Hình 4. 2 Hình ảnh vi thể Saccharomyces cerevisiae dưới kính hiển vi 86 Hình 4. 3: Hình ảnh vi thể Oenococcus oeni dưới kính hiển vi 88 Hình 4. 4 Hình thái khuẩn lạc Acetobacter xylinum trên thạch đĩa và lớp váng vi khuẩn Acetobacter xylinum trên môi trường lỏng. 90 Hình 4. 5 Hình thái vi khuẩn Acetobacter xylinum dưới kính hiển vi 90 Hình 4. 6 BC tươi sau khi lên men 91 Hình 4. 7 BC sau 30 phút đầu của quá trình hấp phụ 105 ix DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2. 1 Cơ chế lên men ethanol . 8 Sơ đồ 2. 2 Con đường chuyển hóa vật chất của quá trình lên men glucose nhờ vi khuẩn malolactic (Wood và Holzapfel 1995) 13 Sơ đồ 2. 3: Phân loại vi khuẩn malolactic (Boulton et al 1996) 15 Sơ đồ 2. 4: Sơ đồ chuyển hóa p-coumaric acid thành 4-ethylphenol 41 Sơ đồ 2. 5 Phân loại chất mang 45 Sơ đồ 3. 1 Sơ đồ thu nhận BC 78 Sơ đồ 3. 2 Xử lí BC thô 78 DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4. 1 Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae 87 Đồ thị 4. 2 Đường chuẩn của nấm men Saccharomyces cerevisiae 88 Đồ thị 4. 3 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Oenococcus oeni 89 Đồ thị 4. 4 Đường chuẩn của vi khuẩn Oenococcus oeni 89 Đồ thị 4. 5 Sự thay đổi pH sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau 92 Đồ thị 4. 6 Sự thay đổi nồng độ chất khô sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau. 93 Đồ thị 4. 7 Sự thay đổi nồng độ acid tổng sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau 93 Đồ thị 4. 8 Sự thay đổi độ rượu sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau 94 Đồ thị 4. 9 Sự thay đổi nồng độ acid malic và acid lactic sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau. 94 Đồ thị 4. 10 Sự thay đổi pH trước và sau quá trình lên men malolactic 96 Đồ thị 4. 11 Sự thay đổi nồng độ chất khô trước và sau quá trình lên men malolactic 97 Đồ thị 4. 12 Sự thay đổi nồng độ acid tổng trước và sau quá trình lên men malolactic 98 Đồ thị 4. 13 Sự thay đổi độ rượu trước và sau quá trình lên men malolactic 99 Đồ thị 4. 14 Sự thay đổi hàm lượng acid malic và acid lactic trước và sau quá trình lên men malolactic. 100 [...]... men rượu, vào khoảng kết thúc quá trình lên men rượu hoặc sau khi hoàn tất quá trình lên men rượu (Davis et al., 1985) [37] 20 Chương 2: Tổng quan tài liệu Kết thúc malolactic Lên men rượu Bắt đầu lên men malolactic Tàng trữ Ngày Đồ thị 2 2: Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic [37] Đồ thị 2 3: Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá. .. của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống trước khi lên men ethanol [37] 21 Chương 2: Tổng quan tài liệu Đồ thị 2 4: Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống sau khi lên men ethanol [21] Quá trình lên men malolactic bắt đầu khi tế bào đạt đến pha... năng lên men của nấm men Ở nồng độ 2 – 5% rượu đã có khả năng ức chế nấm men, ở 5 – 6% rượu làm nấm men đình chỉ sinh sản, mặc dù quá trình lên men vẫn tiếp tục diễn ra Mặt khác, khi lên men rượu sản phẩm tạo thành còn có CO2 Khí CO2 có thể ức chế lên men, nhưng cũng kích thích quá trình lên men vì chúng làm môi trường lên men được khuấy động liên tục, nấm men luôn ở trạng thái lơ lửng, giúp rút ngắn quá. .. trình lên men glucose nhờ vi khuẩn malolactic (Wood và Holzapfel 1995) [37] 13 Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.3.2 Vị trí của lên men malolactic trong sản xuất rượu vang Trong sản xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiến hành sau khi lên men chính Dịch sau lên men rượu được gọi là vang non” được tiến hành lắng cặn và được chuyển sang bồn lên men tiếp theo Quá trình này diễn ra rất chậm nhằm... điểm của vang Quá trình lên men malolactic có ba ý nghĩa quan trọng trong sản xuất rượu vang: - Làm giảm độ acid của dịch vang sau lên men - Điều chỉnh hương vị đặc trưng của vang - Làm ổn định về mặt vi sinh cho rượu vang thành phẩm 2.3.5 Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men malolactic 2.3.5.1 Biến đổi sinh học a Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic trong lên men malolactic. .. quan tài liệu 2.2.2 Tác nhân vi sinh vật Lên men rượu thường được chia thành 2 giai đoạn: Lên men chính ở nhiệt độ 20-30oC khoảng 10 ngày hoặc dài hơn, quá trình lên men chính hoạt động nhờ các loại nấm men Saccharomyces và lên men phụ ở nhiệt độ 15 – 18oC, quá trình lên men malolactic được tiến hành sau quá trình lên men chính Cấu tạo của tế bào nấm men: nấm men là vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm Eukaryote,... khác liên quan đến quá trình lên men rượu vang đó chính là vi khuẩn acid lactic, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu lần hai hay còn gọi là lên men malolactic Hiệu suất của quá trình lên men malolactic phụ thuộc vào đặc điểm của từng loại quả (Bozoğlu và Yurdugül, 2000), đặc biệt là lượng acid malic có trong quả Nếu hàm lượng acid malic quá cao thì việc lên men malolactic là cần... malolactic đóng vai trò quan trọng trong lên men malolactic, chúng thường diễn ra sau khi nấm men đã hoàn tất quá trình lên men rượu, khi đó mật độ tế bào đạt 106 CFU/ml (Lonvaud-Funel, 1999; Osborn et al., 2000; Versari et al., 1999) [37] Hơn nữa, vi khuẩn malolactic có thể được bổ sung vào các giai đoạn sau của quá trình lên men rượu: đồng thời với việc bổ sung nấm men, trong suốt quá trình lên men. .. đoạn lên men chính, vi khuẩn acid lactic chiếm số lượng nhỏ (khoảng hơn 100 tế bào/g), vi khuẩn acetic và nấm men tìm thấy số lượng nhiều hơn Oenococcus oeni chiếm số lượng nhiều hơn có trong lên men malolactic, xuất hiện ngay từ đầu trong quá trình lên men rượu vang Pediococcus có thể tìm thấy hầu hết sau khi quá trình lên men malolactic bắt đầu xảy ra và nhiều nhất khi rượu có pH cao hơn Rượu vang. .. trong rượu, giảm được vị chua gắt, cải thiện được hương vị của rượu vang (Steinkraus, 1992) [37] Lên men malolactic là một quá trình quan trọng trong sản xuất rượu vang hay ít nhất là những loại rượu vang có hàm lượng acid cao ở những vùng có khí hậu mát mẻ Lợi ích của quá trình lên men malolactic bao gồm: giảm lượng acid trong những loại rượu vang có nồng độ acid cao, cải thiện hương vị đặc trưng của rượu . cho quá trình lên men malolactic là 7%, thời điểm bổ sung giống thích hợp nhất là ngay sau khi kết thúc quá trình lên men rượu (ngày thứ 7 của quá trình lên men rượu) , thời gian lên men malolactic. quá trình lên men 9 2.2.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu 10 2.3 Lên men malolactic 11 2.3.1 Định nghĩa lên men malolactic 11 2.3.2 Vị trí của lên men malolactic. quá trình lên men rượu vang đó chính là vi khuẩn acid lactic, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu lần hai hay còn gọi là lên men malolactic. Hiệu suất của quá trình lên