BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI LÊ THỊ VÂN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Cry1Ac CHO CÂY KHOAI TÂY (Solanum tuberosum L.) BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 60.62.05 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH HÀ NỘI, 2011 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, hình ảnh, kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan các tài liệu trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà nội, ngày 08 tháng 09 năm 2011 Tác giả luận văn Lê Thị Vân Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực tập tại viện sinh học nông nghiệp trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội, được sự quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của viện, cùng sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình. Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS. TS Nguyễn Thị Lý Anh, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện đề tài, cũng như trong thời gian tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự dạy bảo và những ý kiến đóng góp của các thầy cô trong bộ mộ Di truyền –chọn giống, các thầy cô trong khoa, trong trường và các thầy cô trong viện đào tạo sau đại học. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Ths. Nguyễn Thị Thanh Phương, đã trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Qua đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến lãnh đạo và cán bộ nghiên cứu phòng Sinh học phân tử và chọn tạo giống cây trồng, cùng toàn thể cán bộ nghiên cứu của Viện Sinh học Nông Nghiệp đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian tôi thực hiện đề tài vừa qua. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã tạo điều kiện tinh thần tốt nhất và luôn ủng hộ cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luân văn này. Hà nội, ngày 08 tháng 09 năm 2011 Tác giả luận văn Lê Thị Vân Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC lời cam đoan i lời cảm ơn ii mục lục iii danh mục các chữ viết tắt vi danh mục bảng vii danh mục hình ix 1. MỞ ðẦU 1 1.2 Mục đích và yêu cầu 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây 4 2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở thế giới và Việt Nam 5 2.3 Chuyển gen ở thực vật 6 2.5 Các nghiên cứu về tái sinh invitro và chuyển gen ở cây khoai tây 18 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 25 3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 26 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1. Nghiên cứu tái sinh invitro cho cây khoai tây Atlantic. 36 4.1.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại đường (manitol, glucose và saccarose) đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 36 4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 39 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA thuộc nhóm cytokinin đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. 41 4.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4 - D đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 44 4.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 46 4.2 Các thí nghiệm tiền đề cho chuyển gen 50 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime đến khả năng sống và tái sinh của cây khoai tây 50 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng sinh cefotaxime đến tỷ lệ sống của vi khuẩn A. tumefaciens. 54 4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT đến tỷ lệ sống của mô nuôi cấy 56 4.3 Nghiên cứu xác định một số thông số kỹ thuật trong chuyển gen 58 4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 58 4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 63 4.3.3 Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm mẫu đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 66 4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 70 4.3.5 Đánh giá tác động tổng hợp của các công thức tối ưu tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 76 4.3. Kết quả đánh giá cây khoai tây Atlantic chuyển gen bằng PCR 80 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 4.4. So sánh và thảo luận kết quả đề tài với các kết quả nghiên cứu chuyển gen ở cây khoai tây đã được công bố ở Việt Nam. 83 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 85 5.1 Kết luận 85 5.2 Đề nghị 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 PHỤ LỤC 96 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4 D Dichlorophenoxyacetic acid BA Benzyl adenin αNAA α-Naphthylacetic acid IAA Indol acetic acid MS Murashige and Skoog, 1962 ĐC Đối chứng ĐNC Đồng nuôi cấy AS Acetosyringone A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens DNA DNA- Ribonucleic acid Gus Β- Glucuronidase PPT DL- photphinothricin Ka Kanamycin Kb Kilo base kDa Kilo Dalton PCR Polymerase chain reaction- phản ứng chuỗi trùng hợp DK Diệt khuẩn CT Công thức Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1. Ảnh hưởng của một số loại đường (manitol, glucose và saccarose) đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy) 37 4.2. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy) 40 4.3. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA thuộc nhóm cytokinin đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy). 42 4.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4 - D đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy) 45 4.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA tới khả năng phát inh hình thái mô nuôi cấy (sau 8 tuần nuôi cấy) 47 4.6 Ảnh hưởng của chất kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime đến khả năng sống và tái sinh của cây khoai tây (Sau 8 tuần nuôi cấy) 51 4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng sinh cefotaxime đến tỷ lệ sống của vi khuẩn A. tumefaciens. 55 4.8 Ảnh hưởng của PPT đến tỷ lệ sống của mô nuôi cấy (sau 6 tuần nuôi cấy) 56 4.9a Đánh giá ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium trên hai giống Dianmant và Atlantic. 59 4.9b Đánh giá ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar và gen Gus (sau 8 tuần) 61 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii 4.10a Đánh giá ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium trên hai giống Dianmant và Atlantic. 63 4.10b Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar và gen Gus (8 tuần) 64 4.11a Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium trên hai giống Diamant và Atlantic. 67 4.11b Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm mẫu tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar và gen Gus (8 tuần) 69 4.12a Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterim trên hai giống Diamant và Atlantic 71 4.12 b Đánh giá ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar và gen Gus (8 tuần) 73 4.13a Đánh giá tác động tổ hợp của các công thức tối ưu tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens trên hai giống khoai tây Atlantic và Diamant 76 4.13b Đánh giá tác động tổng hợp của các công thức tối ưu tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens qua sự biểu hiện của gen Bar và gen Gus (sau 8 tuần) 77 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Sơ đồ cấu trúc plasmid ITB2c. 25 4.1 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 41 4.2 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA thuộc nhóm cytokinin đến khả năng tạo chồi của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy) 44 4.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4 - D đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy) 46 4.4 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 49 4.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 49 4.6 Ảnh hưởng của chất kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime đến khả năng sống và tái sinh của cây khoai tây 53 4.7 Kết quả tái sinh của các loại mẫu trên môi trường MS3 + 300mg/L cefotaxime (A: Đoạn thân không mang mắt ngủ, B: callus) 54 4.9 Đoạn thân không mang mắt ngủ và callus ở nồng độ 1,0 mg/L PPT (Sau 6 tuần nuôi cấy) 57 4.10 Hình ảnh mẫu đồng nuôi cấy 3 ngày 60 4.11 Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 62 4.12 Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens 66 [...]... i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 21 Mahmoud M Saker (2003), cùng các nhóm nghiên c u ñã nghiên c u khoai tây chuy n gen v i gen quy ñ nh t o v protein v i virus Y khoai tây H u h t các k thu t chuy n gen qua Agrobacterium tumefaciens v i gen kháng sâu ñã ñư c s d ng Trong bài nghiên c u này, chuy n gen vào cây khoai tây ch a gen quy ñ nh hình thành v protein virus Y khoai tây (cp-LMV)... có nghiên c u xây d ng h th ng tái sinh in vitro trên gi ng khoai tây Diamant và m t s gi ng nh b i c a ðinh Trư ng Sơn và cs., (2007) Chính t v n ñ ñó chúng tôi ti n hành th c hi n ñ tài: Nghiên c u chuy n gen Cry1Ac cho cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) b ng vi khu n Agrobacterium tumefaciens. ” 1.2 M c ñích và yêu c u 1.2.1 M c ñích - Xây d ng ñư c quy trình tái sinh in vitro cho cây khoai tây. .. , Nguy n Văn Uy n, chuy n gen phát sáng gfp vào cây hoa phong lan Dendrobium cv Burana White nh vi khu n Agrobacterium tumefaciens Qua s d ng ch ng vi khu n Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 ch a plasmid pCAMBIA 1303 mang gen gfp5, gen gusA và gen hph ñ chuy n gen vào PLB cây hoa phong lan Dendrobium Burana White, ñã nh n ñư c m t s dòng cây chuy n gen Các dòng cây này có sinh trư ng in vitro bình... nghiên c u chuy n gen khoai tây b ng Agrobacterium tumefaciens và phân tích s di truy n c a genome b ng phương pháp RAPD ð chuy n gen và s n ñ nh tăng h th ng khoai tây tái sinh, 4 gi ng khoai tây ñã ñư c chuy n gen s d ng Agrobacterium tumefaciens mang gen β-glucuronidase (GUS) K t qu thu ñư c ch i cao nh t c a gi ng Spunta cv Nuôi c y mô thân cho k t qu t o callus cao hơn và tái sinh sau chuy n gen. .. i gen ñã ñư c nghiên c u, tr ng và phát tri n ngày càng m nh m Tuy nhiên nư c ta cây chuy n gen m i ch ñư c b t ñ u nghiên c u trong nh ng năm g n ñây và ñ i tư ng nghiên c u cũng còn h n ch 2.5 Các nghiên c u v tái sinh invitro và chuy n gen cây khoai tây 2.5.1 Các nghiên c u trên th gi i H u h t các nghiên c u tái sinh cây khoai tây trên th gi i ñ u ch y u ph c v m c ñích là chuy n gen và dung h... (1987), nghiên c u chuy n gen vào t bào c khoai tây nh Agrobacterium tumefaciens và Ti Plasmici DNA K t qu ñư c ch ra như sau: Nh ng kh i u hình thành c khoai tây là k t qu c a s xâm nhi m v i Agrobacterium tumefaciens KU-12 Và t ñó thu ñư c cây tái sinh, ñã nh n ra r ng ho t ñ ng c a lysopine dehydrogenase (LpDH) có m t trong s hình thành kh i u c a cây Trong các cây tr ng có khoai tây là cây hai... th i cho vi c tái sinh cây và cho nghiên c u chuy n n p gen ( khía c nh c n s tái sinh cây thông qua mô s o) là môi trư ng MS có 0,5mg/l NAA và 1mg/l BA Và ñã nh n ñư c 3 dòng cây cúc mang gen ipt, gen hph và gen gusA S hi n di n c a chúng ñã ñư c ki m tra b ng phân tích PCR [12] M t s nghiên c u hư ng ñ n kh năng t o v c xin vi m gan B t cây tr ng, Qua s d ng phương pháp chuy n gen b ng vi khu n Agrobacterium. .. Nhóm tác gi , Lê T n ð c, Nguy n H u H , Nguy n Văn Uy n, nghiên c u c u trúc vector plasmid mang gen kháng sâu và ng d ng trong t o gi ng cây tr ng chuy n gen thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens V i vi c s d ng vi khu n Agrobacterium tumefaciens EHA 105 mang plasmid ITB ñ chuy n gen, ñã nh n ñư c m t s dòng cây hông và cây c i ng t chuy n gen, mang gen cryIA(c) kháng sâu xanh Heliothis armigera... Nguy n Văn Uy n, xây d ng h th ng tái sinh in vitro cây ngô Zea mays L và bư c ñ u ng d ng trong chuy n n p gen t o protein gi u s t nh vi khu n Agrobacterium tumefaciens, Qua nghiên c u cho th y môi trư ng thích h p t o lo i mô v a mang kh năng tái sinh cao v a có th ñư c dùng cho nghiên c u chuy n n p gen là môi trư ng MS có 0,5mg/l 2,4-D và 1mg/l BA Qua chuy n gen nh vi khu n Agrobacterium tumefaciens. .. nhi u nghiên c u v tái sinh khoai tây trên th gi i Sang Ho Chung and Woong Seop Sim (1987) ñã nghiên c u tái sinh và chuy n gen vào 2 gi ng khoai tây Dejima và Superior nh vi khu n A tumefaciens KU-12 và Ti plasmid DNA(pTi-12) vào mô thân cây khoai tây K t qu cho th y, mô thân chuy n gen ñư c c m ng và tái sinh trên môi trư ng không có ch t ñi u ti t sinh trư ng do s có m t c a lysopine dehydrogenase