TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC XÁC ĐỊNH TYPE VI KHUẨN PASTURELLA MULTOCIDA BẰNG KỸ THUẬT PCR Giáo viên hướng dẫn: TS. VŨ NGỌC BỘI Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ DUYÊN MSSV : 47135059 NHA TRANG, 2009 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, trước tiên em xin gửi tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học lòng biết ơn, niềm tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Lòng biết ơn sâu sắc xin được giành cho thầy TS. Vũ Ngọc Bội – Phó Giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, TS. Lê Lập – Trưởng bộ môn Nghiên cứu vi trùng Phân viện Thú y miền Trung, Ths. Đào Duy Hưng, Bác sĩ Đặng Thanh Hiền, Bác sĩ Trương Công Thôi – Bộ môn nghiên cứu vi trùng Phân viện Thú y miền Trung. Xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đức Tân – Viện trưởng Phân viện Thý y miền Trung, cùng toàn thể các cán bộ tại Phân viện Thú y miền Trung đã tạo điều kiện giúp đỡ trong thời gian thực tập vừa qua. Xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa – Giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Ths. Khúc Thị An – Quyền trưởng bộ môn Công nghệ sinh học, cùng toàn thể quí thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã giảng dạy, tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập vừa qua. Em xin được bày tỏ lòng biết ơn cha mẹ và bạn bè đã ủng hộ, động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đồ án tôt nghiệp này. Nha Trang, ngày tháng năm 2009 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Duyên Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi LỜI NÓI ĐẦU i PHẦN I: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3 1.1. Các nghiên cứu trong và ngoài nước 3 1.1.1. Các nghiên cứu trong nước 3 1.1.2. Các nghiên cứu ngoài nước 4 1.2.Vi khuẩn P. multocida 6 1.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn 6 1.2.1.1. Phân loại vi khuẩn 6 1.2.1.2. Đặc điểm về hình thái của vi khuẩn 7 1.2.2. Đặc tính nuôi cấy 8 1.2.2.1. Trong môi trường nước thịt 8 1.2.2.2. Trên môi trường thạch thường 8 1.2.2.3. Trên môi trường thạch máu 9 1.2.2.3. Trên môi trường thạch huyết thanh 9 1.2.2.4. Trên môi trường thạch MacConkey 10 1.2.3. Đặc tính sinh hóa của P. multocida 11 1.3. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P. multocida 12 1.3.1. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P. multocida 12 1.3.2. Phân loại kháng nguyên thân và kháng nguyên giáp mô 13 1.3.2.1 Phân loại kháng nguyên giáp mô (kháng nguyên vỏ) 14 1.3.2.2. Kháng nguyên thân 15 1.3.3. Đặc điểm kháng nguyên giáp mô và kháng nguyên thân của P. multocida 16 1.3.3.1. Type A 16 1.3.3.2. Type B 17 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m iii 1.3.3.3. Type D của vi khuẩn P. multocida 17 1.4. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn P. multocida 18 1.4.1. Đối tượng gây bệnh 18 1.4.2. Sức đề kháng của vi khuẩn 20 1.4.3. Cơ chế gây bệnh của P. multocida 21 1.4.3. Dịch tễ của bệnh do P. multocida 22 1.4.4. Các con đường lây nhiễm 23 1.4.5. Triệu chứng và bệnh tích 24 1.4.5.1. P. multocida gây bệnh trên đối tượng trâu, bò 24 1.4.5.2. P. multocida gây bệnh trên đối tượng gà 25 1.4.5.3. Bệnh trên đối tượng lợn 26 1.4.6. Điều trị và phòng bệnh 26 1.4.6.1.Biện pháp phòng bệnh 26 1.4.6.2. Biện pháp điều trị bệnh 27 1.5. Một số phương pháp định type vi khuẩn 27 1.4.1. Phương pháp phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu 28 1.4.2. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 28 1.4.2.1. Nguyên lý của phản ứng PCR 28 1.4.2.2 Các bước của phản ứng PCR 29 PHẦN II:NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Nội dung nghiên cứu 31 2.2. Đối tượng nghiên cứu 31 2.3. Nguyên liệu, vật liệu dùng tron nghiên cứu 31 2.3.1. Nguyên liệu để tiến hành các phản ứng xác định đặc tính sinh vật: 31 2.3.2. Nguyên liệu để tiến hành các phản ứng xác định đặc tính sinh hóa: 31 2.3.3. Nguyên liệu để tiến hành phản ứng PCR 32 2.4. Phương pháp nghiên cứu 32 2.4.1. Xác định đặc tính sinh vật 32 2.4.1.1. Phương pháp nhuộm Gram 32 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m iv 2.4.1. 2. Kiểm tra đặc tính sinh trưởng của vi khuẩn trên các môi trường thạch 33 2.4.2. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn 33 2.4.2.1. Thử nghiệm oxidase 33 2.4.2.2. Kiểm tra đặc tính sinh hóa trên môi trường 3 ống nghiệm 34 2.4.2.3. Kiểm tra khả năng lên men một số loại đường đơn khác 35 2.4.2.4. Phản ứng O-F 35 2.4.3. Phản ứng PCR 37 2.4.3.1. Bước tách chiết DNA 37 2.4.2. Bước tiến hành phản ứng PCR 38 2.4.3. Bước điện di 39 PHẦN III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1. Đặc tính sinh vật hóa học 40 3.1.1. Đặc tính sinh vật 40 3.1.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa 42 Để tiến hành xác định 12 chủng nghiên cứu là vi khuẩn P. multocida chúng tôi tiến hành thử nghiệm đặc tính oxiadase, thử nghiệm các đặc tính sinh hóa trên môi trường 3 ống nghiệm của Lassen, và khả năng lên men một số loại đường đặc trưng. Kết quả thu được được thể hiện qua một số hình ảnh sau: 42 3.2. Phản ứng PCR 46 3.3. Xác định type của vi khuẩn P. multocida 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 1. Kết luận 50 2. Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Hệ thống định type và các type huyết thanh của vi khuẩn P. multocida hiện nay 16 Bảng 1.2: Các serotype gây bệnh chủ yếu trên động vật 20 Bảng 2.1: Các cặp mồi sử dụng để tiến hành phản ứng đối với P. multocida 32 Bảng 2.2 : Thành phần các chất tham gia phản ứng O-F 36 Bảng 2.3: Tỷ lệ các thành phần tham gia phản ứng PCR 38 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 38 Bảng 3.1: Các đặc tính sinh vật của P. multocida 40 Bảng 3.2: Kết quả đặc tính sinh hóa của vi khuẩn P. multocida 44 Bảng 3.3: Kết quả định type vi khuẩn P. multocida bằng kỹ thuật PCR 48 của vi khuẩn P. multocida 49 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1: Hình thái vi khuẩn P. multocida 41 Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn P. multocida trên môi trường thạch máu 41 Hình 3.3: Đặc tính sinh hóa của P. multocida 42 Hình 3.4: Phản ứng O-F của P. multocida. 43 Hình 3.5: Kết quả PCR xác định vi khuẩn P.multocida 46 Hình 3.6: Kết quả đọc điện di gene mã hóa cho type A, type B 49 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m 1 LỜI NÓI ĐẦU Chăn nuôi gia súc gia cầm đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế của Việt Nam. Riêng năm 2008 ước tính tổng sản lượng thịt trâu, bò khoảng gần 300 nghìn tấn, sản lượng sữa khoảng 262, 2 nghìn tấn, sản lượng thịt lợn khoảng 2,5 triệu tấn, và sản lượng thịt gia cầm khoảng 417 nghìn tấn. Trong 4 tháng đầu năm 2009, tình hình chăn nuôi gia súc gia cầm ổn định. Đàn bò cả nước ước tính tăng từ 1% đến 2% so với cùng kỳ năm trước, đàn lợn tăng 3% đến 4%, đàn gia cầm tăng 6% đến 7%. Nhưng dịch bệnh như lở mồm long móng ở trâu bò, heo tai xanh, cúm gia cầm vẫn xảy ra. Riêng tụ huyết trùng do Pasteurella multocida (P. multocida) trên trâu bò, lợn vẫn xảy ra rải rác tại một số tỉnh: Cao Bằng, Bắc Cạn, Tuyên Quang, Nghệ An, Quảng Trị, Tây Ninh, Kon Tum, Bạc Liêu…[2]. Bệnh tụ huyết trùng thể bại huyết xuất huyết là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở trâu bò. Bệnh do vi khuẩn P. multocida serotype B:2 gây ra (chủ yếu lưu hành ở Châu Á) và serotype E:2 (lưu hành ở Châu Phi) (theo De Alwis, 1999), P. multocida serotype B:2 liên quan đến bệnh tụ huyết trùng ở lợn cũng đã được một số tác giả báo cáo (Gamage và cộng sự, 1995; Verma, 1991; Towsend và cộng sự, 1998). P. multocida serotype A:1 được xác định là gây bệnh tụ huyết trùng ở gà tại Việt Nam (K. A. Brogden, 2001). Với mục đích xác định vi khuẩn P. multocida nhằm phục vụ công tác phòng và chống dịch bệnh có hiệu quả, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xác định type vi khuẩn Pasteurella multocida bằng phản ứng PCR” với nội dung như sau: 1) Xác định vi khuẩn P. multocida thông qua một số đặc tính sinh vật, sinh hóa của vi khuẩn. 2) Xác định vi khuẩn P. multocida bằng kỹ thuật PCR. 3) Định type A, B, D của vi khuẩn P. multocida bằng kỹ thuật PCR. Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m 2 Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo này chắc chắn sẽ còn hạn chế. Em kính mong nhận được sự góp ý của quí thầy cô và bạn bè để nghiên cứu thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn. Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m 3 PHẦN I: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Các nghiên cứu trong và ngoài nước 1.1.1. Các nghiên cứu trong nước Theo Phan Thanh Phượng và cộng sự (2000), khi tiến hành định type trên 17 chủng P. multocida phân lập được từ trâu, bò tại miền Trung và 11 chủng P.multocida phân lập được từ trâu, bò tại miền Bắc, trong đó ứng dụng kỹ thuật PCR là kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao để định type vi khuẩn. Kết quả chỉ có một chủng trong số 17 chủng phân lập từ miền Trung không cho hình ảnh PCR đặc hiệu của type B gây bại huyết xuất huyết, tất cả các chủng còn lại đều cho hình rất đặc trưng của type B. Bằng kỹ thuật Western blot với các kháng huyết thanh đặc hiệu, tác giả cũng đã xác định được chủng còn lại thuộc type D. Theo Trần Xuân Hạnh và cộng sự (2002)[1], đã tiến hành thí nghiệm PCR với hai cặp mồi HSB và CAPB trên đối tượng vi khuẩn P. multocida phân lập từ lợn tại Việt Nam, trong đó cặp mồi HSB được K.M.Townsend và cộng sự công bố vào năm 1998, và cặp mồi CAPB cũng do chính tác giả thông báo vào năm 2001. Hai cặp mồi này đặc hiệu cho các chủng P. multocida thuộc serotype B:2, B:5 hoặc B:2,5. Trong 32 chủng P. multocida thực hiện phản ứng PCR có 19 chủng đã dương tính với HSB (HSB-PCR), tuy nhiên, trong số này lại chỉ có 8 chủng dương tính với CAPB (CAPB- PCR). Những chủng P. multocida dương tính với HSB-PCR mà âm tính với CAPB-PCR đều cho kết quả dương tính với lactose. Bằng phản ứng với Acriflavine (Carter và Subronto, 1973) và kỹ thuật PCR với cặp mồi là CAPD (cặp mồi đặc hiệu cho P. multocida type D), các chủng này đã được xác định thuộc type D. Vì hiện tượng dương tính khi chạy HSB-PCR với một số chủng Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m [...]... type 1 Carter (1955) [9], định type vi khuẩn P multocida bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp (Indirect haemagglutination) đã xác định được 4 type vi khuẩn P multocida Carter đã ký hiệu các type bằng chữ (4 type tương ứng là A, B, C, D) Sau đó, Carter xác định được chủng P multocida gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò tại Châu Phi không thuộc vào type nào trong số các type đã được phân loại,... a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k c h a n g e Vi e N y c 1.3 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P multocida 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P multocida Những kỹ thuật chẩn đoán quan trọng như sử dụng kính hiển vi điện tử, sử dụng các phương pháp phân tích DNA của vi khuẩn đã làm sáng tỏ những tác nhân gây độc của P multocida Các yếu tố gây độc chủ yếu của vi khuẩn P multocida. .. -tr a c k c h a n g e Vi e N y c (1990), tại Ấn Độ các serotype A:1, A:3 cũng đã được báo cáo là tìm thấy ở trâu, bò Theo Kirsty.M Townsend và cộng sự (1998)[18], khi dùng kỹ thuật phân tử để xác định gene mã hóa cho vi khuẩn P multocida và gene mã hóa các type A, B, D, E, F cho thấy phản ứng PCR có độ đặc trưng cao, và cho kết quả phù hợp với kết quả xác định type thông thường (bằng các phương pháp... bu bu y N O W ! XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k c h a n g e Vi e N y c CAPB-FWD: 5’ -CATTTATCCAAGCTCCACC- 3’ CAPB-REV: 5’ -GCCCGAGAGAGTTTCAATCC- 3’ Cả hai cặp mồi HSB và CAPB đều được dùng để xác định những chủng thuộc serotype B 1.2 .Vi khuẩn P multocida 1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn 1.2.1.1 Phân loại vi khuẩn Vi khuẩn P multocida được tìm thấy đầu tiên vào năm 1878... Màng ngoài và toàn bộ thành phần protein của P multocida là cơ sở để định type vi khuẩn (Dabo và cộng sự, 1999; Davies và cộng sự, 2003) 1.3.3 Đặc điểm kháng nguyên giáp mô và kháng nguyên thân của P multocida 1.3.3.1 Type A Cho đến nay, mới chỉ có lớp vỏ của các vi khuẩn P multocida thuộc type A là được xác định khá đầy đủ về thành phần cấu tạo Vỏ của chủng type A có thành phần acid hyaluronic (hyaluronan)(Carter... có type F không cho kết quả phù hợp) Các nghiên cứu sử dụng các phương pháp thông thường để định type cho vi khuẩn trước đó đã thu được những kết quả không rõ ràng và đang gây nhiều tranh cãi giữa các nhà nghiên cứu, Kirst.M.Townsend thực hiện thí nghiệm bằng phương pháp PCR đã xác định được chính xác các chủng P multocida cho kết quả nghi ngờ thuộc type A Multiplex PCR cũng giúp phân biệt giữa type. .. multocida tồn tại ở dạng cầu khuẩn, bắt màu hai cực, đặc biệt là nhuộm với Leishman hoặc Methylene blue Carter (1967)[10], cho rằng vi khuẩn P multocida khi tồn tại trong máu động vật thường chỉ có một hình dạng nhất định, còn trong môi trường nhân tạo vi khuẩn nuôi cấy thường đa hình dạng: có vi khuẩn hình trứng, có vi khuẩn hình cầu Trong một canh khuẩn nuôi cấy có thể thấy một số vi khuẩn hình que, một số... (1999), các chủng vi khuẩn P multocida hình thành các dạng khuẩn lạc khác nhau, vi khuẩn thuộc type A sinh khuẩn lạc lớn nhất, khuẩn lạc có màu từ trắng đến hơi xám, nhầy Khuẩn lạc có dạng tròn, lồi, mọc riêng rẽ, và thường ướt Khuẩn lạc thuộc type D thường nhầy Hình thái của khuẩn lạc của type B, type E cũng phụ thuộc vào lớp vỏ, có kích thước không đồng nhất, và có màu xám hơn khuẩn lạc khác Theo nhiều... XC er O W F- w PD h a n g e Vi e ! XC er PD F- c u -tr a c k c h a n g e Vi e N y c 1.4 Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn P multocida 1.4.1 Đối tượng gây bệnh Mặc dù vi c ứng dụng những kỹ thuật chẩn đoán và những nghiên cứu về bệnh ở cả động vật và vi khuẩn dễ dàng, nhưng vi c nhiễm P multocida vẫn diễn ra ở các loài vật nuôi (ở hầu hết các động vật có vú, chim), thậm chí vi khuẩn còn sinh độc tố gây độc... tên vi khuẩn theo vật chủ: chủng phân lập từ trâu, bò: Pasteurella boviseptica; chủng vi khuẩn phân lập từ lợn: Pasteurella suiseptica; vi khuẩn phân lập từ gia cầm: Pasteurella aviseptica Topley và Winsol (1929), đã đặt lại tên vi khuẩn thành Pasteurella septica, sau đó Rosenbach và Merchant (1939) đổi tên thành Pasteurella multocida [27] Theo Bergey (1994)[12] các đơn vị phân loại loài của vi khuẩn . tài: Xác định type vi khuẩn Pasteurella multocida bằng phản ứng PCR với nội dung như sau: 1) Xác định vi khuẩn P. multocida thông qua một số đặc tính sinh vật, sinh hóa của vi khuẩn. 2) Xác định. sinh vật của P. multocida 40 Bảng 3.2: Kết quả đặc tính sinh hóa của vi khuẩn P. multocida 44 Bảng 3.3: Kết quả định type vi khuẩn P. multocida bằng kỹ thuật PCR 48 của vi khuẩn P. multocida 49 Click. sinh vật, sinh hóa của vi khuẩn. 2) Xác định vi khuẩn P. multocida bằng kỹ thuật PCR. 3) Định type A, B, D của vi khuẩn P. multocida bằng kỹ thuật PCR. Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e