i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Duy, ThS. Khúc Thị An, Ths. Nguyễn Kim Cúc, đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và động viên tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài này. Cô Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm, đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi có thể thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm thực hành một cách tốt nhất. Xin cảm ơn các quý thầy, cô trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy, truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập, để tôi có thể tích lũy được kiến thức để thực hiện được đồ án, và xa hơn là phục vụ cho những chặng đường tiếp theo sau khi rời ghế nhà trường Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn lớp, 50Sh, 50MT, 50 TP2, các anh, chị cao học, anh Nguyên, anh Đảm, chị Xuân, và tất cả các anh chị, các bạn, cùng thực hiện đề tài với tôi tại phòng thí nghiệm, đã cùng chia sẻ bao nhiêu buồn vui của việc làm đề tài và hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua. Cuối cùng, cho tôi được gửi lời cảm ơn đến ba mẹ tôi, đã hỗ trợ tôi về mặt tinh thần, cho tôi lời khuyên cũng như san sẻ gánh nặng cho tôi trong 4 năm học và thực hiện đề tài. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn vì sự quý báu đó ! ii LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU ix CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1. Tổng quan về Bacillus 1 1.1.1. Đặc điểm chung về Bacillus 1 1.1.2. Những ứng dụng của Bacillus 1 1.2. Tổng quan về Probiotic trong nuôi trồng thủy sản 3 1.2.1. Khái niệm probiotic 3 1.2.2. Lịch sử nghiên cứu Probiotic trong nuôi trồng thủy sản 3 a/ Lịch sử nghiên cứu về probiotic 3 b/ Lịch sử nghiên cứu probiotic trong nuôi trồng thủy sản 4 1.2.3. Ứng dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản 6 1.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm trong nuôi trồng thủy sản. 7 1.3.1. Ở Việt Nam 8 1.3.2. Trên thế giới 8 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1. Vật liệu 11 2.1.1. Chủng vi sinh vật 11 2.1.2. Môi trường hóa chất chuyên dụng 11 2.1.3. Thiết bị chuyên dụng 15 iii 2.2. Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1. Nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật 15 2.2.2. Xác định khả năng sinh trưởng 16 2.2.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn 17 2.2.4. Xác định đặc điểm hình thái 19 2.2.5. Định danh vi khuẩn 19 2.2.6. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 20 a/ Bố trí thí nghiệm thay thế nguồn cacbon 20 b/ Bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn nitơ thay thế 21 c/ Bố trí thí nghiệm khảo sát giá trị pH thích hợp 21 d/ Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ muối thích hợp 22 e/ Bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 22 2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện lên men trong hệ thống lên men tự động BIO FLO 110 22 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1. Xác định khả năng sinh trưởng 23 3.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn 25 3.3. Mô tả đặc điểm hình thái 27 3.4. Định danh chủng B 3.7.1 31 3.5. Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp 33 3.5.1. Khảo sát thay thế nguồn cacbon 33 3.5.2. Khảo sát nguồn nitơ thay thế 33 3.5.3. Khảo sát pH thích hợp 34 3.5.4. Kết quả khảo sát nồng độ muối thích hợp 34 3.5.5. Kết quả khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 36 iv 3.6. Khảo sát lên men của chủng B 3.7.1 trên hệ thống BIO FLO 110 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 Tài liệu tham khảo 40 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Ảnh đại diện Bacillus 1 Hình1.2 . Bào tử Bacillus 1 Hình 2.2.1. Sơ đồ xác định khả năng sinh trưởng 18 Hình 2.2.2. Các bước xác định hoạt tính kháng khuẩn 19 Hình 2.2.3. Đo kích thước vòng kháng 20 Hình 2.2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn cacbon thay thế 22 Hình 2.2.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn nitơ thay thế 23 Hình 3.1.1. Đường cong sinh trưởng của chủng B 3.10.1 25 Hình 3.1.2. Đường cong sinh trưởng của chủng B 3.10.2 25 Hình 3.1.3. Đường cong sinh trưởng của chủng B 3.7.1 26 Hình 3.1.4. Đường cong sinh trưởng của chủng B 3.7.4 26 Hình 3.2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của B3.7.1 và B3.10.1 đối với Vibrio V1.1 27 Hình 3.2.2. Hoạt tính kháng khuẩn của B 3.7.4 và B 3.10.2 đối với Vibrio V1.1 27 Hình 3.2.3. Hoạt tính kháng khuẩn của B 3.7.1 và B 3.10.1 đối với Vibrio V3.3 28 Hình 3.2.4. Hoạt tính kháng khuẩn của B 3.7.4 và B 3.10.2 đối với Vibrio V3.3 28 Hình 3.3.1. Khuẩn lạc chủng B 3.7.1 30 Hình 3.3.2. Tế bào chủng B 3.7.1 nhuộm Gram 30 Hình 3.3.3. Khuẩn lạc chủng B 3.7.4 31 Hình 3.3.4. Tế bào chủng B 3.7.4 nhuộm Gram 31 Hình 3.3.5. Khuẩn lạc chủng B 3.10.1 32 Hình 3.3.6. Tế bào chủng B 3.10.1 nhuộm Gram 32 Hình 3.3.7. Khuẩn lạc chủng B 3.10.2 33 Hình 3.3.8. Tế bào chủng B 3.10.2 nhuộm Gram 33 Hình 3.4.1. Trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.7.1 34 Hình 3.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng của các chủng thử nghiệm 36 Hình 3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của các chủng thử nghiệm 37 vi Hình 3.5.3. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng thử nghiệm 37 Hình 3.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.7.1 38 Hình 3.5.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.7.4 38 Hình 3.5.6. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.10.1 39 Hình 3.5.7. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.10.2 39 Hình 3.5.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng của 2 chủng B 3.7.4 và B 3.10.2 40 Hình 3.5.9. Khảo sát lên men chủng B 3.7.1 trên hệ thống BIO FLO 110 40 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kích thước vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus với các chủng Vibrio 29 Bảng 3.2. So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng Bacillus sp. B3.7.1 với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 35 viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Viết đầy đủ 1 FAO Food and Agriculture Organization – Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc 2 WHO World Health Organizatin – Tổ chức Y tế thế giới 3 Ct Công thức tính lượng dịch hoạt hóa 4 OD Optical Density (Mật độ quang) 5 TSB Trypticase Soy Broth 6 LB Luria Broth 7 T Kết quả thời gian nuôi khảo sát 8 NTTS Nuôi trồng thủy sản ix MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Ở nước ta hiện nay, nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản là một trong những tiềm năng và thế mạnh, năm 2010 tổng sản lượng nuôi 2.7 triệu tấn, diện tích nuôi đạt 1.110.000 ha, sản lượng đạt 3,1 triệu tấn (theo thống kê của Tổng cục Thủy sản). Tuy nhiên, trong ngành nuôi trồng thủy sản, mỗi năm cũng gặp rất nhiều khó khăn và thiệt hại, gây tổn thất lớn cho người nuôi do vấn đề về dịch bệnh trên thủy sản gây ra. Hầu hết người nuôi thường sử dụng các loại hóa chất khử trùng hoặc kháng sinh để phòng bệnh. Tuy nhiên hiệu quả của phương pháp này không cao, đồng thời còn gây ảnh hưởng đến môi trường. Nguy hiểm hơn nếu lạm dụng chất kháng sinh sẽ gây ra dư lượng kháng sinh trong sản phẩm và hiện tượng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản. Vì vậy, việc tìm ra một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng. Trên thị trường thuốc và chế phẩm nuôi trồng thủy sản của nước ta những năm gần đây, xuất hiện một cái tên mới được sử dụng, đó là “ Probiotic”. Các chủng vi sinh vật như là Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp., clostridium sp., được sử dụng trong hầu hết các chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản hiện nay. Giúp giảm thiểu những bất lợi do hóa chất gây ô nhiễm môi trường được sử dụng trong quá trình nuôi, hoặc hạn chế sử dụng các loại kháng sinh vì có thể gây nhờn thuốc. Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những đặc tính probiotic: đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, sinh các enzyme tiêu hóa, phân hủy các chất hữu cơ thừa … đã được áp dụng. Các chế phẩm sinh học không những tăng cường khả năng sinh trưởng, khả năng kháng bệnh cho vật nuôi mà còn hạn chế được tối đa việc sử dụng kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh. Nhiều nhóm vi sinh vật mang các đặc tính probiotic đã được sử dụng, trong đó có nhóm vi khuẩn Bacillus. Vì lý do trên, trong khuôn khổ của một luận án tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và lên men vi khuẩn Bacillus thu sinh khối nhằm sản xuất chế phẩm probiotic thủy sản” là cấp thiết. Mục tiêu của đề tài: Khảo sát điều kiện nuôi cấy và thu sinh khối của các chủng Bacillus có khả năng kháng khuẩn, mô tả, định danh các chủng đó, ứng dụng vào sản xuất chế phẩm probiotic, nhằm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Nội dung thực hiện: - Xác định đặc điểm sinh trưởng của các chủng Bacillus x - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng Bacillus với các chủng Vibrio gây bệnh - Xác định đặc điểm hình thái của các chủng có hoạt tính probiotic - Định danh các chủng có hoạt tính probiotic - Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp của các chủng có hoạt tính probiotic - Khảo sát điều kiện lên men các chủng có hoạt tính trong hệ thống lên men BIO FLO 110 Sinh viên thực hiện [...]... sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh và nhiều nơi đã làm quen với vi c sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá tốt  Tác dụng của nhóm vi khuẩn probiotic ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản được Ts Nguyễn Văn Duy và cộng sự, (2011); Lê Thị Bích Phượng và cộng sự, (2003); Lê Tấn Hưng và cộng sự, (2003); Võ Thị Hạnh và cộng sự, )2004) nghiên cứu và thử nghiệm... xác định được hoạt động ức chế của Lactobacillus sp trên nhóm Vibrio, E.coli và Staphylococcus sp 1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm trong nuôi trồng thủy sản 8 1.3.1 Ở Vi t Nam Các nghiên cứu ở Vi t Nam đều sử dụng các chủng của Bacillus và kết hợp với các chủng khác để làm thức ăn thủy sản Một trong những cơ chế hoạt động của men vi sinh là các men có tác dụng phân hủy... rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi b/ Lịch sử nghiên cứu probiotic trong nuôi trồng thủy sản - Các nghiên cứu trong nước  Ở Vi t nam, những nghiên cứu về vi c sử dụng men vi sinh để cải thiện môi trường nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng còn tương đối ít Trong những năm gần đây, Bộ Thủy sản đã cho... dụng probiotic sẽ góp phần làm giảm lượng hóa chất, kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho tôm cá Probiotic được gọi dưới tên khác nhau như Chế phẩm vi sinh , Vi khuẩn có lợi” hoặc Vi sinh vật hiệu quả”, bao gồm các loại vi khuẩn Lactobacillus, Actinomycetes, Nitrobacteria, vi khuẩn chuyển hóa đạm, Bifidobacterium, nấm men Những vi khuẩn hữu ích này có thể cải thiện chất lượng nước nuôi thủy sản và. .. Những nhóm vi khuẩn probiotic có tềm năng được sử dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản là: Lactobacillus, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Moraxella… Thành phần vi sinh trong NTTS gồm những sản phẩm chính là sử dụng các nhóm vi sinh vật sống như: : Lactobacillus, Pseudomonas, Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter… 5  Các nghiên cứu của Ts.Nguyễn Văn Duy và cộng sự,... nước và giảm mùi hôi (Võ Thị Thứ và cộng sự, 2005) - Các nghiên cứu ngoài nước  Theo Nair và cộng sự, (1985) vi khuẩn lactic và một số nhóm vi khuẩn có khả năng tiết ra các chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus  Theo nghiên cứu của Foster và cộng sự (1991) sử dụng vi khuẩn phân lập từ đất PM-4 cho vào môi trường ương nuôi ấu trùng Penaeus monodon, và. .. chủng vi sinh vật thu c Bacillus có khả năng sinh trưởng và phát triển cạnh tranh và kháng với các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên đối tượng tôm sú  Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự, (2000) tìm hiểu tác dụng của men vi sinh Bio-dream lên các yếu tố vô sinh và hữu sinh trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh với liều lượng 1g/m3 Theo như thí nghiệm, so sánh giữa không sử dụng và sử... sản, gia cầm, gia súc (Liao, và cộng sự, 1992) Theo nghiên cứu của (Logan và Bartlett, 1998) vi c bổ sung một số lượng nhất định các chủng vi khuẩn Bacillus lentimorbus, Bacillus stearothermophilus vào hồ nuôi thủy sản tập trung có tác dụng làm tăng sản lượng cá đến 25% 11 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Chủng vi sinh vật Các chủng Bacillus, và Vibrio được lấy từ bộ sưu... nguyên nhân gây ra cái chết đột ngột của một số sâu tơ Ông là người đầu tiên phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis, và gọi đó là Bacillus sotto Năm 1911, Bernard người Đức, tìm thấy trong một xưởng bột mì ở Thuringia, một giống vi khuẩn ký sinh trong cơ thể côn trùng, có sức trừ sâu rất mạnh, gọi là khuẩn Thuring 1971, chế phẩm Bacillus thuringiensis đã được nghiên cứu và sử dụng và phát triển cho tới... trùng do chúng có khả năng ức chế mầm bệnh  Qiao Zhenguo và cộng sự (1994) nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp sử dụng cho nuôi tôm thẻ Trung Quốc ( Penaeus chinensis) dùng cho cải thiện chất lượng môi trường nước  Năm 1995, Gariques và Arevalo đã tóm lược quy trình sản xuất sử dụng các chủng vi khuẩn probiotic Vibrio alginolyticus điều khiển hệ vi khuẩn trong vi c sản xuất giống tôm Penaeus vannamei . cứu điều kiện nuôi cấy và lên men vi khuẩn Bacillus thu sinh khối nhằm sản xuất chế phẩm probiotic thủy sản là cấp thiết. Mục tiêu của đề tài: Khảo sát điều kiện nuôi cấy và thu sinh khối. nhiều chế phẩm vi sinh và nhiều nơi đã làm quen với vi c sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá tốt.  Tác dụng của nhóm vi khuẩn probiotic ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học. nghiên cứu Probiotic trong nuôi trồng thủy sản 3 a/ Lịch sử nghiên cứu về probiotic 3 b/ Lịch sử nghiên cứu probiotic trong nuôi trồng thủy sản 4 1.2.3. Ứng dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy