BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Kim Hoàng Thanh NGHIÊN CỨU ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP PHÒNG NGỪA MỐI NGUY VỀ AN TOÀN THỰC PHẨM CHO NGUYÊN LIỆU MỰC TRÊN TÀU ĐÁNH CÁ TẠI KIÊN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành Mã số Người hướng dẫn khoa học : Công nghệ sau thu hoạch : 60 54 10 : TS Đỗ Văn Ninh Nha Trang - 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận văn LỜI CẢM ƠN Để hồn thành Luận văn này, trước hết tơi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Chế biến kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc xin giành cho thầy: TS Đỗ Văn Ninh Phó Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang, tận tình hướng dẫn động viên tơi suốt trình thực luận văn Xin cảm ơn thầy, cô khoa Chế biến- trường Đại học Nha Trang thầy, cô phản biện cho lời khun q báu để cơng trình nghiên cứu hồn thành có chất lượng Đặc biệt, xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ của: Tập thể cán quan tra Sở Nông nghiệp Phát triển nông thôn Kiên Giang, thầy cô giáo trường Đại học Nha Trang, học viên lớp Cao học chuyên ngành Công nghệ Sau thu hoạch 2005 bạn bè luôn chia sẻ trình nghiên cứu MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU MỰC 1.1.1 Đặc điểm sinh học mực 1.1.2 Phân loại mực 1.1.3 Thành phần mực 1.1.3.1 Thành phần khối lượng mực 1.1.3.2 Thành phần hóa học mực 1.1.3.3 Sắc tố biến đổi màu mực 10 1.2 Những biến đổi mực trình bảo quản 10 1.2.1 Biến đổi mực sau chết 10 1.2.1.1 Giai đoạn tê cứng sau chết 10 1.2.1.2 Quá trình tự phân giải 12 1.2.1.3 Quá trình thối rữa 14 1.2.2 Biến đổi mực bảo quản lạnh 15 1.3 Các phương pháp bảo quản lạnh mực nguyên liệu 18 1.3.1 Bảo quản phương pháp làm lạnh 18 1.3.2 Bảo quản lạnh kết hợp hóa chất 19 1.4 Một số nghiên cứu mực 19 1.4.1 Các cơng trình nghiên cứu ngồi nước 19 1.4.2 Các cơng trình nghiên cứu nước 21 1.5 Thực trạng đánh bắt bảo quản mực tàu cá Kiên Giang 22 1.6 Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm nguyên liệu thủy sản nói chung, nguyên liệu mực nói riêng 25 1.7 Các mối nguy cần kiểm soát nguyên liệu mực trình bảo quản 27 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Đối tượng nghiên cứu 31 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.2.1 Phương pháp phân tích hố học 32 2.2.2 Phương pháp phân tích vi sinh 32 2.2.3 Xác định mối nguy vật lý 33 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 34 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng thể 34 2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tàu khai thác 35 2.3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trước chế biến nhà máy 36 2.4 Thiết bị dung nghiên cứu 37 2.5 Phương pháp lấy mẫu xử lý số liệu 38 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Thành phần dinh dưỡng mực ống nguyên liệu 39 3.2 Nghiên cứu phân tích mối an toàn thực phẩm nguyên liệu mực tàu khai thác 39 3.2.1 Mối nguy vật lý 39 3.2.2 Mối nguy vi sinh vật 40 3.2.2.1 Biến đổi vi sinh vật Coliforms có mặt nguyên liệu mực bảo quản nhiệt độ 1±1oC 40 3.2.2.2 Biến đổi vi sinh vật tổng số hiếu khí (TPC) có mặt ngun liệu mực bảo quản nhiệt độ 1±1oC 42 3.2.2.3 Biến đổi vi sinh vật Vibrio parahaemolyticus có mặt nguyên liệu mực bảo quản nhiệt độ 1±1oC 44 3.2.2.4 Biến đổi vi sinh vật Vibrio cholerae, Listeria, Salmonella, Shigella Staphylococcus nguyên liệu mực bảo quản nhiệt độ 1±1oC 46 3.2.3 Mối nguy hóa học 47 3.2.3.1 Biến đổi hàm lượng TVB-N có mặt nguyên liệu mực bảo quản nhiệt độ 1±1oC 47 3.2.3.2 Phân tích mối nguy thuộc nhóm kháng sinh chloramphenicol (CAP), Nitrofurans(AOZ, AMOZ) có mặt nguyên liệu mực bảo quản nhiệt độ 1±1oC 48 3.3 Nghiên cứu phân tích mối nguy an toàn thực phẩm nguyên liệu mực công ty cổ phần chế biến xuất thủy sản Kiên Giang 50 3.3.1 Mối nguy vật lý 50 3.3.2 Mối nguy vi sinh vật 50 3.3.2.1 Biến đổi vi sinh vật Coliforms có mặt nguyên liệu mực bảo quản thời gian ngày 50 3.3.2.2 Biến đổi vi sinh vật tổng số hiếu khí (TPC) có mặt nguyên liệu mực bảo quản thời gian ngày 52 3.3.2.3 Biến đổi vi sinh vật Vibrio parahaemolyticus có mặt nguyên liệu mực bảo quản thời gian ngày 53 3.3.2.4 Biến đổi vi sinh vật Vibrio cholerae, Listeria, Salmonella, Shigella Staphylococcus nguyên liệu mực bảo quản thời gian ngày 54 3.3.3 Mối nguy hóa học 55 3.3.3.1 Biến đổi hàm lượng TVB-N thời gian bảo quản ngày nhà máy 55 3.3.3.2 Kết phân tích thành dư lượng số hóa chất thường gặp trình bảo quản chế biến 57 3.4 Đề xuất số giải pháp phòng ngừa 58 3.4.1 Giải pháp phòng ngừa mối nguy vật lý 58 3.4.2 Giải pháp phòng ngừa mối nguy vi sinh vật 58 3.4.3 Giải pháp phòng ngừa mối nguy hóa học 60 3.4.4 Đề xuất qui trình bảo quản mực nguyên liệu tàu 62 3.4.5 Qui trình bảo quản mực nguyên liệu nhà máy 63 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 64 Kết luận 64 Đề xuất ý kiến 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC PHỤ LỤC CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH, HÓA SINH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CAP : Chloramphenicol BQND : Bảo quản nước đá BQNDHC : Bảo quản nước đá có sử dụng hóa chất EU : Liên minh Châu Âu HACCP : Hazard Analysis and Critical Control Points Pos : Dương tính ND : Khơng phát Neg : Âm tính NTRs : Nitrofuran (AOZ, AMOZ) TPC : Tổng số vi sinh vật hiếu khí TVB-N : Tổng base nitơ bay PAD : Phần ăn VSV : Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU TT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Thành phần khối lượng mực ống Bảng 1.2 Thành phần hóa học mực ống mực nang Bảng 1.3 So sánh thành phần hóa học mực với nguyên liệu khác Bảng 1.4 Thành phần dinh dưỡng mực ống Bảng 1.5 Hàm lượng lipid phận mực Bảng 1.6 Hàm lượng vitamin mực ống Bảng 1.7 Hàm lượng chất khoáng mực ống Bảng 1.8 Các dạng thực phẩm liên quan đến vụ dịch bệnh 26 Bảng 3.1 Thành phần hóa học mực ống 39 10 Bảng 3.2 Biến đổi số vi sinh vật mẫu nghiên cứu 46 Bảng 3.3 Bảng kết phân tích hàm lượng CAP, Nitrofurans có mặt nguyên liệu mực bảo quản tàu 49 11 12 Bảng 3.4 Biến đổi số vi sinh vật mẫu nghiên cứu 54 Bảng 3.5 Bảng kết phân tích hàm lượng CAP, Nitrofurans, Clorin, Sunfit natri nguyên liệu mực bảo quản nhà máy 57 13 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ TT Tên Hình Trang Hình 2.1 Hình ảnh bên ngồi mực ống (Loligo formosana) 31 Hình 2.2 Tủ cấy vi sinh AC- 311S 37 Hình 2.3 Thiết bị phân tích vi sinh tự động 37 Hình 2.4 Tủ ấm 38 Hình 3.1 Biến đổi vi sinh vật Coliforms có mặt nguyên liệu mực theo thời gian bảo quản 40 Hình 3.2 Biến đổi tổng số vi sinh vật hiếu khí có mặt ngun liệu mực theo thời gian bảo quản 42 Hình 3.3 Biến đổi vi sinh vật Vibrio parahaemolyticus có mặt nguyên liệu mực theo thời gian bảo quản 44 Hình 3.4 Biến đổi hàm lượng TVB-N có mặt nguyên liệu mực bảo quản tàu 47 Hình 3.5 Biến đổi vi sinh vật Coliforms có mặt nguyên liệu mực bảo quản thời gian ngày 51 10 Hình 3.6 Biến đổi vi sinh vật tổng số hiếu khí (TPC) có mặt ngun liệu mực bảo quản thời gian ngày 52 11 Hình 3.7 Biến đổi vi sinh vật Vibrio parahaemolyticus có mặt nguyên liệu mực bảo quản thời gian ngày 53 12 Hình 3.8 Biến đổi hàm lượng TVB-N nguyên liệu mực bảo quản thời gian ngày 56 - Thạch Hektoen Enteric (HEA) * Thuốc thử mơi trường sinh hóa: - Thuốc thử Oxydase - Thạch Triple Sugar Iron (TSI) - Môi trường Hugh Lefson - Kháng huyết Shigella: Shigella polyvalent nhóm A, B, C, D 5.5 Thiết bị chính: Tủ ấm 37.0±1.00C 5.6 Quy trình: + Tiền tăng sinh: Cân 25g mẫu cho vào túi vô trùng, thêm 225g TSB Sau dập mẫu, cần thiết chỉnh pH 7.0±0.2, ủ 37.0±1.00C 16-20 + Tăng sinh: Từ môi trường tăng sinh không chọn lọc, chuyển 0.1 ml sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường GN, ủ 37.0±1.00C 16-24 + Cấy chuyển: Từ môi trường GN, dùng que cấy ria cấy sang môi trường XLD HEA Lật ngửa đĩa, ủ 37.0±1.00C 48±6 + Đọc kết quả: - Trên mơi trường XLD: khuẩn lạc Shigella điển hình có màu đỏ suốt - Trên môi trường Hektoen Enteric Agar: Khuẩn lạc Shigella điển hình có màu xanh mơi trường xanh có sắc thái vàng, đục + Thử nghiệm sinh hóa: - Chọn mơi trường khuẩn lạc cấy chuyển sang mơi trường TSI, cách cấy sau: Trước hết cấy ria mặt nghiêng, sau đâm sâu xuống ống nghiệm, ủ ống TSI 37.0±1.00C 24 Trong trường hợp nghi ngờ trình lên men chậm nên ủ ống TSI thêm vài ngày - Trong ống TSI, Shigella cho màu đỏ mặt nghiêng màu vàng đáy ống không sinh H2S Nếu nghi ngờ vi khuẩn chưa nên cấy chuyển sang môi trường TSI lần Khẳng định thử nghiệm sinh hóa: Những thử nghiệm sinh hóa thực sau: TT THỬ NGHIỆM SINH HÓA BIỂU HIỆN CỦA SHIGELLA Simmon Citrate - Arginine Dacarboxylase - Lysine Decarboxydase - Urea - Malonate - MR + VP - Salicine - Xylose - 10 Cellobiose - 11 Adonitol - 12 Ducitol - 13 Inositol - Sự khác loài thực theo bảng sau: S dysenterriae S.flexneri S.boydii S.sonnei -1 Gas from glucose - - - Beta Galactosidase +/-1 - +/- + - - -1 + +/-2 +/-2 +/- - Omithin decarboxylase Indol Acid from -4 -4 - - Lactose - - - +3 Mannitol - + + + raffinose - +/- - +3 Saccharose - - - +3 Xylose - - +/- - Ducitol Chú ý: - Dòng S dysenteriae S Sonnei cho phản ứng dương tính - S.dysenteriae S flexneri ln ln âm tính, dịng S dysenteriae cho phản ứng dương tính - Phản ứng dương tính xảy sau 24 - S.dysenetriea A.flexneri cho phản ứng dương tính * Khẳng định kháng huyết thanh: Kháng huyết sử dụng thuộc nhóm B, C, D vi khuẩn thử nghiệm sau nuôi cấy môi trường rắn khơng chọn lọc 5.7 Báo cáo kết quả: Có hay khơng có Shigella 25g mẫu Xác định Vibrio cholorae Vibrio parahaemolyticus 6.1 Phạm vi áp dụng: Phương pháp tham chiếu theo Sổ tay phân tích vi sinh FDA tái lần thứ năm 1995 dùng để phát Vibrio cholorae Vibrio parahaemolyticus thực phẩm 6.2 Nguyên tắc: Phát Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus thực phẩm thực cách cân lượng mẫu, uôi ủ môi trường lỏng chọn lọc Từ môi trường này, cấy chuyển sang môi trường rắn chọn lọc Những khuẩn lạc giống Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus thử nghiệm sinh hóa 6.3 Mơi trường thuốc thử: - Thạch Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS Agar) - Peptone kiềm có 1% NaCl - Molility Medium - TSA + 1.5% NaCl - Thạch Triple Sugar Iron - ONPG - Thuốc thử Oxydase - O/129 Vibriostaticum dics containing 150 and 10µg 2.4 diamino 6.7 diisopropylteridine - Sytochrome Oxydase reagent - Arginine Dacarboxylase - Lysine Decarboxylase - Fermentation: sucrose, lactose, mannitol - Urease - Na desoxycholate 5% (String Test Solution) - KOH 6.4 Thiết bị chính: Tủ ấm 37.0±1.00C 6.5 Quy trình: + Tăng sinh: Cân 25g mẫu cho vào túi vô trùng, thêm vào 225ml APW Dập mẫu phút, ủ 37.0±1.00C 16-18 + Đổ đĩa đọc kết đĩa: Từ môi trường tăng sinh, cấy ria lên môi trường thạch TCBS , ủ 18-24 37.0±1.00C Trên môi trường TCBS Agar : - Khuẩn lạc V.cholerae trịn, lớn có đường kính 2-3mm, màu vàng - Khuẩn lạc V.parahaemolyticus trịn, lớn có đường kính 3-4mm, màu xanh + Thử nghiệm sinh hóa: Từ khuẩn lạc nghị ngờ TCBS, cấy chuyển sang mơi trường TSA có bổ sung 1.5% NaCl, ủ 37.0±1.00C 12-24 * Thử nghiệm sơ bộ: TEST Typical of Vibrio parahaemolyticus Typical of Vibrio cholerae TSI K/A -2 K/A -2 Motility test + + Oxydase test + + KOH test + + Typical of Vibrio parahaemolyticus Typical of Vibrio cholerae 0% NaCl 6% NaCl 8% NaCl 10% NaCl + + - + - Acid from: - Sucrose - Láctose - Mannitol + + + ONPG - + ADH - - LCD + + Urea - - Sentivity 10 µg O/129 150 µg O/129 R S S S * Khẳng định: TEST Xác định Listeria monocytogenes 7.1 Phạm vi áp dụng: Phương pháp tham chiếu theo NMKL 136-22nd ed-1999 áp dụng để kiểm tra Listeria monocytogenes thực phẩm 7.2 Định nghĩa: Listeria monocytogenes có hình gậy ngắn, mảnh, gram dương, catalase dương tính, chuyển động xoay tròn thành đợt tiêu giọt treo tạo hình dù phép thử tính di động (ở 20-250C) Có khả thủy giải esculin khả dung huyết β môi trường thạch máu Listeria monocytogenes tạo acid từ đường Rhamnose không tạo acid từ đường xylose 7.3 Nguyên tắc: Có thể chọn quy trình tăng sinh miêu tả Trong quy trình, mẫu đồng ủ canh tăng sinh chọn lọc Sau 24 cấy chuyển sang môi trường tăng sinh thứ với mức chọn lọc cao Quy trình bước, quy trình tăng sinh tiến hành qua bước song thời gian ủ dài Quy trình hai bước nên dùng cho mẫu bị nhiễm nặng Việc phân lập tiến hành môi trường chọn lọc, đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa dùng để định canh 7.4 Chủng chứng: - Listeria monocytogenes chủng chứng dương - Listeria innocua chủng chứng dương 7.5 Môi trường thuốc thử: + Canh tăng sinh LB I (hay UVM Listeria) - Môi trường - Dung dịch bổ sung - Dung dịch bổ sung + Canh tăng sinh LB II (hay UVM Listeria) Môi trường + Canh tăng sinh EB - Môi trường - Dung dịch bổ sung - Dung dịch bổ sung - Dung dịch bổ sung + Môi trường phân lập thạch Oxford Môi trường dung dịch bổ sung + Thạch máu + Canh BRAIN Heart infusion + Môi trường thử tính di động + Mơi trường phản ứng lân men đường 7.6 Dụng cụ thiết bị: Tủ ấm 25.0±1.00C, tủ ấm 30.0±1.00C, tủ ấm 37.0±1.00C 7.7 Tiến hành: + Tăng sinh: Cân 25g mẫu, thêm vào 225ml môi trường tăng sinh LBI, đồng mẫu khoảng 30 giây, ủ 300C 24±3 Chuyển 0.1ml từ môi trường tăng sinh LB I sang 10ml môi trường LB II, ủ 300C 24±3 + Phân lập: Dùng tăm vô trùng thấm dịch mẫu từ ống tăng sinh, cấy trang sang ½ đĩa mơi trường Oxford Agar, từ vệt cấy dùng que cấy ria sang ½ đĩa cịn lại Ủ 300C 24±3 (hoặc 24-48 giờ) Trên môi trường Oxford Agar khuẩn lạc Listeria spp đặc trưng bao quanh vòng đen Lập lại thao tác với môi trường Palcam, khuẩn lạc Listeria spp điển hình nhỏ màu xanh nâu, đơi có tâm đen, ln ln có quầng đen xung quanh Sau 48 tâm khuẩn lạc lõm xuống loại môi trường + Khẳng định: - Thử khả tan huyết: Chọn khuẩn lạc nghi ngờ môi trường thạch Oxford cấy chuyển sang môi trường thạch máu Ủ 37.0±1.00C 24-48 Trên môi trường thạch máu khuẩn lạc Listeria monocytogenes bao quanh vòng sáng hẹp tượng xung huyết dạng β Chuyển khuẩn lạc nghi ngờ Listeria monocytogenes sang môi trường canh thang không chọn lọc, ủ 25.0±1.00C 20 - Thử Catalase: Listeria monocytogenes catalase dương tính - Nhuộm gram: Listeria spp nhuộm gram dương - Thử khả di động phương pháp giọt treo: Listeria spp chuyển động nhào lộn canh trùng ủ 25.0±1.00C - Thử tính di động ống nghiệm: Cấy vi trùng bắng cách đâm sâu vào thạch mềm ống nghiệm, ủ 25.0±1.00C 40 lâu Kiểm tra phát triển xung quanh đường cấy đâm sâu Listeria spp di động tạo hình dù cách bề mặt thạch vài mm - Khả biến dưởng đường: Ủ ống canh trùng thử khả lên men đường 37.0±1.00C vòng ngày Kết dương tính (màu vàng) thường quan sát vịng 24-48 Listeria monocytogenes lên men đường Rhamnose khả lên men đường Xytose - Kết quả: Báo cáo phát không phát Listeria monocytogenes 25g mẫu Xác định hàm lượng TVB-N (95/149/EC) Phương pháp miêu tả việc xác định hàm lượng nitơ bazơ bay tổng số (TVB-N) cho sản phẩm thủy sản theo phụ lục II Quyết định số 95/149/EEC ngày 08/3/1995 Phương pháp thích hợp cho hàm lượng TVB-N từ 5mg/100g đến 100mg/100g 8.1 Nguyên tắc: TVB-N chiết từ mẫu dung dịch acid perchloric Sau kiểm hóa, dịch chiết chưng cất tồn chất bay hấp thụ bình chứa acid Hàm lượng TVB-N xác định qua việc chuẩn độ bazơ hất thụ 8.2 Chuẩn bị mẫu: + Lấy mẫu: Lấy 250g mẫu đại diện Đặt mẫu vào túi plastic, hàn kín miệng + Chuẩn bị mẫu trắng: Lấy bình chưng cất Kjeldahl, dùng pipet cho vào bình 50ml dung dịch acid perchloric Chuẩn bị mẫu kiểm sốt: Lấy bình chưng cất Kjeldahl, dùng pipet cho vào bình 45ml dung dịch acid perchloric 5ml dung dịch kiểm soát + Chuẩn bị mẫu: Xay mẫu sau lấy mẫu khỏi tủ lạnh Cân khỏang 100g mẫu từ điểm khác Mẫu nghiền kỹ máy nghiền Trộn sau lần nghiền Lấy cốc có mỏ loại 200ml, cho vào cốc xác 10g±0.1g mẫu nghiền Cho vào 90ml dung dịch acid perchloric Trộn đồng mẫu máy đồng mẫu phút Lọc lấy phần dịch chiết cho vào bình chưng cất Kjeldahl 8.3 Tiến hành: - Chưng cất chuẩn độ mẫu trắng (thực trước) - Chưng cất chuẩn độ mẫu kiểm soát (thực trước) - Chưng cất chuẩn độ mẫu kiểm: Thiết đặt thơng số chương trình chưng cất: + Thời gian bơm NaOH: giây + Thời gian phản ứng: giây + Thời gian chưng cất: 600 giây + Tốc độ cất: 45% Cho vào bình hứng 100ml dung dịch acid boric đặt vào chổ hứng máy cất đạm Nhỏ 3-5 giọt dung dịch phenolphtalein vài giọt silicone vào ống Kjeldahl Thêm vào 6.5ml NaOH Ngay đặt ống kjeldahl vào giá đỡ máy cất tiến hành chưng cất mẫu Khi trình cất kết thúc, nhấc ống chưng cất rửa đồng ống ngưng nước cất (phần nước rửa phải cho vào bình thu hồi) Chuẩn độ dung dịch hấp thụ dung dịch Hydrochloric acid Kiểm tra pH 5.0±0.1 kết thúc chuẩn độ 8.4 Báo cáo kết quả: Hàm lượng TVB-N lấy theo giá trị trung bình lần thử song song với đơn vị mg TVB-N/100g khơng có số lẻ Để đảm bảo chất lượng, giá trị mẫu kiểm sốt khơng chênh lệch q 2% so với giá trị lý thuyết Các giá trị TVB-N đo cho mẫu kiểm song song không lệch 2mg/100g Xác định Chloramphenicol Nitropfurans 9.1 Nguyên tắc: Phương pháp áp dụng kit thử RIDASCREEN Chloramphenicol hãng R-Biopham Phương pháp dựa phản ứng kháng nguyên-kháng thể Các giếng phủ lớp kháng thể Chloramphenicol dung dịch chuẩn dung dịch kiểm tra với chloramphenicol kết gắn kháng thể kháng chloramphenicol tất bổ sung vào giếng Chloramphenicol tự chloramphenicol gắn kết enzyme cạnh tranh vị trí kết gắn kháng thể kháng Chloramphenicol Cùng lúc, kháng thể kháng Chloramphenicol cố định lại bỡi kháng thể phủ thành giếng Chloramphenicol gắn kết enzyme thừa lọai bỏ công đọan rửa Bổ sung dung dịch chất cho enzyme chất tạo sắc vào giếng đem ủ, enzyme gắn kết biến đổi chất tạo sắc từ không màu thành màu xanh Khi bổ sung chất kết thúc phản ứng vào từ màu xanh chuyển sang màu vàng Phép đo thực bước sóng 450nm 9.2 Chuẩn bị mẫu: + Lấy mẫu: Lấy 200g mẫu đại diện Đặt mẫu vào túi plastic, hàn kín miệng Lưu mẫu nhiệt độ khơng +50C xử lý tiếp không 180C mẫu lưu ngày Cắt mẫu thành miếng nhỏ, xay nghiền máy xay hay máy nghiền + Tiến hành: Hòa tan, tách Chloramphenicol Cân 3g mẫu đồng hóa vào ống chứa mẫu có nắp Cho 6ml Ethyl Acetate vào, lắc trộng 10 phút máy trộn Ly tâm mẫu máy ly tâm 10 phút Dùng Micropipette hút 2.0ml phần bên ống nghiệm Đặt vào bể điều nhiệt 500C Thổi khơ khí nitrogen dung mơi bay hồn tồn cịn lại lớp cặn khơ bám vào đáy ống nghiệm (khoảng 30 phút) Hịa tan phần cịn lại sau khí làm khô bước trước với 1.0ml n-Hexan Bổ sung 1.0ml dung dịch đệm lắc phút Ly tâm dung dịch mẫu máy ly tâm 10 phút, 3000g nhiệt độ phòng Hút khoảng 100ml dịch suốt phần phía ống nghiệm cho vào ống típ 1.5ml Pha hóa chất với thuốc thử: Thành lập đường chuẩn với dải nồng độ 0ppt, 50ppt, 150ppt, 450ppt, 1350ppt, 4050ppt: dùng micropipette hút 50ml từ nồng độ chuẩn cho vào ống tip có chứa 450ml dung dịch đệm (theo tỷ lệ 1:9) Pha enzyme gắn kết (conjugated): Hút dung dịch enzyme gắn kết cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch đệm theo tỷ lệ 1:10 Thể tích pha tính dựa vào số giếng dùng Pha Antibody: Hút dung dịch kháng thể kháng nguyên Chloramphenicol (antibody) cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch đệm theotỷ lệ 1:10 Thể tích pha tính dựa vào số giếng dùng Phân tích mẫu: Đặt giếng vào khay plate với số lượng vừa đủ cho tất mẫu cần phân tích mậu chuẩn Thực mẫu phân tích lần Đánh số cho vị trí mẫu chuẩn mẫu phân tích Hút 50ml dung dịch chuẩn dung dịch mẫu cần phân tích cho vào giếng riêng rẽ Hút 50ml dung dịch enzyme gắn kết pha loãng bước trước cho vào giếng Tiếp tục cho vào giếng 50ml dung dịch kháng thể kháng nguyên Chloramphenicol pha loãng bước trước, lắc nhẹ cẩn thận bắng ta đem ủ tối nhiệt độ phòng Sau ủ giờ, rửa microplate máy rửa với chế độ hút rửa liên tiếp 3lần/hàng thể tích rửa 250ml nước cất Lật úp mạnh giếng giấy thấm lần liên tiếp để đảm bảo loại bỏ hết dịch lỏng bám giếng Cho vào giếng 50ml dung dịch chất substrate Bổ sung thêm 50ml dung dịch chất tạo sắc (chromogen), lắc nhẹ cẩn thận tay đem ủ 30 phút tối nhiệt độ phòng Sau ủ đủ thời gian hút 100ml dung dịch dừng phản ứng H2SO4 (1N) cho vào giếng Đọc kết máy đọc Benchmark Plus bước sóng 450nm (thời gian đọc khơng q 60 phút) Xử lý số liệu: Các số liệu tính tốn tự động xử lú theo phần mềm Microplate Manager Version 5.2 Build 103 hãng sản xuất Bio Rad Đối với việc xác định Nitrofurans ta tiến hành tương tự xác định Chloramphenicol ta dùng Kit thữ khác (Kit thử dùng cho Nitrofurans)./ ... nghiên cứu đề xuất giải pháp phịng ngừa mối nguy an tồn thực phẩm nguy? ?n liệu mực tàu đánh cá Kiên Giang góp phần vào việc ngăn ngừa mối nguy xảy nguy? ?n liệu thủy sản nói chung, nguy? ?n liệu mực nói... giải pháp phòng ngừa mối nguy an toàn thực phẩm cho nguy? ?n liệu mực tàu đánh cá Kiên Giang? ?? nhằm góp phần làm sở để quản lý tốt vệ sinh an toàn thực phẩm thủy sản tỉnh Kiên Giang nói riêng, nước... 57 3.4 Đề xuất số giải pháp phòng ngừa 58 3.4.1 Giải pháp phòng ngừa mối nguy vật lý 58 3.4.2 Giải pháp phòng ngừa mối nguy vi sinh vật 58 3.4.3 Giải pháp phịng ngừa mối nguy hóa