1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) bệnh phổ biến giới nguyên nhân gây tử vong cao hàng thứ tử vong ung thư (UT) nói chung Theo Hiệp hội phòng chống UT quốc tế (Union for International Cancer Control - UICC), ước tính giới năm có khoảng 1.000.000 trường hợp UTĐTT phát khoảng 500.000 người chết bệnh Tỉ lệ mắc bệnh vùng miền, châu lục có khác Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ sau UT dày, phổi, vú vịm họng Trong UT đường tiêu hóa UTĐTT đứng thứ 2, sau UT dày Theo thống kê Bệnh viện K Hà Nội, tỉ lệ mắc UTĐTT 9% tổng số bệnh nhân (BN) UT nói chung Tuy nhiên, so với UT đường tiêu hóa UTĐTT loại có tiên lượng tốt Cơ chế hình thành phát triển UTĐTT biến đổi tích lũy gen tế bào niêm mạc đại trực tràng (ĐTT) Sự tích lũy dần biến dị di truyền thường phải trải qua nhiều năm (từ 10 - 20 năm), điều phù hợp với nghiên cứu dịch tễ học di truyền diễn biến UTĐTT trải qua nhiều bước Sự phát triển vượt bậc ngành Công nghệ y sinh, cho phép xác định tương đối xác, đầy đủ nhanh tất dạng đột biến quan trọng dòng tế bào UT phổ biến UT phổi, u lympho ác tính, UTĐTT… Điều đáng ngạc nhiên mang nhiều đột biến khả phát triển tế bào UT dường lại lệ thuộc chủ yếu vào nguồn tín hiệu sinh trưởng một nhóm gen sinh UT (oncogene) định Những oncogene mã hóa protein đóng vai trị mắt xích đường tín hiệu nội bào Những đột biến làm cho tế bào UT có khả tăng sinh vô hạn, liên tục phân chia thực q trình xâm lấn, di căn… Tuy nhiên, đặc điểm làm phơi bày “gót chân Achilles” tế bào UT Bằng việc “đánh sập” oncogene chủ chốt HER2, K-RAS, β-catenin, cyclin E, B-Raf… công nghệ iRNA, nhà khoa học thành công việc ức chế phát triển nhiều loại tế bào UT in vitro [49] Những nghiên cứu mô hình chuột biến đổi gen tiếp tục khẳng định tầm quan trọng gen đích nhiều bệnh UT, có oncogene K-ras UTĐTT Từ chứng trên, hệ thuốc điều trị UT có khả tác động xác tới đích tiềm tế bào UT đời - liệu pháp điều trị đích Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu UTĐTT, chủ yếu đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi mơ bệnh học (MBH), cịn thấy có nghiên cứu đột biến gen UT nói chung UTĐTT nói riêng Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu đột biến gen K-RAS mối liên quan với số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ung thư đại trực tràng” tiến hành nhằm mục tiêu sau: Nghiên cứu tình trạng đột biến gen K-RAS bệnh nhân ung thư biểu mơ đại trực tràng Tìm hiểu mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh nồng độ CEA bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng Luận án dài 109 trang, đó: Đặt vấn đề: trang, Tổng quan: 34 trang, Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 17 trang, Kết nghiên cứu: 29 trang, Bàn luận: 25 trang 26 bảng, 10 biểu đồ, 13 hình Luận án tham khảo 147 tài liệu, đó: Tiếng Việt: 30 tài liệu; Tiếng Anh: 117 tài liệu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Gen ung thư đại trực tràng Từ nghiên cứu chế phát sinh phát triển UTĐTT có liên quan đến biến đổi gen tham gia vào chuyển dạng từ tế bào lành sang tế bào UT Các gen chia thành nhóm: gen UT, gen ức chế UT gen sửa chữa DNA Để hình thành UT phải có đột biến nhóm gen UT gen ức chế UT Khi gen tiền UT bị đột biến thành gen UT gen ức chế UT bị bất hoạt bị tổn thương, lúc tín hiệu cho tế bào phát triển vượt q tín hiệu điều hịa phát triển tế bào nhanh chóng vượt khỏi tầm kiểm sốt ung thư hình thành 1.1.1 Các gen ung thư Gen RAS; Giảm methyl hóa DNA; Gen C-MYC 1.1.2 Các gen áp chế ung thư Gen APC; Gen P53; Gen MCC; Gen DCC; Gen R11; Gen SMAD4 1.1.3 Các gen sửa chữa lỗi ghép cặp sai (DNA-mismatch repair) 1.2 Gen K-RAS ung thư đại trực tràng 1.2.1 Gen K-RAS Kể từ phát từ thập niên 70 kỉ 20, cấu trúc, chức vai trò gen K-RAS ngày sáng tỏ 1.2.1.1 Cấu trúc gen K-RAS Gen K-RAS nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể 12, vị trí 12.1: (12p12.1) Cụ thể gen K-RAS nằm từ nucleotid 25358179 đến nucleotid 25403853 nhiễm sắc thể 12 1.2.1.2 Chức gen K-RAS Gen K-RAS gen sinh UT, gen K-RAS mã hóa cho protein tham gia chủ yếu việc điều hành phân chia tế bào Thông qua trình truyền tín hiệu (transduction), protein truyền tín hiệu từ ngồi tế bào vào đến nhân tế bào Các tín hiệu kích hoạt tế bào để phát triển phân chia trưởng thành với chức chuyên biệt Các protein K-RAS GTPase GTPase enzym có chức chuyển đổi phân tử gọi GTP (Guanosine-5 ,-Triphosphate) đến phân tử gọi GDP (Guanosine-5,-Diphosphate) Các protein K-RAS hoạt động chuyển đổi, hoạt động (kích hoạt) hay n nghỉ (bất hoạt) Để truyền tín hiệu, protein K-RAS phải kích hoạt cách gắn vào phân tử GTP Các protein K-RAS bất hoạt chuyển đổi GTP tới GDP, protein kết hợp với GDP, khơng truyền tín hiệu tới nhân tế bào Những sản phẩm protein gen K-RAS đóng vai trò quan trọng phân bào, khác biệt tế bào chết tế bào theo chương trình (apoptosis) 1.2.1.3 Cơ chế sinh ung thư gen K-RAS Dưới tác dụng yếu tố môi trường (bức xạ, hóa chất ), đột biến gen K-RAS xảy Khi đột biến, gen KRAS có tiềm gây chuyển biến tế bào bình thường thành tế bào UT Đột biến gen K-RAS làm thay đổi protein (amino acid) khu vực quan trọng protein K-RAS, gây protein để tiếp tục hoạt động Thay kích hoạt tăng trưởng tế bào để phản ứng lại tín hiệu đặc biệt từ bên tế bào, protein hoạt động mức (overactive protein) đạo tế bào phát triển phân chia khơng ngừng Trong q trình phát triển phôi, protein K-RAS hoạt động mức phá vỡ phát triển bình thường trở thành mơ định Một số đột biến gen hình thành thời gian người có mặt tế bào định Những thay đổi gọi đột biến thân (hay đột biến soma) Sự đột biến soma gen K-RAS có liên quan đến phát triển nhiều loại UT Những đột biến dẫn đến protein K-RAS ln ln chủ động tác động trực tiếp đến tế bào để phát triển phân chia khơng có kiểm sốt Nhiều nghiên cứu cho thấy, đột biến gen K-RAS phổ biến UTĐTT 1.2.2 Các phương pháp xác định đột biến gen K-RAS Nhiều phương phương pháp khác áp dụng để xác định đột biến gen K-RAS sở tỉ lệ tế bào UT mơ phân tích - Kỹ thuật giải trình tự gen - Kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) - Kỹ thuật Scorpions-Amplification Refractory Mutation System (Scorpions ARMS) - Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp) 1.2.3 Đột biến gen K-RAS hiệu điều trị đích bệnh nhân ung thư đại trực tràng Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu giới thực nhằm phân tích tình trạng gen K-RAS (mã hóa cho protein RAS) BN UTĐTT điều trị cetuximab panitumumab Theo thống kê, oncogene KRAS bị đột biến 30% ca UTĐTT Cho đến nay, có 3000 đột biến điểm gen K-RAS báo cáo, đột biến hay gặp đột biến thay nucleotit codon 12 (chiếm 82%) codon 13 (chiếm 17%) exon gen K-RAS Đột biến codon 12 13 đóng vai trị quan trọng trình tiến triển bệnh UTĐTT nguy kháng thuốc ức chế EGFR khối u Đột biến vị trí khác codon 61 146 báo cáo chiếm tỉ lệ nhỏ ảnh hưởng dạng đột biến lâm sàng chưa làm sáng tỏ Gen K-RAS mã hóa cho protein G đóng vai trị truyền tín hiệu nội bào xi dịng từ EGFR Protein G thuộc họ protein RAS có chức truyền tín hiệu từ thụ thể bề mặt tế bào tới đích nội bào thơng qua dịng thác tín hiệu (bao gồm đường RAS-MAPK) Trong tế bào, protein RAS giữ cân thơng qua hình thành phức hợp tương ứng với trạng thái protein RAS: Phức hợp RAS-GTP (protein RAS hoạt hóa) phức hợp RAS-GDP (protein RAS bị bất hoạt) Protein RAS hoạt hóa nhờ yếu tố chuyển nucleotide guanine (guanine nucleotide exchange factors (GEFs) Việc truyền tín hiệu protein RAS bị ức chế phức hợp RAS-GTP bị thủy phân thành phức hợp RAS-GDP nhờ loại protein có chức hoạt hóa GTPase (GAPs) Ở điều kiện sinh lý bình thường, nồng độ RAS-GTP thể kiểm soát chặt chẽ nhờ hoạt động nhịp nhàng yếu tố GEFs GAPs Khi gen K-RAS bị đột biến mã hóa cho protein RAS có khả chống lại hoạt tính GTPase GAPs Do đó, protein RAS đột biến ln ln tồn trạng thái hoạt hóa RAS-GTP Khơng giống protein RAS kiểu hoang dại bị bất hoạt sau khoảng thời gian ngắn, protein RAS đột biến có khả kích hoạt vĩnh viễn đường truyền tín hiệu nằm xi dịng có hoạt hóa thụ thể EGFR hay khơng Đây chế phân tử lý giải cho tình trạng kháng thuốc điều trị đích BN mang khối u bị đột biến gen K-RAS 1.3 Yếu tố nguy trình phát sinh ung thư đại trực tràng 1.3.1 Các yếu tố nguy - Tuổi giới - Địa dư - Polype đại trực tràng - Yếu tố di truyền - Bệnh viêm ruột + Bệnh viêm loét ĐTT chảy máu + Bệnh Crohn's - Những yếu tố nguy khác + Chế độ ăn nhiều mỡ động vật + Thừa cân béo phì + Khói thuốc + Đái tháo đường type II 1.3.2 Cơ chế hình thành phát triển ung thư đại trực tràng 1.3.2.1 Quá trình phát sinh ung thư đại trực tràng qua nhiều bước UTĐTT hình thành phát triển tích lũy biến đổi gen tế bào biểu mô niêm mạc ĐTT Các biến đổi gen kết hợp với tác nhân gây UT gây đột biến khiếm khuyết gen, tạo nên UT làm chức gen ức chế UT Sự tích lũy dần biến dị di truyền thường cần phải qua nhiều năm (từ 10 - 20 năm), điều phù hợp với nghiên cứu dịch tễ học di truyền diễn biến phát sinh UTĐTT trải qua nhiều bước 1.3.2.2 Tính khơng ổn định vi vệ tinh gen sửa chữa DNA Cơ chế phân tử sinh UTĐTT gần đưa nhân lên sai sót, hay cịn gọi tính khơng ổn định vi vệ tinh MSI Q trình xảy qua hai giai đoạn kéo dài tách biệt giao thoa Sự khơng ổn định xảy toàn nhiễm sắc thể xảy vùng gen lặp lại gọi vùng vi vệ tinh (microsatellite) Các microsatellite đoạn lặp lại đặc biệt DNA Các trình tự chứa Cytosine (C) Adenine (A) Dinucleotide (lặp lại CA) Những trình tự tìm thấy rải rác tồn gen (genome), nhiên chức xác chúng cịn chưa biết rõ 1.5 Tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài luận án 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới Trên giới có nhiều nghiên cứu nhằm phân tích tình trạng đột biến gen K-RAS hiệu đáp ứng thuốc ức chế EGFR BN UTĐTT 1.5.2 Nghiên cứu Việt Nam Các nghiên cứu đột biến gen K-RAS BN UTĐTT bước đầu số lượng BN khiêm tốn CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân UTĐTT khám lâm sàng, xét nghiệm, nội soi ĐTT sinh thiết, xét nghiệm MBH trước sau phẫu thuật điều trị Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng, làm xét nghiệm xác định đột biến gen K-RAS Trung tâm Nghiên cứu gen protein Trường Đại học Y Hà Nội 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân - Bệnh nhân khám, xét nghiệm, chẩn đoán xác định UTBMĐTT phẫu thuật cắt bỏ khối u triệt - Kết xét nghiệm MBH sau mổ khẳng định UTBMĐTT - Chưa điều trị hóa chất xạ trị trước mổ - Có kết xét nghiệm đột biến gen K-RAS 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ - Bệnh nhân UTBMĐTT khơng cịn giai đoạn phẫu thuật triệt - Những trường hợp MBH sau mổ UTBMĐTT - Những trường hợp UTBMĐTT tái phát điều trị hóa chất, xạ trị trước phẫu thuật - Những trường hợp UTBMĐTT có thêm UT khác kèm theo - Khơng có kết xét nghiệm đột biến gen K-RAS 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu tiến cứu, mô tả, cắt ngang 2.2 Cỡ mẫu Áp dụng theo công thức: n= z 1−α / p.q ( p.ε ) Trong đó: n: số bệnh nhân cần nghiên cứu Z21-α/2 = 1,96 p: tỉ lệ mắc bệnh dựa theo nghiên cứu trước q=1–p ε = 0,3 (giá trị sai số tương đối) Theo kết nghiên cứu Stefanius (Phần Lan - 2011), nghiên cứu xác định đột biến gen K-RAS codon 12 13 BN UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS 45% Vì vậy, ước lượng tỉ lệ đột biến gen K-RAS BN mắc UTĐTT 40% (p = 0,4) Thay giá trị vào cơng thức ta có : n= 1,96 X 0,4 X 0,6 (0,4 X 0,3) n = 64 Như vậy, để có độ xác 95%, cỡ mẫu nghiên cứu phải có 64 bệnh nhân Trong nghiên cứu chọn 79 BN đủ tiêu chuẩn đưa vào nghiên cứu 2.2.3 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 01/2010 đến tháng 7/2012 2.2.4 Địa điểm nghiên cứu - Nghiên cứu lâm sàng, nội soi, MBH Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng; kết MBH đọc xác định lại Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện Trung Ương Quân đội 108 - Nghiên cứu xác định đột biến gen K-RAS Trung tâm Nghiên cứu gen protein, Trường Đại học Y Hà Nội 10 2.2.5 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu nội soi - Máy nội soi đại tràng ống mềm Olympus CF – Q150I Nhật Bản sản xuất - Kìm sinh thiết: loại có kim cố định - Lọ đựng bệnh phẩm có chứa dung dịch formon 10% để ngâm cố định bệnh phẩm 2.2.6 Nghiên cứu gen Kỹ thuật giải trình tự gen: Sau khuyếch đại vùng codon 12, 13 gen K-RAS kỹ thuật nested PCR, sản phẩm PCR tinh từ agarose gel sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA) Sản phẩm PCR sau tinh đưa vào giải trình tự sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA) Trình tự gen đối chiếu so sánh với trình tự gen K-RAS hoang dại (wild type) GenBank (National center for biotechnology information, NCBI) 2.4 Chỉ tiêu nghiên cứu tiêu chuẩn đánh giá 2.4.1 Lâm sàng Các đặc điểm lâm sàng thường gặp: - Tuổi, giới tính - Các triệu chứng lâm sàng chính: + Đau bụng: có hay khơng, vị trí, tính chất đau + Đại tiện: phân có máu, có nhày, “nhày + máu” lẫn lộn + Tính chất phân: lỏng, táo, táo lỏng xen kẽ, sống phân, thay đổi khuôn phân… + Các triệu chứng rối loạn tiêu hóa như: thay đổi thói quen đại tiện, cảm giác ngồi khơng hết phân, chướng hơi… + Các triệu chứng khác: gầy sút cân, bán tắc ruột, u bụng, thiếu máu (hoa mắt, chóng mặt, da, niêm mạc nhợt) + Thời gian từ xuất triệu chứng đến phát bệnh: tháng, - tháng, - 12 tháng, 12 tháng 2.4.2 Cận lâm sàng 15 Có đột biến Khơng đột biến Tổng n (%) n (%) N (%) Nam 29 (63,0) 19 (57,6) 48 (60,8) Nữ 17 (37,0) 14 (42,4) 31 (39,2) Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100) Giới Nhận xét: Đột biến gen K-RAS nam chiếm tỉ lệ 63,0%; nữ chiếm tỉ lệ 37,0% Bảng 3.12 Đột biến gen K-RAS theo nhóm tuổi Tuổi Có đột biến Khơng đột biến Tổng n (%) n (%) N (%) p p > 0,05 16 ≤ 40 (8,7) (3,0) (6,3) > 40 42 (91,3) 32 (97,0) 74 (93,7) Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100) > 0,05 Nhận xét: Đột biến gen K-RAS nhóm tuổi ≤ 40 chiếm tỉ lệ 8,7%; nhóm tuổi > 40 chiếm tỉ lệ 91,3% 3.2.2.Tỉ lệ kiểu đột biến gen K-RAS bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng Bảng 3.13 Tỉ lệ kiểu đột biến gen K-RAS Kiểu đột biến n = 46 Tỉ lệ % GGT → GAT 43 93,5 GGT → GTT 6,5 Tổng 46 100 Nhận xét: Đột biến gen K-RAS kiểu thay GGT → GAT chiếm tỉ lệ cao (93,5%), kiểu thay GGT → GTT chiếm tỉ lệ thấp (6,5%) 17 3.3 Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh nồng độ CEA bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng 3.3.1 Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm lâm sàng Bảng 3.15 Mối liên quan đột biến gen K-RAS với triệu chứng thiếu máu đại tiện máu đại thể Triệu chứng Có đột biến Khơng đột biến Tổng n (%) n (%) N (%) p Triệu chứng đại tiện máu đại thể Có máu 29 (63,0) 13 (39,4) 42 (53,2) Khơng có máu 17 (37,0) 20 (60,6) 37 (46,8) > 0,05 Triệu chứng thiếu máu Có 27 (58,7) (6,1) 29 (36,7) Khơng 19 (41,3) 31 (93,9) 50 (63,3) < 0,05 18 Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100) Nhận xét: Ở BN có đột biến gen K-RAS, triệu chứng thiếu máu gặp nhiều (58,7%) BN khơng có đột biến gen K-RAS (p < 0,05) 3.3.2 Đột biến gen K-RAS với số đặc điểm hình ảnh nội soi - Đột biến gen K-RAS với kích thước khối u Bảng 3.18 Mối liên quan đột biến gen K-RAS với kích thước khối u Kích thước u (cm) Có đột biến Khơng đột biến Tổng n (%) n (%) N (%) P 19 10 29 (63,1) 11 (33,4) 40 (50,6) Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100) < 0,05 Nhận xét: Tỉ lệ đột biến gen K-RAS tăng theo kích thước khối u (p < 0,05) - Đột biến gen K-RAS theo mức độ xâm lấn u so với chu vi lòng ĐTT Bảng 3.19 Mối liên quan đột biến gen K-RAS với mức độ xâm lấn u so với chu vi lòng đại trực tràng Mức độ xâm lấn u Có đột biến Không đột biến Tổng n (%) n (%) N (%) < 1/4 chu vi (2,2) (18,2) (8,9) 1/4 - 1/2 chu vi (10,9) (24,2) 13 (16,5) 1/2 - 3/4 chu vi 11 (23,9) 12 (36,4) 23 (29,1) > 3/4 chu vi 29 (63,0) (21,2) 46 (100) 33 (100) < 0,05 36 (45,5) Tổng p 79 (100) Nhận xét: Tỉ lệ đột biến gen K-RAS tăng theo mức độ xâm lấn khối u so với chu vi lòng ĐTT (p < 0,05) 20 3.3.3 Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm giải phẫu bệnh - Đột biến gen K-RAS với độ ác tính khối u Bảng 3.21 Mối liên quan đột biến gen K-RAS với độ ác tính khối u Có đột biến Khơng đột biến Tổng n (%) n (%) N (%) Thấp 34 (73,9) 25 (23,3) 59 (74,7) Cao 12 (26,1) (76,7) 20 (25,3) Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100) Độ ác tính P > 0,05 Nhận xét: Chưa thấy mối liên quan đột biến gen K-RAS với mức độ ác tính khối u (p > 0,05) - Đột biến gen K-RAS với mức độ xâm lấn khối u vào thành đại trực tràng Bảng 3.23 Mối liên quan đột biến gen K-RAS với mức độ xâm lấn khối u vào thành đại trực tràng Mức độ Có đột biến Không đột biến Tổng xâm lấn u n (%) n (%) N (%) Niêm mạc (0) (0) (0) P 21 Dưới niêm mạc (0) (0) (0) Lớp (15,2) 13 (39,4) 20 (25,3) Thanh mạc 15 (32,6) 10 (30,3) 25 (31,7) Qua mạc 24 (52,2) 10 (30,3) 34 (43,0) Tổng 46 (100) 33 (100) 79 (100) < 0,05 Nhận xét: Tỉ lệ đột biến gen K-RAS tăng theo mức độ xâm lấn khối u vào thành ĐTT (p < 0,05) CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân nghiên cứu 4.1.1 Tuối giới tính Tuổi trung bình nhóm BN nghiên cứu 61,7 ± 12,3, tuổi thấp 21, tuổi cao 81, ba nhóm tuổi có tỉ lệ gặp cao nhóm tuổi từ 60 - 69 chiếm tỉ lệ 32,9%, nhóm tuổi từ 50 - 59 70 - 79 chiếm tỉ lệ 25,3% Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu tác giả khác như: Fuszek P., Horváth H.C CS (2006), tuổi mắc bệnh trung bình 65,2 ± 12,5; McFarlane CS (2004), tuổi mắc bệnh trung bình 65,5; Vũ Văn Khiên CS (2012), tuổi mắc bệnh trung bình 63,86 ± 12,21; Phạm Văn Duyệt (2002), tuổi mắc bệnh trung bình 63,7 Như vậy, theo kết 22 nhiều nghiên cứu tỉ lệ mắc bệnh gặp chủ yếu lứa tuổi 60 - 79 Theo Benson A.B (2007), tuổi 50 nguy cho UTĐTT; theo Mayer R.J (2007), UTĐTT hay xảy tuổi 50 Theo Nguyễn Văn Vân (2000), tuổi mắc bệnh trung bình thời điểm chẩn đoán 60, hay gặp tuổi 40 tần số tăng gấp đôi sau 10 năm Tỉ lệ nam mắc bệnh nghiên cứu chiếm tỉ lệ 60,8%, nữ chiếm tỉ lệ 39,2%, tỉ lệ nam/nữ 1,55/1 Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Phan Văn Hạnh (2004), tỉ lệ nam/nữ 1,98/1; Phạm Văn Duyệt (2002), tỉ lệ nam/nữ 1,09/1; Hoàng Kim Ngân (2006), tỉ lệ nam/nữ 1,16/1; Nguyễn Viết Nguyệt (2008), tỉ lệ nam/nữ 1,1/1 [20] Tuy nhiên số nghiên cứu khác, tỉ lệ nam/nữ lại cho kết quả: Lê Quang Minh (2011), tỉ lệ nam/nữ 0,93/1; Phạm Văn Nhiên (2000), tỉ lệ nam/nữ 0,96/1 Như vậy, số liệu tỉ lệ nam/nữ nghiên cứu cịn chưa có thống Tuy nhiên, khác biệt không nhiều, theo tỉ lệ UTĐTT nam thường cao nữ số liệu nghiên cứu thường bị ảnh hưởng bới địa điểm nghiên cứu cách chọn mẫu cỡ mẫu nghiên cứu 4.2 Đột biến gen K-RAS bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng 4.2.1 Kết tách chiết DNA Với phát triển vượt bậc ngành công nghệ Y sinh, giới có nhiều kỹ thuật áp dụng nhằm xác định đột biến gen K-RAS BN mắc UTĐTT Tách chiết DNA bước quan trọng quy trình thực kỹ thuật sinh học phân tử Tách chiết DNA tốt, phân tử DNA không bị đứt gãy, không bị tạp nhiễm phản ứng có độ xác cao Có nhiều phương pháp tách chiết DNA, nhiên phương pháp phenol/chlorroform lựa chọn để tách chiết DNA nghiên cứu Đây phương pháp tách chiết DNA cổ điển, cần nhiều thời gian so với phương pháp tách chiết DNA sử dụng kit thường quy sản phẩm DNA thu có nồng độ độ tinh cao Tất mẫu DNA tách chiết từ mô UTĐTT có nồng độ độ tinh nằm khoảng 1,8 - 2,17 đo 23 máy Nano-drop bước sóng 260/280 nm Như vậy, mẫu DNA tách chiết đảm bảo chất lượng, đủ điều kiện cho bước xét nghiệm Hiện nay, giới có nhiều phương pháp khác để xác định đột biến gen K-RAS Trong nghiên cứu này, chúng tơi áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen Sau khuếch đại vùng codon 12, 13 gen K-RAS kỹ thuật nested PCR, sản phẩm PCR tinh từ agarose gel sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA) Sản phẩm PCR sau tinh đưa vào giải trình tự sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA) Trình tự gen đối chiếu so sánh với trình tự gen K-RAS hoang dại (wild type) GenBank (National center for biotechnology information, NCBI) Tất BN nhóm nghiên cứu làm xét nghiệm đột biến gen K-RAS có kết xác định đột biến gen K-RAS Tất BN có đột biến gen K-RAS nghiên cứu bị đột biến codon 12, chưa phát BN nhân có đột biến codon 13 4.2.2 Tỉ lệ đột biến kiểu đột biến gen K-RAS bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng Sự ổn định cấu trúc gen khởi đầu cho phát triển UTĐTT, đánh dấu việc tích lũy đột biến phát sinh UT với nhiều nguyên nhân khác Thông thường thiếu ổn định nhiễm sắc thể biểu việc thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể số lượng copy Những biến đổi nguyên nhân làm giảm sút chép thể hoạt động gen kháng UT APC, p53 SMAD4 Sự phát sinh, phát triển UTĐTT liên quan đến đột biến dẫn đến tăng cường hoạt động gen gây UT, gen đường tín hiệu thơng qua thụ thể EGFR có gen KRAS Cho đến nay, có 3000 đột biến điểm gen K-RAS báo cáo, đột biến hay gặp đột biến thay nucleotit codon 12 (chiếm 82%) codon 13 (chiếm 17%) exon gen K-RAS Đột biến codon 12 13 chứng minh đóng vai trị quan trọng trình tiến triển UT nguy kháng thuốc ức chế EGFR khối u Đột biến vị trí khác codon 61 146 báo cáo thường chiếm tỉ lệ nhỏ ảnh hưởng dạng đột 24 biến lên lâm sàng chưa làm sáng tỏ Như vậy, việc xác định đột biến gen K-RAS BN UTĐTT có ý nghĩa quan trọng việc tiên lượng điều trị Tuy nhiên, hạn chế mặt kinh phí nên nghiên cứu dừng lại nghiên cứu đột biến gen K-RAS mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, MBH nồng độ CEA BN UTĐTT Trong nghiên cứu này, xác định đột biến gen K-RAS codon 12 codon 13 tiến hành 79 BN bị UTĐTT, kết nghiên cứu bảng 3.10 cho thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS BN bị UTĐTT nghiên cứu 58,2%; tất đột biến dạng dị hợp tử Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Cunningham C CS (1996) nhận xét tỉ lệ đột biến gen K-RAS BN UTĐTT khoảng 50% Theo kết nghiên cứu Breivik J CS (1994), tiến hành nghiên cứu đột biến gen K-RAS codon thứ 12 codon thứ 13 251 BN bị UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS 39,4%; Karapetis CS (2008), nghiên cứu 572 BN UT có 394 BN (68,9%) UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS 41,6%; Beranek (1999), tiến hành nghiên cứu đột biến gen K-RAS codon 12 53 BN bị UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến 34%; Tortola S (1999), nghiên cứu 132 BN bị UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS 54 BN chiếm tỉ lệ 41%; Monstein CS (2004), nghiên cứu xác định tỉ lệ đột biến gen K-RAS BN UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến khối u TT 30%, khối u ĐT 44%; Prall F (2007), nghiên cứu xác định tỉ lệ đột biến gen K-RAS UTĐTT giai đoạn sớm, đột biến gen K-RAS xác định vị trí codon 12 codon 13 thấy tỉ lệ đột biến 34,7% Gần đây, Stefanius (2011) nghiên cứu đột biến gen K-RAS BN bị UTĐTT thấy tỉ lệ đột biến 45% Như vậy, tỉ lệ đột biến gen K-RAS BN bị UTĐTT nghiên cứu cịn chưa có thống Theo chúng tơi, có lẽ cách chọn mẫu kỹ thuật chon mẫu có khác nhau, nghiên cứu lại sử dụng kỹ thuật khác thời điểm địa điểm nghiên cứu khác nên kết nghiên cứu có khác Khi nghiên cứu kiểu đột biến gen K-RAS, kết bảng 3.13 cho thấy gặp chủ yếu kiểu đột biến thay GGT → GAT (93,5%), kiểu thay GGT → GTT chiếm tỉ lệ thấp (6,5%) Theo kết nghiên cứu Rako I CS (2011) cho thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS codon 12 kiểu thay G → A chiếm tỉ lệ 50,0%; Esteller M CS (2000), để nghiên cứu liên quan 25 q trình giảm methyl hóa liên quan đến diện đột biến gen K-RAS, tác giả nghiên cứu 244 mẫu khối u ĐTT, kết cho thấy mối liên quan rõ ràng ngừng giảm hoạt động methyl hóa xuất đột biến gen K-RAS kiểu thay G → A chiếm tỉ lệ 71% ; Prall F (2007), thấy đột biến gen K-RAS ti lệ đột biến codon 12 90,6% chủ yếu gặp kiểu chuyển đổi G → A Như vậy, tỉ lệ kiểu đột biến gen K-RAS BN bị UTĐTT nghiên cứu chưa có thống Tuy nhiên, kết nghiên cứu thấy đột biến gen K-RAS BN bị UTĐTT chủ yếu kiểu đột biến GGT → GAT Vì vậy, theo chúng tơi cần có nhiều nghiên cứu với số lượng BN lớn việc xác định tỉ lệ đột biến kiểu đột biến gen K-RAS BN mắc UTĐTT 4.2.3 Đột biến gen K-RAS với tuổi giới tính Ung thư ĐTT bệnh chung cho hai giới nam thường bị nhiều nữ, tỉ lệ nam/nữ thay đổi từ 1,1 đến 2,1 lần Phụ nữ vùng khác có tỉ lệ mắc tương tự nhau, vào khoảng 60 - 80% so với nam giới Khi tiến hành nghiên cứu tỉ lệ đột biến gen K-RAS theo giới tính BN bị UTĐTT, kết nghiên cứu bảng 3.11 cho thấy tỉ lệ đột biến nam có 29/46 trường hợp chiếm tỉ lệ 63,0%, nữ có 17/46 trường hợp chiếm tỉ lệ 37,0%, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Theo kết nghiên cứu Brink M CS (2003), thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS BN bị UTĐTT nam 57%, nữ 43% (p > 0,05); Breivik J CS (1994), tỉ lệ đột biến gen K-RAS nam chiếm tỉ lệ 33,3%, nữ chiếm tỉ lệ 45,3% (p > 0,05) Gần đây, theo kết nghiên cứu Zulhabri O (2012), tỉ lệ đột biến gen K-RAS nam 25%, nữ 16% (p > 0,05) Như vậy, kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu tác giả khác thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS BN bị UTĐTT khơng có khác biệt hai giới 4.3 Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh nồng độ CEA bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng - Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số triệu chứng thực thể: Thiếu máu chảy máu rỉ rả kéo dài từ khối u, đặc biệt khối u từ manh tràng thường thể “sùi + loét”, dễ chảy máu dẫn tới thiếu máu nặng, xác định thiếu máu BN có biểu lâm sàng da xanh, niêm mạc nhạt, số lượng 26 hồng cầu, nồng độ hemoglobin giảm 10% so với trị số bình thường Những triệu chứng toàn thân biểu rõ ràng UT giai đoạn muộn, di Kết bảng 3.15 cho thấy: 27 trường hợp có triệu chứng thiếu máu có biểu đột biến gen K-RAS chiếm tỉ lệ 58,7%; 19 trường hợp khơng có triệu chứng thiếu máu có biểu đột biến gen K-RAS chiếm tỉ lệ 41,3%, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Như vậy, có mối liên quan đột biến gen K-RAS với triệu chứng thiếu máu BN mắc UTĐTT Trên thực tế, BN UTĐTT đến khám bệnh thường giai đoạn muộn, phần lớn BN có biểu triệu chứng thiếu máu Việc phẫu thuật BN thường gặp khó khăn nên thường áp dụng phương pháp điều trị nội khoa Nhưng vấn đề điều trị nội khoa thuốc chống UT thường hiệu quả, theo chúng tơi có lẽ khối u kháng thuốc điều trị nên trước có định dùng thuốc cần làm xét nghiệm xác định xem BN có hay khơng có đột biến gen K-RAS Tuy nhiên, việc xét nghiệm xác định đột biến gen K-RAS xét nghiệm khó, giá thành cao nên chưa thể áp dụng rộng rãi Vì vậy, chúng tơi cho BN UTĐTT có triệu chứng thiếu máu mà có định điều trị nội khoa nên cân nhắc thật kỹ nên dùng nhóm thuốc cho thật hợp lý - Đột biến gen K-RAS với kích thước mức độ xâm lấn khối u so với chu vi lòng đại trực tràng: Nhiều nghiên cứu chứng ming rằng, kích thước khối u so với chu vi lòng ĐTT phản ánh phát triển khối u theo thời gian yếu tố tiên lượng độc lập với thời gian sống thêm sau phẫu thuật BN Kết nghiên cứu bảng 3.18 cho thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS BN UTĐTT theo kích thước khối u thứ tự là: kích thước khối u > 10 cm có 29 trường hợp chiếm tỉ lệ 63,1%; khối u có kích thước – 10 cm có 15 trường hợp chiếm tỉ lệ 32,6%; khối u có kích thước < cm có trường hợp chiếm tỉ lệ 4,3% Như vậy, tỉ lệ đột biến gen K-RAS BN bị UTĐTT tăng theo kích thước khối u, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Khi nghiên cứu mối liên quan đột biến gen K-RAS BN bị UTĐTT với mức độ xâm lấn khối u so với chu vi lòng ĐTT, kết nghiên cứu bảng 3.19 cho thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS BN mắc UTĐTT theo thứ tự là: khối u chiếm > 3/4 chu vi lịng ĐTT có 29 trường hợp chiếm tỉ lệ 63%; khối u chiếm 1/2 - 3/4 chu vi có 11 trường hợp chiếm tỉ lệ 23,9%; khối u 27 chiếm 1/4 - 1/2 chu vi có trường hợp chiếm tỉ lệ 10,9%; khối u có kích thước chiếm < 1/4 chu vi lịng ĐTT có trường hợp chiếm tỉ lệ 2,2% (p < 0,05) Như vậy, tỉ lệ đột biến gen K-RAS BN bị UTĐTT tăng theo kích thước khối u Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Zulhabri O CS (2012) nghiên cứu đột biến gen K-RAS vị trí codon 12 70 BN bị UTĐTT Malaysia thấy tỉ lệ đột biến gen K-RAS theo kích thước khối u tính cm2 cho kết sau: < 15 (10,0%), 15 - 34 (17,0%), > 35 (60,0%), khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Như vậy, có mối liên quan đột biến gen K-RAS với kích thước khối u BN bị UTĐTT 4.3.3 Đột biến gen K-RAS với số đặc điểm giải phẫu bệnh nồng độ CEA - Đột biến gen K-RAS với mức độ xâm lấn khối u vào ĐTT UTĐTT có chưa có di hạch: Nghiên cứu đánh giá xâm lấn khối u theo chiều sâu mổ thường vào tình trạng mạc thành ruột, khối u chưa phát triển tới mạc mạc hồn tồn bình thường, khối u phát triển tới lớp mạc mạc nhăn nhúm, co kéo, qui tụ bóng, khối u xâm lấn tới lớp mạc mạc ngồi lấm sần sùi có dính vào mạc nối, tạng lân cận Tuy nhiên, để đánh giá mức độ xâm lấn cần dựa vào kết MBH Mức độ xâm lấn qua lớp thành ruột yếu tố tiên lượng quan trọng BN bị UTĐTT Khi nghiên cứu mối liên quan tỉ lệ đột biến gen K-RAS với mức độ xâm lấn khối u vào thành ĐTT, kết nghiên cứu bảng 3.23 cho thấy: tỉ lệ đột biến khối u xâm lấn đến lớp có 7/46 trường hợp chiếm tỉ lệ 15,2%; khối u xâm lấn đến lớp mạc có 15/46 trường hợp chiếm tỉ lệ 32,6%; khối u xâm lấn qua lớp mạc có 24/46 trường hợp chiếm tỉ lệ 52,2% (p < 0,05) Như vậy, khối u xâm lấn xâu vào thành ĐTT tỉ lệ đột biến gen K-RAS cao Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Tai C.J (2012) nghiên cứu đột biến gen K-RAS 126 BN mắc UTĐTT nhận xét đột biến gen K-RAS BN bị UTĐTT thấy có khác biệt giai đoạn T1+2 giai đoạn T3+4 Như vậy, có mối liên quan đột biến gen K-RAS với mức độ xâm lấn khối u vào thành ĐTT BN bị UTĐTT 28 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 79 trường hợp ung thư biểu mô đại trực tràng rút số kết luận sau: Tình trạng đột biến gen K-RAS bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng - Tuổi trung bình bệnh nhân 61,7 ± 12,3 (tuổi cao 81 thấp 21), bệnh gặp nhiều lứa tuổi 6069 (32,9%), tỉ lệ nam/nữ 1,55/1 - Tỉ lệ đột biến gen K-RAS ung thư biểu mô đại trực tràng 58,2%; tất đột biến vị trí codon 12 - Đột biến kiểu GGT → GAT chiếm tỉ lệ 93,5%; đột biến kiểu GGT → GTT chiếm tỉ lệ 6,5% - Tỉ lệ bệnh nhân ung thư biểu mơ đại trực tràng có đột biến gen K-RAS nam giới chiếm 63% nữ giới 37% (p > 0,05) - Tỉ lệ đột biến gen K-RAS bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng có tuổi ≤ 40 8,7% tuổi > 40 91,3% (p > 0,05) Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh nồng độ CEA bệnh ung thư biểu mô đại trực tràng * Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm lâm sàng: - Triệu chứng thiếu máu có mối liên quan với đột biến gen K-RAS (p < 0,05) - Thời gian từ xuất triệu chứng đến phát bệnh, đại tiện máu khơng có mối liên quan với đột biến gen KRAS (p > 0,05) * Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm hình ảnh nội soi: - Kích thước u có mối liên quan với đột biến gen K-RAS (p < 0,05) - Vị trí u, hình thể u chưa thấy có mối liên quan với đột biến gen K-RAS (p > 0,05) 29 * Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm giải phẫu bệnh: - Mức độ xâm lấn u vào thành lòng đại trực tràng có mối liên quan với đột biến gen K-RAS (p < 0,05) - Týp mô bệnh học, độ ác tính, tình trạng có hay chưa có di hạch khối u chưa thấy có mối liên quan với đột biến gen K-RAS (p > 0,05) * Nồng độ CEA chưa thấy có mối liên quan với đột biến gen K-RAS bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng ... 0,05) Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh nồng độ CEA bệnh ung thư biểu mô đại trực tràng * Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm. .. 4.3 Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh nồng độ CEA bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng - Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số triệu... 3.3 Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh nồng độ CEA bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng 3.3.1 Mối liên quan đột biến gen K-RAS với số