1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) là dược liệu quý hiếm phân bố chủ yếu tại khu vực dãy núi Hymalaya. Ở Việt Nam, thông đỏ được tìm thấy tại cao nguyên Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng với số lượng cá thể nhỏ. Trong thông đỏ có chứa hoạt chất có tác dụng ức chế tế bào ung thư như: paclitaxel (Taxol), cephalomannin hoặc các chất có thể bán tổng hợp ra các thuốc điều trị ung thư như baccatin III, 10 deacetyl baccatin III Tuy nhiên, thông đỏ là loài cây sinh trưởng chậm, trong khi hàm lượng hoạt chất trong cây thấp. Vì vậy, nguồn nguyên liệu từ cây tự nhiên khó đủ đáp ứng nhu cầu điều trị ngày càng tăng. Để khắc phục nhược điểm này bên cạnh việc nghiên cứu nhân giống, gieo trồng tự nhiên, sinh khối tế bào (SKTB) thực vật là hướng đi mới có triển vọng để sản xuất các hoạt chất từ dượ c liệu nói chung và thông đỏ nói riêng. Công nghệ SKTB thực vật là công nghệ nuôi cấy các tế bào trong điều kiện vô khuẩn trong ống nghiệm hay các bình nuôi cấy lớn, nhằm mục đích tạo ra khối lượng tế bào từ đó có thể sử dụng để tách chiết các hoạt chất. Với mục đích góp phần tạo thêm nguồn nguyên liệu sản xuất paclitaxel từ nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam theo hướng ứng dụng công nghệ SKTB thực vật, đề tài “Nghiên cứu quy trình tạo SKTB thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) để chiết xuất hoạt chất điều trị ung thư” được tiến hành nhằm các mục tiêu sau: 1. Xây dựng qui trình tạo SKTB thông đỏ qui mô phòng thí nghiệm. 2. Xác định thành phần hoá học, chiết xuất, phân lập một số chất chính và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu SKTB thông đỏ tạo ra. Ý nghĩa của lu ận án Lần đầu tiên tại Việt Nam đưa ra được quy trình tạo SKTB thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.). Đã khảo sát được các yếu tố ảnh hưởng tới tốc độ phát triển và hàm lượng hoạt chất trong SKTB thông đỏ góp phần tạo nguồn nguyên liệu ổn định, bền vững và hiệu quả. Lần đầu tiên tại Việt Nam thành phần hóa học sinh khối thông đỏ được nghiên cứu. Xây dựng được quy trình chiế t xuất paclitaxel từ sinh khối cũng 2 như TCCS của nguyên liệu sinh khối góp phần tạo ra nguồn hoạt chất để sản xuất thuốc điều trị ung thư. Những đóng góp mới của luận án Đã nghiên cứu xây dựng được quy trình tạo SKTB thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) quy mô phòng thí nghiệm. Khảo sát lựa chọn được thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy tế bào để tế bào phát triển tốt nhất, hàm lượng paclitaxel cao nhấ t. Đồng thời cũng xây dựng được quy trình thu hoạch SKTB thông đỏ dùng để chiết xuất hoạt chất chống ung thư. Xác định được các nhóm hoạt chất trong SKTB thông đỏ. Chiết xuất, phân lập và nhận dạng được 09 hợp chất chính, trong đó có các dẫn chất khung taxan. Xây dựng, thẩm định phương pháp định lượng đồng thời paclitaxel và baccatin III trong SKTB thông đỏ. Từ SKTB thông đỏ, đã xây dựng được quy trình chiết xuất và tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ. Sản phẩm paclitaxel có hàm lượng 98,07% đạt tiêu chuẩn USP 30. Đã xây dựng được TCCS của SKTB thông đỏ theo USP 30 và DĐVN IV gồm các chỉ tiêu: hình thức, độ ẩm, tạp chất, định tính, định lượng. Cấu trúc luận án: Gồm 4 chương, có 137 trang được bố cục bao gồm các phần sau: phần đặt vấn đề (2 trang), tổng quan tài liệu (28 trang), đối tượng và phương pháp nghiên cứu (11 trang), kết quả (62 trang), bàn luận (31 trang) và kế t luận (2 trang), kiến nghị (1 trang), tài liệu tham khảo (với 148 tài liệu: 15 tài liệu tiếng Việt, 133 tài liệu tiếng Anh) và phần phụ lục. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan đề cập tới 3 nội dung chính: - Tổng quan về cây thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.): đặc điểm thực vật, phân bố, thành phần hóa học và tác dụng sinh học. - Tổng quan về công nghệ SKTB thực vật: khái niệm, quy trình SKTB và các yếu tố ảnh hưở ng. - Tổng quan về kỹ thuật SKTB thông đỏ sản xuất 3 paclitaxel, biện pháp làm tăng hàm lượng hoạt chất, định lượng và chiết xuất paclitaxel từ SKTB thông đỏ. Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT Mẫu cành non cây thông đỏ 10 tuổi (Taxus wallichiana Zucc.) thu thập tại Đà Lạt, Lâm Đồng vào tháng 4 năm 2008, được Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật -Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam thẩm định. Các hóa chất chuyên dụng đạt tiêu chuẩn cho nuôi cấy tế bào thực vật. Các thiết bị nghiên cứu chuyên dụng trong nuôi cấy tế bào, phân tích. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xây dựng qui trình tạo sinh kh ối thông đỏ Quy trình tạo SKTB thông đỏ được tiến hành theo các nguyên tắc của R. M. Enaksha, G. Parc, R.M. Cusido. Cành non thông đỏ được tiệt khuẩn, cắt thành lát nhỏ, cấy vào môi trường thạch để tạo callus. Duy trì callus trong môi trường thạch để tế bào không có khả năng biệt hoá trở lại. Sau đó, cấy chuyển tế bào sang môi trường lỏng có sử dụng máy lắc. Ở giai đoạn này, cần xác định thời gian, pH, nhiệt độ, thành phần môi trường phù hợ p cho sinh khối thông đỏ phát triển. Đồng thời khảo sát lựa chọn chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất phù hợp. Nâng qui mô nuôi cấy lên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít với các điều kiện đã khảo sát. Thu hoạch sinh khối, nghiên cứu thành phần hóa học, chiết xuất, phân lập và nhận dạng các hoạt chất, xây dựng TCCS của nguyên liệu và hoạt chất. 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học và chiết xuất phân lập m ột số chất chính, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ 2.2.2.1. Nghiên cứu định tính và định lượng hoạt chất trong SKTB thông đỏ - Định tính các nhóm hợp chất trong sinh khối bằng các phản ứng hóa học đặc trưng và định tính paclitaxel và baccatin III bằng HPLC. - Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời paclitaxel và baccatin III trong sinh khối bằng HPLC. 4 2.2.2.2. Nghiên cứu chiết xuất phân lập và nhận dạng một số chất chính trong sinh khối Chiết xuất các hợp chất trong SKTB bằng phương pháp chiêt siêu âm, tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo và pha thuận. Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập được dựa trên các số liệu phổ UV, IR, ESI-MS, NMR: 1 H, 13 C-NMR, DEPT 90, DEPT 135, HSQC, HMBC, COSY và NOESY. 2.2.2.3. Nghiên cứu chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ SKTB thông đỏ Chiết xuất paclitaxel trong SKTB thông đỏ được tiến hành theo phương pháp chiết bằng siêu âm. Tinh chế sản phẩm bằng kết tủa, kết tinh phân đoạn và sắc ký cột pha đảo. Trong quá trình đó khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất và hàm lượng paclitaxel trong từng giai đoạn. 2.2.2.4. Xây dựng TCCS của Thông đỏ sinh khối Xây dựng TCCS của SKTB thông đỏ theo phương pháp c ủa DĐVN IV và Dược điển Mỹ 30. 2.2.2.5. Kiểm nghiệm chất lượng paclitaxel Tiến hành định lượng paclitaxel theo phương pháp trong chuyên luận paclitaxel trong USP 30. 2.2.3. Phương pháp phân tích xử lý kết quả nghiên cứu Kết quả nghiên cứu xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft excel. Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ 3.1.1. Tạo callus thông đỏ 3.1.1.1. Khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy tạo callus Bảng 3.5: Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy STT Môi trường Số mẫu cấy Khối lượng callus (mg) p 1 MS 50 14,3 ± 1,5 p 3-1 <0,05 2 SH 50 20,1 ± 2,1 p 3-2 <0,05 3 B5 50 24,5 ± 2,2 * 4 White 50 12,9 ± 1,5 p 3-4 <0,05 5 Khi sử dụng môi trường B5 nuôi cấy tạo callus, tốc độ phát triển của tế bào cũng cao hơn so với các môi trường còn lại (với p< 0,05 ). 3.1.1.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tạo callus thông đỏ cho thấy: khối lượng callus đạt cao nhất ngày thứ 35. Sau thời gian này khối lượng callus giảm dần. 3.1.1.3. Ảnh hưởng của các ch ất kích thích sinh trưởng * Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng Bảng 3.6: Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển của callus (n=50) STT Lô nghiên cứu Khối lượng callus (mg) 1 2,4-D + kinetin 17,8 ± 1,4 2 2,4-D + BAP 19,8 ± 2,7 3 NAA + kinetin 24,8 ± 2,5 4 NAA + BAP 21,2 ± 1,8 p 3-1 <0,05 p 3-2 <0,05 p 3-4 <0,05 Ở cặp phối hợp giữa NAA (1,0 mg/l) và kinetin (0,1 mg/l) cho tốc độ phát triển của tế bào cao hơn so với 3 cặp còn lại (p<0,05). * Ảnh hưởng của nồng độ NAA Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus(n=50) STT Nồng độ NAA (mg/l) Khối lượng callus (mg) 1 0,5 23,6 ± 2,1 2 1,0 24,1 ± 2.3 3 1,5 25,0 ± 1,8 4 2,0 26,8 ± 1,9 5 2,5 25,6 ± 1,7 p 4-1 < 0,05; P 4-2 < 0,05 p 4-3 < 0,05; p 4-5 > 0,05 Khi tăng nồng độ kinetin sử dụng thì khối lượng tế bào càng tăng và đạt cao nhất ở nồng độ NAA là 2,0 mg/l (p<0,05). Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ kinetin sử dụng thì khối lượng tế bào lại giảm. * Ảnh hưởng của nồng độ kinetin (ngày) 6 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus(n=50) STT Nồng độ kinetin (mg/l) Khối lượng callus (mg) 1 0,1 24,5 ± 1,8 2 0,2 27,9 ± 2,3 3 0,3 26,1 ± 1,9 4 0,4 25,9 ± 2,4 5 0,5 26,2 ± 2,2 p p 1-2 <0,05; p 2-3 >0,05 ; p 2-4 >0,05; p 2-5 >0,05 Nồng độ kinetin là 0,2 mg/l phù hợp nhất cho nuôi cấy tạo callus thông đỏ. Khi tăng nồng độ kinetin lớn hơn 0,2 mg/l thì khối lượng callus giảm. 3.1.2. Duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch 3.1.2.1. Ảnh hưởng của môi trường và số lần cấy chuyển Kết quả khảo sát duy trì nuôi cấy trên 2 môi SH và B5 cho thấy: ở môi trường B5 callus phát triển chậm, và bị biệt hóa nhiều thành mầm và chồi. Trong khi, ở môi trường SH callus thông đỏ phát triển nhanh hơn. Vì vậy l ựa chọn môi trường SH để nghiên cứu duy trì nuôi cấy tế bào thông đỏ. Bảng 3.9 : Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH Lần cấy chuyển Hình thái tế bào Khả năng biệt hóa Tỷ lệ tăng trưởng (lần) Lần 1 Tế bào cứng Biệt hóa thành mầm 1,87 Lần 2 Tế bào cứng, có một số đã mềm mại Biệt hóa thành các mô sẹo 2,25 Lần 3 Tế bào mềm mại Không còn biệt hóa 2,78 Lần 4 Tế bào mềm mại, xốp Không còn biệt hóa 3,51 Lần 5 Tế bào mềm mại, xốp Không còn biệt hóa 3,72 Sau 5 lần cấy chuyển trên môi trường thạch SH, tốc độ phát triển ổn định (đạt 3,72 lần) và không bị biệt hoá thành các mô, cơ quan. 3.1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển của callus thong đỏ được thể hiện ở bảng 3.10. 7 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus(n=10) STT Nồng độ saccharose (g/l) Khối lượng (g) Tỷ lệ tăng trưởng (lần) 1 10 1,16 ± 0,15 2,48 2 15 1,25 ± 0,13 2,65 3 20 1,75 ± 0,16 3,72 4 25 1,54 ± 0,13 3,29 5 30 1,26 ± 0,11 2,68 5 35 1,22 ± 0,14 2,60 7 40 1,12 ± 0,13 2,38 Ở nồng độ saccharose 20 g/l, tốc độ phát triển của callus tốt nhất (p<0,05), tốc độ tăng trưởng đạt 3,72 lần. 3.1.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của callus thông đỏ cho thấy: ở nhiệt độ từ 22-24 0 C khối lượng callus thông đỏ đạt cao hơn các nhóm khác (p<0,05), tỷ lệ tăng trưởng đạt 3,72 lần. 3.1.2.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy tới tốc độ phát triển của callus thông đỏ cho thấy: ở môi trường có pH 5,6 tế bào phát triển tốt nhất (p < 0,05), tỷ lệ sinh trưởng đạt 3,79 lần. 3.1.3. Kết quả nuôi cấy trong môi trường lỏng 3.1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 0 5 10 15 20 25 30 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Thigiannuôicy(ng à y) Khố i lượng tế bào tươi (g) KL khô Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy Tế bào thông đỏ phát triển tăng dần theo thời gian và đạt cao nhất ở ngày thứ 14. Các ngày tiếp theo, khối lượng tế bào giảm dần. 8 3.1.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy tới tốc độ phát triển của tế bào STT Tỷ lệ mẫu (%) Khối lượng tế bào (g) (n=10) Tỷ lệ sinh trưởng (lần) 1 10 17, 25 ± 0,57 1,73 ± 0,06 2 15 24,59 ± 0,89 2,48 ± 0,08 3 20 28,29 ± 1,36 2,83 ± 0,07 4 25 28,78 ± 2,81 2,89 ± 0,09 5 30 25,02 ± 2,05 2,60 ± 0,11 p 3-1, 3-2, 3-5 < 0,05, p 3-4 >0,05 Sử dụng tỷ lệ mẫu cấy 20% là thích hợp nhất cho nuôi cấy tế bào thông đỏ. Khi tỷ lệ mẫu 25% thì tỷ lệ tăng trưởng tế bào thay đổi không đáng kể (p 3- 4 >0,05) gây lẵng phí mẫu. 3.1.3.3. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy cho thấy: ở pH=5,6 tế bào phát triển tốt nhất, tỷ lệ sinh trưởng đạt 2,83 lần (p< 0,05). 3.1.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của tế bào cho thấy : ở nhiệt độ 24 0 C tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ tốt nhất, tỷ lệ tăng trưởng đạt 2,83 lần (p<0,05). 3.1.3.5. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng * Ảnh hưởng của nồng độ BAP Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế bào(n=10) STT Nồng độ BAP (mg/l) Khối lượng tế bào (g) Tỷ lệ sinh trưở ng (lần) 1 0,5 20,62 ± 1,41 2,06 ± 0,07 2 1,0 28,29 ± 1,36 2,82 ± 0,11 3 1,5 30,20 ± 1,61 3,02 ± 0,10 4 2,0 33,56 ± 1,60 3,27 ± 0,06 5 2,5 32,98 ± 1,33 3,28 ± 0,08 6 3,0 33,24 ± 1,63 3,30 ± 0,09 7 3,5 33,61 ± 1,27 3,34 ± 0,08 p 4-1 , 4-2 , 4-3 < 0,05, p 4-5 , 4-6 , 4-7 > 0,05 9 Ở nồng độ BAP 2,0 mg/l tỷ lệ tăng trưởng của tế bào đạt 3,27 lần (p< 0,05). Nếu tăng nồng độ BAP > 2,0 mg/l thì tỷ lệ phát tế bào ít thay đổi. * Ảnh hưởng của nồng độ NAA Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào STT Nồng độ NAA (mg/l) Khối lượng tế bào (g) (n=10) Tỷ lệ sinh trưởng (lần) 1 1,0 25,35 ± 1,51 2,53 ± 0,07 2 2,0 33,56 ± 1,60 3,27 ± 0,06 3 3,0 40,31 ± 1,84 4,01 ± 0,10 4 4,0 40,68 ± 1,46 4,05 ± 0,08 5 5,0 40,90 ± 1,79 4,07 ± 0,06 6 6,0 41,11 ± 1,71 4,09 ± 0,09 p 3-1 < 0,05 p 3-2 < 0,05 p 3-4 > 0,05 p 3-5 > 0,05 p 3-6 > 0,05 Sử dụng NAA 3,0 mg/l là phù hợp nhất cho nuôi cấy tế bào thông đỏ (tỷ lệ sinh trưởng đạt 4,01 lần). Nếu tăng nồng độ lên > 3 mg/l tỷ lệ phát tế bào ít thay đổi. 3.1.3.6. Ảnh hưởng của nồng độ đường. Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào STT Nồng độ saccharose (g/l) Khối lượng tế bào (g) (n=10) Tỷ l ệ sinh trưởng (lần) 1 15 30,20 ± 1,61 3,02 ± 0,08 2 20 40,31 ± 1,84 4,01 ± 0,10 3 25 44,33 ± 2,22 4,41 ± 0,11 4 30 51,61 ± 2,16 5,14 ± 0,09 5 35 46,75 ± 1,29 4,65 ± 0,12 p 4-1 < 0,05 p 4-2 < 0,05 p 4-3 < 0,05 p 4-5 >0,05 Sử dụng saccharose ở nồng độ 30 g/l, tốc độ phát triển tế bào cao nhất, khối lượng tế bào đạt 51,61 g/l và tỷ lệ tăng trưởng đạt 5,14 lần (p<0,05). 3.1.3.7. Khảo sát lựa chọn các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất a. Lựa chọn các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor) Bổ sung các elicitor gồm MJ, JA, acid caffeic, acid ferulic nồng độ 150 µM và dịch chiết nấm men nồng độ 100 µg/g vào ngày thứ 12 của chu kỳ nuôi c ấy. Sau 3 ngày nuôi cấy kết quả thể hiện trong bảng 3.21 10 Bảng 3.21: Ảnh hưởng của các elicitor tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào (n=10) STT Loại elicitor KL tế bào khô (g) Paclitaxel (mg/l) 1 Mẫu chứng 52,41±2,43 6,48±0,17 p 3-1 < 0,05 2 JA 36,83±2,10 8,84±0,21 p 3-2 < 0,05 3 MJ 38,98±1,98 9,39±0,20 * 4 Acid ferulic 45,22±2,21 7,53±0,14 p 3-4 < 0,05 5 Acid caffeic 46,39±1,86 7,64±0,18 p 3-5 < 0,05 6 Elicitor nấm 43,83±2,27 7,34±0,16 p 3-6 < 0,05 7 Acid salicylic 44,78±1,53 7,62±0,17 p 3-7 < 0,05 Trong số các elicitor, sử dụng methyl jasmonat (MJ) có hiệu quả nhất, lúc đó hàm lượng paclitaxel đạt 9,39 mg/l. Tuy nhiên, việc sử dụng elicitor dẫn đến làm giảm sự phát triển của tế bào so với nhóm không dùng. * Kết quả khảo sát lựa chọn nồng độ methyl jasmonat Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển cũng như hàm lượng paclitaxel trong tế bào thông đỏ cho thấy: sử dụng MJ ở nồng độ 100 µM, hàm lượng paclitaxel trong SKTB đạt cao nhất là 10,39 mg/l (p<0,05) và khối lượng tế bào giảm ít nhất (41,45 g). b. Khảo sát điều kiện sử dụng elicitor * Khảo sát lựa chọn thời gian tiếp xúc của elicitor Bảng 3.23: Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào(n=10) STT Thời gian tiếp xúc với elicitor (ngày) Khối lượng tế bào khô (g) Paclitaxel (mg/l) 1 mẫu chứng 48,31±2,34 6,49±0,31 p 6-1 < 0,05 2 1 44,37±2,12 7,21±0,26 p 6-2 < 0,05 3 2 44,23±1,97 8,75±0,21 p 6-3 < 0,05 4 3 41,45±2,04 10,39±0,37 p 6-4 < 0,05 5 4 42,98±2,02 11,06±0,28 p 6-5 < 0,05 6 5 42,37±2,17 12,32±0,12 * 7 6 39,65±1,98 9,93±0,27 p 6-7 < 0,05 Sau thời gian tiếp xúc 5 ngày giữa MJ và tế bào thì hàm lượng paclitaxel tăng cao nhất đạt 12,32 mg/l (với p<0,05). [...]... theo yờu cu chung ca DVN IV (ỏp dng vi dc liu) Ngoi ra, 23 ch tiờu nh tớnh v nh lng paclitaxel v baccatin III (nhng cht quan trng trong sinh khi) l ch tiờu quan trng quyt nh cht lng ca sinh khi v hiu qu ca sn phm cng c a vo TCCS õy l ln u tiờn ti Vit Nam cụng b TCCS ca nguyờn liu SKTB thụng KT LUN 1 Xõy dng quy trỡnh to sinh khi t bo thụng quy mụ phũng thớ nghim - La chn c mụi trng B5 b sung NAA (2,0... bằng HgCl + Tween 80 - Cấy vào MT B5 + NAA (2mg/l), Ki (0,2mg/l), saccharose (20g/l), pH=5,6 - Điều kiện nuôi cấy: 35 ngày, nhiệt độ240C, không có ánh sáng Tạo callus Callus - Môi trờng SH +NAA (2mg/l), Ki (0,2mg/), saccharose (20g/l), pH=5,6 - Nuôi trong điều kiện: t0= 22-240C; thời 35 ngày; không có ánh sáng Cấy chuyển 4 lần Duy trì nuôi cấy trong môi trờng thạch Callus/MT thạch - Môi trờng SH + NAA... tốc độ cánh khuấy 130 v/phút, thời gian:14 ngày Nuôi cấy trên môi trờng lỏng SKTB/MT lỏng Nuôi cấy trong hệ thống bioreactor 5 lít - Môi trờng SH + NAA (3mg/l), BAP (2mg/l), saccharose (30g/l+20g/l ở ngày thứ 10), thêm MJ (100àM) ngày thứ 12 - K nuôi cấy: tỷ lệ mẫu cấy 20%; t0=240C; pH=5,6; tốc độ cánh khuấy 60 v/phút, nồng độ oxy hoà tan 30%; thời gian:17 ngày Sinh khối/ Bioreactor - Thu sinh khối SKTB... t0=240C; pH=5,6; tốc độ cánh khuấy 60 v/phút, nồng độ oxy hoà tan 30%; thời gian:17 ngày Sinh khối/ Bioreactor - Thu sinh khối SKTB khô Lọc lấy tế bào Rửa 3 lần với nớc cất Sấy khô 40 -600C/10giờ KNSP Hỡnh 3.9 Quy trỡnh sinh khi t bo thụng 13 Kt qu xõy dng quy trỡnh thu hoch SKTB thụng nh sau: Rỳt hn dch SKTB thụng ra khi bỡnh nuụi cy v lng t nhiờn 1 gi Sau ú, lc bng mỏy hỳt chõn khụng thu ly khi... HO 8 10 3 5 4 7 6 7 8 9 Hỡnh 3.16 Cu trỳc hoỏ hc ca cỏc cht 1 9 3.2.3 Chit xut, tinh ch paclitaxel trong sinh khi t bo thụng 3.2.3.1 Chit xut paclitaxel trong sinh khi thụng *Giai on 1 ( chit lng rn):kho sỏt la chn dung mụi chit Bng 3.42 Kt qu chit xut paclitaxel bng cỏc dung mụi khỏc nhau ST Dung mụi Sn phm thụ Hm lng Hiu sut (%) T chit (g) paclitaxel (%) 1 Metanol 23,34 0,95 0,50 0,02 97,30 0,56... s dng elicitor v b sung saccharose Bng 3.25: nh hng ca thi im b sung saccharose(n=10) Thi im b Khi lng t Paclitaxel sung saccharose bo khụ (g) (mg/l) STT (ngy th) 1 Mu chng 48,232,11 6,510,09 p5-1 . sản xuất paclitaxel từ nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam theo hướng ứng dụng công nghệ SKTB thực vật, đề tài Nghiên cứu quy trình tạo SKTB thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc. ) để chiết xuất hoạt. luận án Đã nghiên cứu xây dựng được quy trình tạo SKTB thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc. ) quy mô phòng thí nghiệm. Khảo sát lựa chọn được thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy tế bào để tế. cấy tế bào thực vật. Các thiết bị nghiên cứu chuyên dụng trong nuôi cấy tế bào, phân tích. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xây dựng qui trình tạo sinh kh ối thông đỏ Quy trình tạo SKTB thông