1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ========***======== TRẦN THỊ DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX -PCR CHẨN ĐOÁN ĐỒNG THỜI BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV), BỆNH CÒI (MBV) VÀ BỆNH GAN TỤY (HPV) TRÊN THỦY SẢN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS. TS NGÔ ĐĂNG NGHĨA CN. ĐẶNG HÒA THỌ Nha Trang, tháng 08 năm 2010 2 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, cùng với nhu cầu sử dụng thực phẩm từ thủy hải sản đang ngày một tăng cao thì cũng đồng nghĩa với việc khai thác các nguồn lợi thủy hải sản biển cũng gia tăng gây cạn kiệt nguồn tài nguyên quý giá này. Trước tình hình đó việc phát triển tự phát nghề nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là sự bùng phát nghề nuôi tôm biển là một thực tế khách quan và là nhu cầu cần thi ết. Ở nước ta, mặc dù nghề nuôi tôm mới thực sự phát triển từ năm 1988 nhưng do lợi nhuận cao của nghề và do được sự ưu đãi của thiên nhiên nên ngành nghề nuôi tôm phát triển khá nhanh đặc biệt ở một số tỉnh ven biển miền Trung và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long như : Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng,… Diện tích nuôi ngày càng được mở rộng hơn, hiện có hơn 260.000 ha dùng để nuôi tôm với nhiều hình thức nuôi khác nhau. Khoa học kĩ thuật đã được áp dụng rộng rãi nhằm đáp ứng nhu cầu về con giống, thức ăn, thuốc,… với mục tiêu đạt sản lượng cao nhất trong thời gian ngắn nhất. Khi phát triển các hình thức nuôi tôm công nghiệp thì tôm được nuôi với mật độ rất cao. Do đó nếu kĩ thuật nuôi chưa được đảm bảo, việc áp dụng khoa học kĩ thu ật trong các công đoạn nuôi chưa được đồng bộ thì vấn đề ô nhiễm môi trường nước, phá vỡ môi trường sinh thái, bùng nổ và lây lan dịch bệnh… là một thực tế không thể tránh khỏi và gây ra nhiều thiệt hại lớn cho người nuôi và cho nền kinh tế. Theo tài liệu thống kê vào cuối năm 1993 đầu 1994 dịch bệnh lan rộng khắp các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, gây thiệt hại gần 294 tỷ đồng (Nguyễn Vi ệt Thắng, 1994 và Bùi Quang Tề, 1995) là một minh chứng cụ thể. Trong đó, WSSV (White Spot Syndrome Virus) là virus gây bệnh đốm trắng, một trong những bệnh quan trọng xảy ra trên rất nhiều các đối tượng tôm nuôi. Đặc trưng của bệnh là tỷ lệ chết cao và chết hàng loạt trong một thời gian rất ngắn tại các ao nuôi. MBV (Monodon baculovirus) và HPV (Hepatopancreatic parvovirus) là hai loại virus tuy không gây chết ồ ạt nhưng lại làm cho tôm chậm lớn. MBV gây thiệt hại và gây chết ở giai đ oạn cuối của 3 postlavae (>90%) và giai đoạn juvenile (70%). Bên cạnh đó thì HPV lại chủ yếu xâm nhiễm trên tôm trong giai đoạn mid –juvenile khiến cho gan teo lại, hoại tử … nguy cơ chết có thể lên đến 100% (trong vòng 4 -8 tuần). Hiện nay, ba loại virus này đang gây nhiều trở ngại lớn trong nuôi trồng thủy sản vì chưa có biện pháp chữa trị đặc hiệu. Vì vậy, ngoài biện pháp kỹ thuật nuôi tốt còn phải có phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả nhằm giám sát ba mầ m bệnh này từ lúc thả giống cho đến khi thu hoạch, phát hiện kịp thời tôm bị nhiễm bệnh để có biện pháp xử lý thích hợp. Việc ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong đó có phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh trên tôm là nguồn công cụ rất hữu ích và đem lại nhiều hiệu quả cao vì khả năng phát hiện nhanh nhạy và đặc biệt là phương pháp Multiplex –PCR có thể đồng thời phát hiệ n được nhiều virus trên tôm giúp hạn chế đáng kể thiệt hại cho nghề nuôi. Được sự phân công của Viện Công Nghệ Sinh Học - Môi Trường Trường Đại Học Nha Trang tỉnh Khánh Hòa và được sự đồng ý hướng dẫn của Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Xây dựng quy trình Multiplex -PCR chẩn đoán đồng thời bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh còi (MBV) và bệnh gan tụy (HPV) trên thủy sản”. Đây là một phương pháp mới có khả năng phát hiện đặc hiệu đồng thời ba loại bệnh trên tôm : bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh còi (MBV), bệnh teo gan tụy (HPV). Chỉ bằng một phản ứng duy nhất, mẫu tôm có thể được chẩn đoán chính xác khả năng nhiễm ba loại bệnh nói trên. Điều này có ý nghĩa rất lớn vì nó giúp tiết kiệm công sức lẫn chi phí xét nghiệm và quan trọng hơn hết đ ó là giúp cho nghề tôm có những phương pháp xử lý kịp thời khi thấy dấu hiệu có bệnh do tính năng nhanh nhạy của phương pháp. 4 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH 1.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới Hiện nay nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh và trở thành một trong những ngành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của rất nhiều nước trên thế giới. Từ những năm cuối của thập kỷ 80, nghề nuôi tôm đã có những bước phát triển nhanh chóng, các trại nuôi tôm được xây dựng ở gần 40 nước, đưa sản lượ ng tôm nuôi từ tỷ lệ 2,1% năm 1981 lên 22% năm 1988 so với tổng sản lượng tôm (Latscha, 1989). So với năm 1984, sản lượng tôm nuôi năm 1990 tăng 36,8% với gần 600.000 tấn (FAO, 1992). Năm 1995, sản lượng tôm nuôi đạt 712.000 tấn, chiếm 27% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản trên thế giới. Trong đó các nước Đông Bán Cầu chiếm 78% tổng sản lượng tôm nuôi, còn lại là các nước Tây Bán Cầu (Rosenberry, 1995). Hiện nay có khoảng 25 loài tôm đang được nuôi, nh ưng chỉ có 5 loài đạt sản lượng trên 10.000 tấn/năm và 3 loài đạt sản lượng 100.000 tấn/năm (Bộ Thủy Sản,1994). Trong đó loài tôm sú Penaeus monodon chiếm tới 53% tổng sản lượng tôm nuôi ở khu vực Châu Á – Thái Bình Dương. Vùng nuôi tôm sú tập trung chủ yếu ở Châu Á (Fast, 1992) điển hình ở các quốc gia như Thái Lan, Indonesia, Trung Quốc, Việt Nam, Đài Loan. Trên thế giới có khá nhiều hình thức nuôi tôm: nuôi quảng canh; nuôi quảng canh cải tiến; nuôi bán thâm canh; thâm canh và nuôi kết hợ p với cua, cá…(Liao, 1989). Và để chọn lựa hình thức nuôi nào phù hợp lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố như : kích thước ao, vốn đầu tư, kinh nghiệm quản lý, cơ sở vật chất hiện có, thị trường tiêu thụ sản phẩm (Kungvankij và Kongkeo, 1988). Lịch sử phát triển nghề nuôi tôm ở nhiều nước nhất là vùng Đông Nam Á cho thấy vấn đề thiệt hại do dịch bệnh trong nghề nuôi tôm là đi ều không thể tránh khỏi, tùy theo mô hình nuôi, sau một thời gian khai thác thì nhất định bệnh sẽ xuất hiện (Nguyễn Mạnh Hùng, 1994). Trung Quốc là nước có sản lượng tôm cao nhất thế giới, năm 1992 là 150.000 tấn; năm 1993 do bệnh dịch thiệt hại 50% tổng sản lượng. Đài Loan năm 1987 với đỉnh cao sản xuất 45.000 tấn tôm sú nuôi, năm liền sau đó sản lượng giảm xuống còn 30.000 tấn do tôm bị dịch bệnh. Indonesia cũng bị thiệt hại nặng nề do môi trường xấu và do dịch bệnh. Trong 6 quý 3 năm 1994, sản lượng tôm xuất khẩu của Indonesia sang Hoa Kỳ giảm 38%. Thái lan năm 1990, thiệt hại hơn 20.000 ha nuôi thâm canh tôm sú vì nước bị ô nhiễm bởi chất thải công nghiệp và bị bệnh. Năm 1994, tôm nuôi ở Thái Lan bị chết gần 30.000 ha mức thiệt hại lên đến 40 triệu USD (Phan Lương Tâm, 1994). 1.2 Tình hình dịch bệnh tôm ở Việt Nam Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Kiên Giang, là tiềm năng to lớn cho nuôi tr ồng thủy sản nước mặn và nước lợ. Nghề nuôi tôm ở nước ta mà đặc biệt là ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) cũng chỉ mới phát triển mạnh mẽ vào cuối những năm 1980 với sự phát triển của một số các hình thức nuôi như quảng canh cải tiến và bán thâm canh. Năm 1997, mô hình nuôi tôm công nghiệp ở quy mô nông hộ 700 – 1500 m 2 /ao (TS. Nguyễn Văn Hảo, 1998) được làm thí điểm tại Trà Vinh đạt năng suất 5 tấn/ha/vụ. Các mô hình nuôi tôm công nghiệp đạt kết quả cao, tạo tiền đề cho chương trình phát triển thâm canh hóa nghề nuôi tôm ở Việt Nam trong tương lai Ngoài các hình thức nuôi tôm giống như trên thế giới: quảng canh, quảng canh cải tiến, nuôi bán thâm canh và thâm canh thì nước ta cũng đã phát triển các hình thức nuôi sinh thái : nuôi tôm – rừng, tôm – lúa … Trong đó, hình thức nuôi quảng canh được áp dụng phổ bi ến ở Việt Nam, đặc biệt là vùng ĐBSCL (Vũ Đỗ Quỳnh, 1992). Tại Việt Nam, từ cuối năm 1993 dịch bệnh tôm đã được báo động trên toàn quốc, thiệt hại lớn nhất là ở các tỉnh ĐBSCL (Phan Lương Tâm, 1994). Tính đến 30 – 9 -1994, tổng diện tích nuôi tôm bị chết là 84.850 ha với thiệt hại ước tính 5.520 tấn trị giá 294 tỷ đồng (Bùi Quang Tề, 1995). Năm 1995, sản lượng tôm nuôi của Việt Nam là 50.000 tấn gi ảm còn 30.000 tấn năm 1997 (World Shrimp Farming, 1997). Theo TS. Nguyễn Văn Hảo và ctv năm 1997, tác nhân chính gây bệnh ở tôm nuôi vùng ĐBSCL ngoài nhóm Vibrios còn có sự xuất hiện của hai tác nhân Virus gây bệnh quan trọng là MBV ( Monodon baculovirus) và WSSV ( White Spot Syndrome Virus). Tác nhân gây bệnh Virus hiện nay được xem là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất, việc chữa trị bệnh do virus không hiệu quả vì hiện 7 nay chưa có một loại thuốc hay hóa chất nào có thể chữa bệnh virus (TS. Nguyễn Văn Hảo, 2000). Vì vậy cần phải có phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, hiệu quả và chính xác giúp khắc phục xử lý một cách triệt để làm giảm thiểu rủi ro lây nhiễm và thiệt hại cho nghề tôm. 2 TỔNG QUAN VỀ CÁC BỆNH NHIỄM 2.1 Đặc điểm sinh học và biểu hiện bệnh lí 2.1.1 Bệnh đốm trắng (WSSV –White spot syndrome virus) Phân bố: Bệnh đốm trắng WSSV xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á vào năm 1992 – 1993, đồng thời nhanh chóng lan rộng khắp khu vực Châu Á và thế giới nhất là các nước có hình thức nuôi tôm công nghiệp thâm canh. Bệnh đốm trắng được thông báo đầu tiên ở Trung Quốc, trong các đầm nuôi tôm sú với tỷ lệ chết cao (Chen, 1989). Năm 1992 -1993, bệnh đố m trắng xuất hiện ở Thái Lan (Flegel T.W, 1996). Năm 1993, Nhật Bản nhập tôm Trung Quốc về nuôi cũng đã xuất hiện bệnh đốm trắng. Năm 1994, đã có các báo cáo từ Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Nhật Bản và Thái Lan, tìm ra nguyên nhân gây bệnh đốm trắng. Trong những năm gần đây bệnh đốm trắng thường xuyên xuất hiện trong các khu vực nuôi tôm ven biển ở Việt Nam, hầu hết ở các tỉnh khi tôm bị nhiễ m bệnh đốm trắng thì tôm chết hàng loạt và gây tổn thất lớn cho nghề nuôi. 2.1.1.1 Phân loại Trước năm 2002, có ba chủng Baculovirus gây bệnh đốm trắng hay còn gọi là virus Trung Quốc. Tùy từng nước nghiên cứu mà chúng có tên gọi và kích thước khác nhau (Theo Bùi Quang Tề, 2003). Virus gây bệnh đốm trắng WSSV đầu tiên được phân loại thuộc họ Baculovirdae (Francki và ctv, 1991). Tuy nhiên, trong những phân tích trình tự hệ gen WSSV gần đây cho thấy chúng mã hóa một số loại protein không giống protein của Baculovirus nhờ protein ribonucleotide reductase (RR1 và RR2) (Van Hulten và cvt, 2000). Protein capsid (VP26, VP28) (Van Hulten và ctv, 2000) của WSSV không giống bất kì một protein nào trong database. Ngoài ra, trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen WSSV cho thấy nhiều gen không giống gen của virus nào khác (Van Hulten và ctv, 2001; Yang và ctv, 2001). Sự khác biệt 8 về genome và phổ kí chủ rộng của WSSV ( Flegel, 1997) chứng tỏ WSSV là đại diện cho một họ virus mới (Van Hulten và ctv, 2000). Trong hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002), các tác giả Just M. Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W.Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V. Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C. Loh và Peter J.Walker đã phân loại virus gây hội chứng đốm trắng thành một giống mới Whispovirus thuộc họ Nimaviridae. 2.1.1.2 Hình thái Là vi rút có kích thước lớn nhất trong các loại virus động vật. Các virion có dạng khá đối xứng, hình dạng biến thiên t ừ elip đến hình thoi. Virus dạng hình trứng, kích thước 120 x 275 nm, có phần phụ ở một đầu kích thước 70 x 300 nm (Woongteerasupaya C. Và ctv, 1995; Wang và ctv, 1995). Hình 1: Hình thái WSSV Virus đốm trắng tồn tại trong môi trường: Độ mặn: 5- 40 ppt pH: 4 -10 Nhiệt độ: 0 -79Oc 9 2.1.1.3 Cấu trúc protein và vật chất di truyền Hình 2: Cấu trúc di truyền của WSSV Hạt virus cấu trúc bao gồm 3 phần: bao màng (envelope), nucleocapside và vật chất di truyền. Virion chứa 5 protein chính : VP28, VP26, VP24, VP29, VP15 có trọng lượng phân tử tương ứng là 28, 26, 24, 19 và 15 kDa. Các thử nghiệm trung hòa in –vivo sử dụng các kháng thể kháng các protein cấu trúc khác nhau cho thấy có sự trì hoãn sự chết của tôm. Điều này chứng tỏ rằng VP28, VP68, VP281, VP466 và VP24 có lẽ có vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của virus. Hiện nay virus WSSV đã được giải mã trình tự hoàn chỉnh (Yang và ctv, 2001). 2.1.1.4 Phổ ký chủ Phổ ký chủ rộng, chủ yếu là các loại tôm: P. monodon, P. vannamei, P. indicus, P. Japonicus, … các loại cua và các động vật thủy sinh khác (theo V.A. Graindorge và T.W. Flegel, 1999). 2.1.1.5 Cơ chế xâm nhiễm Khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú ở nhiều bộ phận của tôm như nội bì, mô, dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi và các bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ , virus tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và nguyên liệu của tế bào. Quá trình này làm cho số lượng virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế bào. Virus tiếp tục phát triển đến giai đoạn làm vỡ nhân và giết chết tế bào, sau đó virus được phóng thích ra môi trường nước, đi tìm ký chủ khác và tiếp tục xâm nhập, tấn công. Nếu như virus không tìm được ký chủ mới thì nó ch ỉ có thể sống tự do trong nước khoảng 24 giờ. 10 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô in-vitro và những nghiên cứu trên hậu ấu trùng tôm (postlarva) cho thấy chu kỳ nhân lên của WSSV khoảng 20 giờ ở 25 o C và có thể được chia thành 6 giai đoạn:  Giai đoạn 1 : Giai đoạn sớm của sự xâm nhiễm. Những tế bào đã bị nhiễm virus có nhân phình to hơn bình thường. Một nucleosome virus xuất hiện trước khi các phần tử của virus được hình thành. Nucleosome bao gồm những protein của virus được tổ chức thành những mảnh hình sợi. Trong tế bào chất, lưới nội chất phát triển to với một lượng lớn ribosome tự do.  Giai đoạn 2 : Trong nhân, những vật liệu hình sợi kích thích sự hình thành những màng tròn, những màng này sau đó bao bọc lõi virus và bắt đầu quá trình đóng gói. Trong giai đoạn này, thể vùi loại Cowdry-A xuất hiện ở giữa vùng virogenic stroma (nơi DNA của virus phân chia và hình thành virus mới) và vùng marginated chromatin giàu điện tử (là vùng chứa mạng lưới phức tạp trong nhân). Nhân phình to và tròn.  Giai đoạn 3 : Trong nhân, nucleocapsid xuất hiện với mật độ điện tử thấp và phát triển dần từ một đầu đến đầu kia của nhân. Những thể vùi ở trung tâm của nhân xuất hiện nhỏ hơn so với thể vùi trong tế bào ở giai đoạn 2 và giàu điện tử hơn do sự hiện diện của một số lượng lớn phần tử virus. Sau đó, màng nhân bị phá hủy. Đ a số các bào quan của tế bào đều bất bình thường, bị phá vỡ hoặc hình thành những cấu trúc có màng.  Giai đoạn 4 : Trong nhân, nucleocapsid được tạo thành hoàn chỉnh từ 12-14 vòng gồm những đơn vị protein hình cầu được sắp xếp chặc chẽ. Mỗi nucleocapsid có một đầu tròn và một đầu vuông. Nucleocapsid sau đó được bao bọc hoàn toàn bởi vỏ.  Giai đoạn 5: Giai đoạn muộn. Phần tử virus có hình trứng và hình thành đuôi dài. Đuôi của virus gồm nucleocapsid bên trong được bao bọc bởi vỏ ở ngoài. Sau đó, nucleocapsid trở nên ngắn hơn, dày hơn và nhiều điện tử hơn do sự đóng gói của phức hợp DNA-VP15.  Giai đoạn 6 : Giai đoạn cuối. Virion trưởng thành có dạng hình ellip với vỏ trơn bao bọc nucleocapsid giàu điện tử và một đuôi dài. Đôi khi, việc đóng gói nucleocapsid diễn ra riêng biệt với vỏ bao và sau đó mới được bao bọc [...]... nhân phồng to là một chỉ thị của sự nhân bản và tích lũy virion bên trong nhân và là dấu hiệu đặc trưng của bệnh Ở hội chứng bệnh đốm trắng, các thể ẩn ưa kiềm hiện diện trong nhân của các tế bào biểu bì, ruột trước, mang và hệ bạch huyết, còn ở bệnh còi và bệnh teo gan tụy các thể ẩn lại hiện diện trong nhân của các tế bào biểu bì mô hình ống của gan tụy và tế bào biểu bì phía trước ruột giữa 20 Cần... lượng và kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT -PCR) 3.4.2 Kỹ thuật nested PCR 22 Hình 11: Kĩ thuật Nested PCR Là phản ứng PCR có hai giai đoạn : giai đoạn đầu là PCR dùng một cặp mồi ngoài (gọi là PCR vòng ngoài) để khuếch đại một đoạn DNA trong đó có chứa các trình tự đặc hiệu muốn tìm, sau đó dùng sản phẩm PCR vòng ngoài này làm khuôn cho vào ống PCR có cặp mồi trong (gọi là PCR vòng trong) để khuếch đại trình. .. cặp mé bờ, sau đó chết và chìm xuống đáy (Y.G Wang và ctv, 1998) Khi nhiễm bệnh thì có dấu hiệu trương nhân trong tế bào cảm nhiễm ( Chou và ctv, 1995) 2.1.1.7Phương thức lây nhiễm bệnh Bệnh đốm trắng lây truyền chủ yếu theo chiều ngang Virus lây từ giáp xác khác nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay trong ao nuôi tôm Bệnh đốm trắng không có khả năng lây lan theo đường thẳng đứng,... nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng, cụ thể: 3.4.1 Phương pháp MULTIPLEX PCR Phản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông thường, ở đó hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng hay nói cách khác Multiplex PCR là phản ứng PCR mà chỉ cần trong một phản ứng ta có thể xác định đồng thời được nhiều tác nhân vi sinh vật dựa trên nguyên lí sử dụng... thường và bị thể vùi đẩy vào 1 góc, giáp với màng nhân và dính liền với thể vùi Hình 9: Tế bào gan tụy dưới kính hiển vi điện tử sau khi được nhuộm H & E 2.1.3.6 Biểu hiện bệnh lý Tôm có màu sẫm, mang đỏ hay đen, vỏ có nhiều sinh vật đơn bào và vi sinh vật bám Gan tụy teo lại chỉ bằng 1/3 thể tích gan bình thường, nếu dùng tay bóp mạnh thì thấy gan tôm rất cứng và chai Khi nhiễm bệnh tôm có màu vàng... pháp PCR được sử dụng phát hiện WSSV, MBV, HPV bằng cách sử dụng DNA tách chiết từ mẫu tôm nghi bệnh làm khuôn cho phản ứng PCR và cặp mồi được thiết kế ở hai đầu của một đoạn DNA chuyên biệt trên từng virus Điện di trên gel agarose để phát hiện vạch PCR dựa trên kích thước của đoạn DNA được khuếch đại Ngày nay, dựa trên kỹ thuật PCR cổ điển, người ta đã phát triển nhiều kỹ thuật chẩn đoán nhanh và chính... cao Dạng III bệnh xuất hiện mãn tính tổ chức mô phá huỷ thấp không có đốm trắng và không có màu đỏ, tỷ lệ tôm chết kéo dài từ 15 - 28 ngày Hình 3: Tôm bệnh xuất hiện các đốm trắng đường kính 0.2 -0.5 mm 11 Bệnh đốm trắng xảy ra kèm theo sự tiêu thụ thức ăn giảm nhanh (Takahashi và ctv, 1994) do tôm có biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ kém hoạt động, thường có khuynh hướng cặp mé bờ, sau đó chết và chìm xuống... trong bùn và nước 15 Hình 6 : Sự xâm nhiễm của virus MBV trong nhân tế bào gan tụy khi quan sát bằng H&E (Trích từ T.W Flegel, 2006) 2.1.2.6 Dấu hiệu bệnh lý Tôm có màu tái hay xanh tái, xanh xẫm, tôm giảm ăn, hoạt động yếu và sinh trưởng chậm Phần phụ và vỏ kitin có hiện tượng hoại tử, có nhiều sinh vật bám như ký sinh trùng đơn bào, tảo và các vi khuẩn dạng sợi Gan tụy teo, có màu trắng hơi vàng thối... oligonucleotide có trình tự bổ xung với trình tự của một đoạn DNA trên mạch khuôn, giới hạn bởi 2 trình tự bổ sung với trình tự của hai 2 đoạn mồi, trong phản ứng PCR Hai đầu của đoạn dò được gắn hai chất gọi là reporter và quencher, khi reporter và quencher ở gần nhau thì quencher làm mất màu của reporter, khi reporter và quencher ở xa nhau thì reporter phát huỳnh quang Ở mỗi chu kỳ PCR, trước hết là sự gắn vào... hành đặt phản ứng PCR với chứng dương (hoặc các mẫu đã biết trước dương tính với bệnh) của WSSV, MBV, HPV và các bệnh trên tôm do các virus khác gây ra, để kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi với trình tự virus cần quan tâm Tiến hành điện di phân tích kết quả 3.7 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY CỦA QUY TRÌNH Nguyên tắc: Độ nhạy là một yếu tố quy t định giá trị của một phương pháp chẩn đoán Nó cho biết giới . bệnh còi (MBV) và bệnh gan tụy (HPV) trên thủy sản . Đây là một phương pháp mới có khả năng phát hiện đặc hiệu đồng thời ba loại bệnh trên tôm : bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh còi (MBV), bệnh. Hòa và được sự đồng ý hướng dẫn của Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Xây dựng quy trình Multiplex -PCR chẩn đoán đồng thời bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh. DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ========***======== TRẦN THỊ DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX -PCR CHẨN ĐOÁN ĐỒNG THỜI BỆNH ĐỐM