i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Lê Lập - Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi Trùng - Phân viện Thú y Miền Trung, TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Bác sĩ Lê Đình Hải và KS. Lưu Thị Nguyệt Minh - Bộ môn Nghiên cứu Vi Trùng - Phân viện Thú y Miền Trung đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cám ơn: ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các cán bộ - Bộ môn Nghiên cứu Vi Trùng và tập thể cán bộ công nhân viên – Phân viện Thú y miền Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. Nha Trang, tháng 6, năm 2011 Sinh viên Ngọ Thị Ngọc Tú ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC BẢNG vii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1. 1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 3 1.1.1. Nước ngoài 3 1.1.2. Trong nước 5 1.2. ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN C. perfringens 5 1.2.1. Phân loại 5 1.2.2. Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu. 6 1.2.3. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa 7 1.2.4. Đặc tính di truyền. 9 1.2.5. Sức đề kháng của C. perfringens 9 1.2.6. Các type độc tố (toxinotype) và khả năng gây bệnh 10 1.2.6.1. Type A 11 1.2.6.2. Type B 12 1.2.6.3. Type C 12 1.2.6.4. Type D 13 1.2.6.5. Type E 14 1.3. MỘT SỐ ĐỘC TỐ CHÍNH CỦA C. perfringens [18] 14 1.3.1. Alpha toxin (CPA) 14 1.3.2. Beta toxin (CPB) 15 1.3.3. Epsilon toxin (ETX) 15 iii 1.3.4. Iota toxin (CPI) 16 1.3.5. Enterotoxin (CPE) 16 1.3.6. Delta toxin 16 1.3.7. Theta toxin 17 1.4. HIỂU BIẾT VỀ ĐỘC TỐ EPSILON (ETX) CỦA C. perfringens 17 1.4.1. Tính chất vật lý và tính chất hóa học của ETX 17 1.4.2. Gen mã hóa ETX 17 1.4.3. Độc lực độc tố epsilon và phương pháp xác định 18 1.4.4. Cơ chế gây bệnh của độc tố epsilon (ETX) 19 1.5. MỘT SỐ LOẠI BỆNH DO VI KHUẨN C. perfringens GÂY RA TRÊN DÊ, CỪU 20 1.5.1. Bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết trên dê, cừu 20 1.5.2. Bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu do C. perfringens gây ra 21 1.6. ENZYME TRYPSIN 22 1.7. PHƯƠNG PHÁP PCR 23 1.7.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR 23 1.7.2. Thực nghiệm 24 1.7.3. Các tác nhân ảnh hưởng đến phản ứng PCR 25 1.7.4. Phương pháp phân tích kết quả PCR 27 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 29 2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 29 2.3. VẬT LIỆU, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 29 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.4.1. Giám định một số đặc tính sinh học, hóa học của vi khuẩn C. perfringens theo phương pháp của Quinn P.J. và cộng sự (1994) [34]. 29 2.4.2. Xác định gen mã hóa độc tố epsilon bằng phản ứng PCR 31 iv 2.4.3. Kiểm tra khả năng biểu hiện gene mã hóa độc tố epsilon trên động vật thí nghiệm 34 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 35 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA VI KHUẨN C. Perfringens 36 3.1.1. Kết quả kiểm tra hình thái của vi khuẩn C . perfringens 36 3.1.2. Kết quả kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp soi tươi 36 3.1.3. Đặc tính nuôi cấy 37 3.1.4. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens 38 3.2. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ ETX BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 41 3.3. KẾT QUẢ KIỂM TRA BIỂU HIỆN CỦA EPSILON TOXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGIỆM 42 3.3.1. Kết quả kiểm tra biểu hiện của epsilon toxin trên chuột nhắt trắng 42 3.3.2. Kết quả kiểm tra biểu hiện của độc tố epsilon toxin trên dê 44 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 4.1. KẾT LUẬN 46 4.2. ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT C. perfringens Clostridium perfringens E. coli Escherichia coli ĐC + Đối chứng dương ĐC – Đối chứng âm BHI Brain Heart Broth TBE Tris Boric EDTA SPS Agar Perfringens Selective Agar DNA Deoxyribonucleic Acid dNTPs Deoxynucleotide Triphosphate PCR Polymerase Chain Reaction CPA Clostridium perfringens Alpha toxin CPB Clostridium perfringens Beta toxin ETX Clostridium perfringens Epsilon toxin IA Clostridium perfringens Iota toxin CPE Clostridium perfringens Enterotoxin Cpa Gene mã hóa Clostridium perfringens Alpha toxin Cpb Gene mã hóa Clostridium perfringens Beta toxin Etx Gene mã hóa Clostridium perfringens Epsilon toxin Ia Gene mã hóa Clostridium perfringens Iota toxin Cpe Gene mã hóa Clostridium perfringens Enterotoxin NĐRH Bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết MDCK Tế bào thận chó Madin Darby vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn C. perfringens 6 Hình 1.2. Hiện tượng dung huyết beta 8 Hình 1.3. Cấu trúc của plasmid mang gene Etx 18 Hình 1.4. Thiết kế primer phân biệt etx gene C. perfringens type D và B 18 Hình 1.5. Phản ứng PCR 25 Hình 2.1. Tiêm độc tố vào tĩnh mạch chuột 34 Hình 2.2. Theo dõi chuột chết 34 Hình 2.3. Tiêm độc tố vào tĩnh mạch cổ trên dê 35 Hình 2.4. Mổ khám kiểm tra bệnh tích 35 Hình 3.1. Hình thái của vi khuẩn C. perfringens soi trên kính hiển vi 36 Hình 3.2. Hình thái vi khuẩn C. perfringens khi soi tươi 37 Hình 3.3. Vi khuẩn C. perfringens trên môi trường Fluid thioglycolate 37 Hình 3.4. Khuẩn lạc trên môi trường SPS. 38 Hình 3.5. khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 38 Hình 3.6. Kết quả kiểm tra lên men đường 39 Hình 3.7. Kết quả nuôi cấy trên môi trường Litmus milk 39 Hình 3.8. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường Egg yolk 40 Hình 3.9. Kết quả CAMP – test 40 Hình 3.10. Kết quả giám định gene mã hóa độc tố ETX bằng phản ứng PCR 42 Hình 3.11. Phổi, gan bị sưng, tụ huyết 45 vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Vị trí gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C. perfringens 9 Bảng 1.2. Đặc tính phát triển của C. perfringens 10 Bảng 1.3. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens 10 Bảng 1.4. Các bệnh gây ra bởi các type vi khuẩn C. perfringens 11 Bảng 1.5. Các enzyme thường sử dụng trong phản ứng PCR 26 Bảng 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 32 Bảng 2.2. Thành phần tham gia phản ứng PCR 33 Bảng 2.3. Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng PCR 33 Bảng 3.1. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens 41 Bảng 3.2. Kết quả biểu hiện của epsilon toxin trên chuột nhắt trắng 43 Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra biểu hiện của epsilon toxin trên dê 44 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Clostridium perfringenes là một vi khuẩn yếm khí, gram dương, có khả năng sinh bào tử thường được tìm thấy trong tự nhiên (trong đất, nước, và đường tiêu hóa của nhiều loài động vật). Nó được coi là một trong những vi khuẩn chủ yếu gây ra nhiều bệnh cho người và nhiều loài gia súc, gia cầm khác nhau. Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C. perfringens sản sinh hơn 17 loại độc tố khác nhau như: Độc tố Alpha (α), Beta (β), Epsilon (ε), Iota (i), Beta2, Enterotoxin, Theta, vv…Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính (alpha, beta, epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn C. perfringens thành 5 type độc tố (toxinotype) khác nhau (A, B, C, D, E). Các type khác nhau thường gây ra các thể bệnh khác nhau cho người và động vật. Trong số các loại độc tố do C. perfringenes sản sinh, độc tố epsilon toxin (ETX) được tạo ra bởi vi khuẩn C. perfringens type B và type D có độc lực mạnh nhất. Các kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy C. perfringens type D đóng vai trò quan trọng trong bệnh viêm ruột hoại tử dê, cừu ở Việt Nam [3,4]. Độc tính của độc tố epsilon, chỉ xếp sau độc tố botulinum và tetanus, được trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh của Mỹ liệt vào nhóm chất khủng bố sinh học. Độc tố epsilon được mã hóa bởi gene Etx, gene này nằm trên plasmid của vi khuẩn C. perfringens, tiết ra trong đường ruột dưới dạng tiền độc tố (prototoxin), trọng lượng phân tử khoảng 34,25 kDa, sau đó được hoạt hóa bởi enzyme protease như trypsin. Trypsin sẽ cắt đứt liên kết peptid giữa axit amin thứ 14 và 15 (Lys – 14 – Ala – 15) tính từ đầu N của chuỗi peptid, giải phóng một đoạn peptid gồm 14 axit amin, hoạt hóa cho ETX hoạt động. Độc tố epsilon tác dụng lên nhóm lipid: Cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào động vật có xương sống, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận của con bệnh. Độc tố epsilon được hấp thụ thông qua dịch nhầy của ruột vào máu đi khắp cơ thể và đến các cơ quan bên trong. Tại đây độc tố làm tăng áp lực thành mạch, gây phá hủy màng trong của mạch máu, làm tăng tính thấm thành mạch và tích dịch trong các xoang của cơ thể, gây phù một số cơ quan, đặc biệt là não, tim, phổi, gan và thận [18]. Khi tác động vào con vật, độc tố sẽ gây tổn thương não, làm rối loạn các chức năng thần kinh bình thường, con vật sẽ bị mù, la hét, mất phương hướng và không có khả năng ăn uống…Thận cũng sẽ 2 bị phân giải, xuất huyết, kèm theo một loạt các triệu chứng thông thường khác như: tiêu chảy, phân có lẫn máu và niêm mạc, đặc biệt có mùi thối khắm, co giật toàn thân, nghiến răng…và cuối cùng là dẫn đến chết nếu không được chữa trị kịp thời. Để tìm hiểu về độc tính và tác động gây bệnh của độc tố epsilon do C. perfringens type D tiết ra, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Khả năng biểu hiện gene etx mã hóa độc tố Epsilon của vi khuẩn Clostridium perfringens type D trên động vật thí nghiệm ” . Nội dung của đề tài: 1. Kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của 10 chủng C. perfringens type D phân lập từ dê mắc bệnh viêm ruột hoại tử. 2. Giám định gene Etx mã hóa độc tố epsilon bằng kỹ thuật PCR . 3. Nghiên cứu khả năng biểu hiện gene Etx mã hóa độc tố epsilon trên động vật thí nghiệm. Mục tiêu của đề tài: Góp phần cung cấp những thông tin về độc tố epsilon của chủng C. perfringens đang tồn tại và gây bệnh viêm ruột hoại tử ở dê trong những năm gần đây. Giúp đề xuất biện pháp phòng trị bệnh có hiệu quả, để giảm thiểu tối đa những thiệt hại do độc tố epsilon vi khuẩn C. perfringens gây ra. 3 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.1.1. Nước ngoài Vào năm 1892 tại phòng thí nghiệm trường đại học Johns Hopkins ở Baltimore, lần đầu tiên vi khuẩn C. perfringens được phát hiện và đặt tên là Bacillus aerogenes capsulatus bởi William Welch và George Nuttall, sau đó được đổi thành Bacillus welchii, và đến nay được gọi là C. perfringens [18]. C. perfringens là trực khuẩn yếm khí, gram dương, có khả năng sinh bào tử, thường tìm thấy trong tự nhiên (trong đất, nước, và ống tiêu hóa của nhiều loài động vật). Nó được coi là một trong những vi khuẩn độc nhất được biết đến, nó là tác nhân gây ra nhiều thể bệnh khác nhau không chỉ nguy hiểm cho nhiều loài gia súc, gia cầm mà còn nguy hiểm đến con người. Hiện nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước nghiên cứu về vi khuẩn C. perfringens ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Theo Field và cộng sự (1955) thuộc trường Đại học Cambridge, từ những năm 50 vi khuẩn C. perfringens (lúc đó có tên gọi Clostridium wellchii) đã gây bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết – enterotoxaemia (NĐRH) đối với động vật nuôi như bê sơ sinh (Griner & Bracken, 1953), cừu non (Griner & Jonhson, 1954) và có thể gây chết heo con (Field & Gibson, 1955). Bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết phát triển làm xuất hiện trong ruột những đốm nhỏ viêm xuất huyết [16]. Niilo L. và Chalmers G. A. (1982) đã phát hiện bệnh NĐRH ở ngựa con 4 ngày tuổi tại Alberta, Canada. Bệnh này làm ngựa con chết, mổ khám phát hiện ruột có nhiều điểm nhỏ xuất huyết và viêm hoại tử. Cũng tại miền Nam Alberta vào năm 1973, lần đầu tiên phát hiện C. perfringens type D trên bê [29, 30]. Niilo L. (1986) cho biết đã phân lập được C. perfringens type C, type D từ tá tràng của cừu trưởng thành 8-9 tháng tuổi, cừu thường chết vì bị xuất huyết ruột với những điểm hoại tử [31]. Năm 1998, Miserez và cộng sự tiến hành định type vi khuẩn C. perfringens trên dê, cừu với 52 mẫu bệnh phẩm biểu hiện triệu chứng của bệnh viêm ruột hoại tử và 13 mẫu dê, cừu khỏe mạnh. Kết quả cho thấy tất cả 52 mẫu bệnh phẩm [...]... 1.4.2 Gen mã hóa ETX Ph n ng PCR ã ư c s d ng xác nh s có m t c a gen mã hóa c t epsilon c a các ch ng C perfringens type B và D nuôi c y trong các phòng thí nghi m Gen etx mã hóa c t epsilon n m trên plasmid l n có kh năng chuy n ngang gi a các vi khu n (conjugative plasmid) Toàn b plasmid có Kb (hình 1.3), và o n mã hóa cho d i trên 64 c t epsilon trên 1Kb trong ó có 933 nucleotid mã hóa cho 311... i Canxi màng gây r i lo n các ch c năng th n kinh bình thư ng [18] 1.3.3 Epsilon toxin (ETX) c t epsilon ư c t o ra b i vi khu n C perfringens type B và type D ETX ư c mã hóa b i gene etx, gene này n m trên plasmid c a vi khu n, tr ng lư ng phân t kho ng 34,25 kDal ETX ư c ti t ra d i d ng ti n ư c ho t hóa b i enzyme protease như trypsin [25] Trypsin s c t peptid gi a axit amin th 14 và 15 (Lys –... ng i n di, phương pháp hi n hình phát hi n phân t DNA, ngư i ta d ng i v i gel agarose, ngư i ta nhu m b ng Ethidium bromide (C21H20BrN3) Ethidium bromide có kh năng g n xen vào gi a các nucleotide c a các phân t DNA Do ó các phân t DNA s g n k t v i Ethidium bromide và phát huỳnh quang khi ư c kích thích b ng tia t ngo i D a vào v trí các v t huỳnh quang này ngư i ta bi t v trí các o n DNA trên gel... nhóm lipid: Cholesterol và sphingolipid có m t trên màng t bào ng v t có xương s ng, vì v y c t này t p trung não và th n 1.3.4 Iota toxin (CPI) c t Iota ư c ti t ra b i vi khu n C perfringens type E Gen mã hóa t này n m trên plasmid CPI là c t g m 2 ph n là 2 polypeptid c cl pv i nhau V trí ho t hóa enzyme g i là Iota a (gene mã hóa Ia) và v trí g n ct v i t bào bi u mô ích Iota b (gene mã hóa Ib)... i mã kh i u (start codon - ATG) và k t thúc b ng m t mã d ng (stop codon - TAA) [6] So sánh trình t gen c a EtxB và EtxD trong khung c m cho th y ch sai khác 2 nucleotide, k t qu c a quá trình d ch mã ch có 1 axit amin ư c thay th [18] 1.4.3 cl c c t epsilon và phương pháp xác Có nhi u phương pháp do c t gây ra hi n s có m t c a phát hi n nh c t epsilon và giám nh các b nh ng v t Các k thu t mi n d. .. c trên t bào (cytotoxicity): Nghiên c u v c tính c a c t epsilon trên t bào nuôi c y cho th y r ng t bào d ng MDCK (t bào th n chó Madin Darby) r t nh y c m v i ch t ti t trong canh trùng C perfringens type D, vì th có th d ng phương pháp gây nhi m trên t bào nuôi c y phương pháp th vivo c a thay th cho các c l c trên chu t Hi n nay, phương pháp xác nh c l c in c t epsilon do C perfringens type D s...4 trên d , c u b b nh u phát hi n ư c gene mã hóa c t alpha và epsilon, còn trên d , c u kh e m nh thì 11/13 thu c ch ng type A và 2/13 thu c ch ng type D T k t qu này cho th y vi khu n C perfringens type D có d , c u kh e m nh và b b nh, chúng là nguyên nhân chính gây b nh ho i t trên d , c u [26] Manteca C và c ng s (2001) ã phân l p ư c C perfringens type A t d múi kh b xu t huy... i vi khu n C perfringens type B và type C là m t protein m n c m cao v i trypsin, gây ho i t t bào bi u mô ru t và t bào màng trong ru t Gene mã hóa cho c t beta là cpb, gene này n m trên plasmid c a vi khu n Cpb có tr ng lư ng phân t kho ng 40 kDa, tương ương v i 1113 nucleotid mã hóa cho 371 axit amin, i m u g n gi ng cpa, vì v y r t khó ch d a vào 2 ng i n pI = 5,6 C 2 phân tách ư c 2 c tính trên. .. gi a hai b gene c a hai loài này ch y u là do nh ng gene có kh năng sinh c t c a C perfringens Vi c xác gene gây nh trình t b gene c a vi khu n C perfringens cho th y các c không có tác ng c ng g p v i nhau mà có s tác Các nghiên c u cũng cho th y r ng c t alpha là lo i ct ng riêng r ư c t t c các type vi khu n C perfringens s n sinh ra Gene mã hóa các lo i ct vi khu n này không ch n m trên nhi m... noradrenalin trong não sau khi tiêm i v m c adrenalin và c t epsilon vào tĩnh m ch và quan sát trong vòng 30 phút, tuy nhiên m c dopamine l i gi m xu ng r t th p Dopamine là ch t d n truy n th n kinh não, có tác d ng b o v não ch ng l i tác ng c a ct epsilon [28] 1.5 M T S LO I B NH DO VI KHU N C perfringens GÂY RA TRÊN D , C U Vi khu n C perfringens có kh p nơi trong t nhiên và là m t ph n c a h vi . Khả năng biểu hiện gene etx mã hóa độc tố Epsilon của vi khuẩn Clostridium perfringens type D trên động vật thí nghiệm ” . Nội dung của đề tài: 1. Kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của. type D phân lập từ d mắc bệnh vi m ruột hoại tử. 2. Giám định gene Etx mã hóa độc tố epsilon bằng kỹ thuật PCR . 3. Nghiên cứu khả năng biểu hiện gene Etx mã hóa độc tố epsilon trên động vật. số động vật khác. Ngoài độc tố alpha, vi khuẩn type D còn có khả năng sản sinh một loại độc tố khác, độc tố epsilon, một loại độc tố rất độc. Đích của độc tố này là nhóm lipid, vì vậy độc tố