i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô và bạn bè. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến: Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm và quý thầy cô khoa Công nghệ Thực phẩm, các cán bộ phụ trách phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện về vật chất, trang thiết bị để tôi hoàn thành đề tài này. Tiến sĩ Hoàng Thị Huệ An (Bộ môn Hóa) đã tận tình hướng dẫn, cho tôi tiếp cận với các phương pháp nghiên cứu hiện đại, hoàn thiện kiến thức và hoàn thành luận văn. Tiến sĩ Trần Thị Hoàng Quyên (Bộ môn Hóa) đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong việc tìm kiếm tài liệu phục vụ cho việc nghiên cứu đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 12 tháng 07 năm 2012 Sinh viên thực hiện Lương Thị Trúc Mai ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 PHẦN 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về hoa cúc vạn thọ. 3 1.1.1. Tên gọi 3 1.1.2. Phân loại và đặc điểm hình thái 3 1.2. Tổng quan về enzyme 5 1.2.1. Giới thiệu về enzyme Viscozyme 5 1.2.2. Ứng dụng của Viscozyme 6 1.3. Khái quát về lutein 7 1.3.1. Cấu tạo phân tử 7 1.3.2. Tính chất lý-hóa 8 1.3.3. Hoạt tính sinh học 9 1.3.4. Ứng dụng 10 1.3.5. Các nguồn lutein trong tự nhiên 11 1.4.2. Tính chất lý-hóa 13 1.4.3. Hoạt tính sinh học 13 1.4.4. Ứng dụng 14 1.5. So sánh khả năng hấp thụ của lutein và lutein ester 15 1.6. Các nghiên cứu xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme 15 PHẦN 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1. Nguyên liệu-Hóa chất 21 iii 2.1.1.1. Nguyên liệu: 21 2.1.1.2. Hóa chất: 21 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 21 2.1.2.1. Dụng cụ: 21 2.1.2.2. Thiết bị 21 2.2. Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu 22 2.2.2. Xác định thành phần khối lượng của nguyên liệu 22 2.2.3. Xác định một số thành phần của hoa 22 2.2.3.1. Xác định lutein tổng số: 22 2.2.3.2. Xác định % TL khô của hoa 23 2.2.4. Bố trí thí nghiệm 23 2.2.4.1. Quy trình chiết lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ sau khi xử lý bằng Viscozyme 23 2.2.4.2. Xây dựng quy trình xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme 24 2.2.5. Thử nghiệm chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ đã được xử lý bởi 33 2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu 33 PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. Kết quả một số thành phần chính của hoa cúc vạn thọ 34 3.2. Kết quả bố trí thí nghiệm 35 3.2.1. Kết quả xác định nồng độ enzyme Viscozyme thích hợp 35 3.2.2. Kết quả xác định tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu thích hợp 36 3.2.3. Kết quả xác định pH tối ưu 37 3.2.4. Kết quả xác định tốc độ ủ, lắc thích hợp 38 3.2.6. Kết quả xác định thời gian ủ thích hợp 40 3.3. Đánh giá hiệu suất chiết của phương pháp chiết mới so với phương pháp truyền thống chiết lutein ester 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHẦN PHỤ LỤC 50 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt A BHT D FAO Absorbance Butylated Hydroxytoluene Dilution factor Food and Agriculture Organization Độ hấp thụ Butylat Hydroxytoluen Hệ số pha loãng Tổ chức nông lương của Liên Hợp Quốc h PE Rpm TL khô UV-Vis v/v Hour Petroleum ether Round per minute Ultraviolet-Visible Volume/volume Giờ Ete dầu hoả Vòng/phút Trọng lượng khô Tử ngoại-khả kiến Thể tích/thể tích v/w w/w Volume/weight Weight/weight Thể tích/ khối lượng Khối lượng/khối lượng v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Hàm lượng lutein cho phép được có trong thực phẩm 11 Bảng 1.2. Các nguyên liệu có chứa lutein trong tự nhiên 12 Bảng 3.1. Thành phần khối lượng của hoa cúc vạn thọ 34 Bảng 3.2. Một số thành phần chính của hoa cúc vạn thọ 34 Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm quy trình xử lý hoa cúc vạn thọ với Viscozyme 43 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Hoa cúc vạn thọ Châu Phi 5 Hình 1.2. Quá trình thủy phân thành tế bào cánh hoa cúc vạn thọ 6 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của lutein 8 Hình 1.4. Cấu tạo phân tử lutein ester 13 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình dự kiến chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ 24 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ Viscozyme thích hợp 27 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ Viscozyme:nguyên liệu 28 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ pH thích hợp 29 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tốc độ lắc thích hợp 30 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ lắc thích hợp 31 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ thích hợp 32 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ Viscozyme đến hiệu suất chiết lutein ester 36 Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ Viscozyme:nguyên liệu đến hiệu suất chiết lutein ester 37 Hình 3.3. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất chiết lutein ester 38 Hình 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ ủ, lắc đến hiệu suất chiết lutein ester 39 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ, lắc đến hiệu suất chiết lutein ester 40 Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu suất chiết lutein ester 41 Hình 3.7. Sơ đồ quy trình xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme 42 Hình 3.8. Dịch chiết chứa lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ 44 1 MỞ ĐẦU Lutein, một sắc tố tự nhiên màu vàng cam thuộc một trong hai nhóm carotenoid, có trong nhiều loài động, thực vật khác nhau. Lutein là một trong những carotenoid có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm nhờ có màu vàng cam rất đẹp và khả năng chống oxy hóa khá mạnh, do đó, sản phẩm chứa lutein có nhu cầu ngày càng tăng trong thị trường carotenoid quốc tế [3]. Một trong những nguồn quan trọng nhất để thu lutein là cánh hoa của Tagetes erecta, thường gọi là cúc vạn thọ. Loài cây này rất thích hợp với điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng với nhiều địa phương của nước ta, trong đó có tỉnh Khánh Hòa. Đây là yếu tố thuận lợi góp phần hình thành ngành công nghiệp sản xuất và ứng dụng các chế phẩm lutein tại địa phương Khánh Hòa. đồng thời đưa hoa cúc vạn thọ trở thành loại cây công nghiệp phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu [3]. Theo các quy trình truyền thống, hoa cúc vạn thọ sau khi thu hoạch được ủ xi-lô, ép bớt nước, sấy khô, nghiền thành bột rồi chiết bằng dung môi hexane. Quy trình này có nhiều nhược điểm: có thể gây tổn thất và phân hủy carotenoid trong quá trình ủ xi-lô, sử dụng nhiều dung môi. Vì vậy, đã có nhiều công trình nghiên cứu tách chiết lutein bằng các phương pháp khác nhau nhằm thu được hiệu quả kinh tế cao, an toàn cho người sử dụng và thân thiện với môi trường. Ngày nay, việc ứng dụng công nghệ enzyme trong các quá trình xử lý hóa học để thay thế một phần các hóa chất là xu thế mới, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường. Xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme là một giải pháp thay thế để tăng cường hiệu suất thu hồi xanthophyll [9, 22]. Gần đây, một số công trình nghiên cứu đồng thời xử lý enzyme và chiết lutein bằng dung môi đã được công bố [7]. Trong các công trình này, nhiều loại enzyme đã được đưa vào thử nghiệm để xử lý cánh hoa cúc vạn thọ trước khi 2 chiết với dung môi (như cellulase, pectinase, hemicellulase, Neutrase, xylanase, ), kết quả cho thấy hiệu suất chiết đã được cải thiện đáng kể [6]. Một trong những nghiên cứu xử lý cánh hoa cúc vạn thọ tươi bằng enzyme trước khi chiết phải kể đến nghiên cứu của Barzana và các cộng sự (2002) với 3 enzyme được sử dụng là Viscozyme, Pectinex và Neutrase. Nghiên cứu này cho thấy rằng việc xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme đã làm tăng hiệu suất chiết lên đến hơn 45% so với mẫu không xử lý enzyme [7]. Có thể thấy Viscozyme là một enzyme có nhiều tiềm năng trong việc xử lý hoa cúc vạn thọ trước khi chiết carotenoid. Tuy nhiên, cũng như các enzyme thương mại khác, Viscozyme khá đắt tiền nên hiện chưa được sử dụng nhiều trong nghiên cứu và sản xuất thực tế. Vì vậy, cho đến nay, cũng chưa thực sự đánh giá hết hiệu quả của Viscozyme trong việc nâng cao hiệu quả chiết lutein từ cánh hoa cúc vạn thọ. Chính vì vậy, đồ án tốt nghiệp “Sử dụng enzyme thương mại Viscozyme cải tiến quy trình chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ” đã được thực hiện nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng Viscozyme trong việc nâng cao hiệu quả chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ, từ đó cải tiến quy trình chiết lutein truyển thống. Nội dung nghiên cứu của đề tài: - Xác định các thông số điều kiện xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme Viscozyme nhằm mang lại hiệu suất chiết lutein cao nhất; - Đề xuất quy trình thử nghiệm chiết xuất lutein từ hoa cúc vạn thọ đã được xử lý bằng enzyme. Đánh giá hiệu quả kinh tế của quy trình chiết. Đây là một hướng nghiên cứu khá mới mẻ so với trong nước. Vì vậy, dù đã cố gắng thực hiện, song do kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý từ quý thầy cô và các bạn sinh viên nhằm giúp đề tài có thể được hoàn thiện hơn. 3 PHẦN 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về hoa cúc vạn thọ. 1.1.1. Tên gọi Tên Việt Nam: Cúc vạn thọ; Tên tiếng Anh: marigold; Tên khoa học: Tagetes spp.; Họ: Cúc (Asteraceae) [25]. 1.1.2. Phân loại và đặc điểm hình thái Cúc vạn thọ (Tagetes) hay Marigold là một loài hoa có nguồn gốc từ Trung Mỹ và đã trở thành cây hoa không thể thiếu tại mọi khu vườn Bắc Mỹ, cây rất thích hợp với khí hậu nóng và khô của Mexico và Nam Mỹ. Cây được nhà thám hiểm Hernando Cortés đưa về châu Âu vào thế kỷ 14, sau đó, cây được trồng khắp nơi quanh Địa Trung Hải, rồi mọi nơi trên thế giới [25]. Loài hoa cúc vạn thọ Châu Phi Tên khoa học là Tagetes erecta, tiếng Anh gọi là African Marigold. Đây thường là giống hoa vạn thọ cây cao nhất và hoa cũng to nhất. Đáng kể nhất hiện nay là loài hoa kép, to, nở tròn xoe, không cồi gọi là Ánh Nguyệt (Moonlight), cây cao chừng 40 cm và mọc dày khít nhau. Trổ hoa sớm như các giống vạn thọ lai. Một loài vạn thọ Châu Phi có hoa kép to và cây cao hơn, khoảng 50−70 cm, hạt đem gieo thường cho nhiều hoa màu sắc khác nhau, từ cam đến vàng, vàng kim, vàng chanh, vàng bơ. Tên gọi chung là Gold-n Vanilla. Các loài khác của giống này là Golden Age, cây cao hơn 75 cm và Doublon, cây cao đến 1,5 m và hoa rất to với đường kính 12,5 cm [25]. 4 Loài hoa cúc vạn thọ Pháp Tên khoa học là Tagetes patula, tiếng Anh gọi là French Marigold. Loài này thường thấp hơn loài Châu Phi, hoa nhỏ hơn. Người dân Âu Mỹ hay trồng các giống hoa đơn một lớp, cánh hoa dài, có cồi. Ví dụ: Giống Oai Vệ (Majestic): cây lùn, cao khoảng 30 cm, hoa vàng đơn, cánh sọc nâu hay sọc màu gõ đỏ, cồi vàng, khiến mọi người chú ý. Cây sống ở nơi có khí hậu nóng như đồng bằng nước ta, cây có thể cao hơn 60 cm. Giống Kỳ Hoa Sọc Đỏ (Striped Marvel): thân cao đến 75 cm, giống như Oai Vệ, nhưng sọc đỏ. Janie là loài ra hoa sớm nhất và hoa nhiều nhất trong nhóm vạn thọ Pháp. Đối với loài này, cây mọc khít, thân lùn, chỉ cao chừng 20 cm, hoa có đường kính 4−5 cm, chỉ cần gieo hạt sau 6 tuần là đã trổ hoa. Hoa có nhiều màu sắc khác nhau, có ba màu được ưa thích là vàng, đỏ lửa và vàng kim. Loài lùn Naughty Marietta, chỉ cao 25 cm, hoa đơn, cánh bên trong điểm vết nâu. Loài Mắt Cọp (Tiger Eyes), cao 30−35 cm là một giống vạn thọ lạ vì cánh đơn đỏ huyết ở viền bìa ngoài hoa, còn bên trong nở như là cúc vàng cam. Loài Loạt Nữ Hoàng (Queen Series) hoa nở tựa hoa trà mi, hải đường, cây lùn 25−30 cm, [25]. Loài vạn thọ nhỏ Tên khoa học là Tagetes tenuifolia, hay Tagetes signata. Cây nhỏ, hoa đơn cánh, có cồi và nhỏ 1−2 cm. Loài Stafire Mix hay trồng ở Âu Mỹ, lá thơm mùi chanh bưởi, dễ nhận thấy mùi này khi trời nắng nóng [25]. Loài lai American Marigold Hoa của loài lai Antigua Yellow có màu vàng tươi, hoa kép to 7−8 cm, trồng ở làng hoa Gò Vấp, Việt Nam. Sau 60 ngày gieo hạt đã ra hoa, hoa nở liên tiếp nhiều tháng, thời gian có hoa lâu nhất trong các loài hoa cúc vạn thọ. Cây mọc khít và cao 30−50 cm, còn gọi là Inca lùn. [...]... Lọc-Làm khan Dịch chiết carotenoid Định lượng carotenoid tổng số Đánh giá hiệu quả xử lý Hình 2.1 Sơ đồ quy trình dự kiến chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ 2.2.4.2 Xây dựng quy trình xử lý hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme Để xây dựng được quy trình sử dụng Viscozyme xử lý hoa cúc vạn thọ tươi cho hiệu suất cao, với mục đích cải tiến quy trình chiết lutein ester bằng phương pháp chiết truyền thống,... lý hoa cúc vạn thọ để chiết lutein ester chưa nhiều, do đó chưa thực sự đánh giá được hết hiệu quả của Viscozyme trong việc xử lý hoa cúc vạn thọ Nguyên nhân là do Viscozyme là một enzyme thương mại khá đắt tiền (Viscozyme có giá £110,5/L), nên ít được dùng trong nghiên cứu và sản xuất rộng rãi Do đó, chưa thực sự đánh giá được hết hiệu suất chiết lutein từ cánh hoa cúc vạn thọ đã được xử lý với Viscozyme. .. thu nhận lutein tinh thể [4] 1.6 Các nghiên cứu xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme Việc thu carotenoid từ hoa cúc vạn thọ đã bắt đầu từ nhiều thập kỉ nay Sau khi thu hoạch, hoa cúc vạn thọ được xử lý bằng phương pháp ủ xilô, sau đó ép bớt nước, sấy khô, xay thành bột mịn, rồi chiết xuất lutein ester bằng dung môi và xà phòng hóa để thu được lutein ở dạng tự do Hạn chế của quy trình này là sử dụng nhiều... lutein ester từ cánh hoa cúc vạn thọ sau khi xử lý bằng Viscozyme Trên cơ sở kết quả của một số tài liệu [1], chúng tôi đề xuất quy trình dự kiến xử lý và chiết carotenoid từ hoa cúc vạn thọ bằng Viscozyme như sau: Thuyết minh quy trình: Chuần bị nguyên liệu: Cân chính xác G gam cánh hoa cúc vạn thọ tươi cho vào bình chứa đựng có nắp đậy kín Xử lý nguyên liệu: Thêm vào nguyên liệu đã chuẩn bị dung dịch Viscozyme. .. đích sử dụng enzyme xử lý cánh hoa cúc vạn thọ, trong nghiên cứu của Sunita Tekwani và các cộng sự (2010) về tác dụng của cellulase và pectinase trong chiết xuất lutein từ cánh hoa khô, cho thấy hiệu suất chiết lutein với phương pháp có và không sử dụng enzyme tương ứng là 9,2% (w/w) và 5,6% (w/w) Điều đó đã chứng minh được việc xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme, pectinase và cellulase cho hiệu suất chiết. .. với hoa cúc vạn thọ chiết xuất lutein từ hoa cúc vạn thọ theo phương pháp truyền thống cho kết quả lutein bị suy thoái và tổn thất một lượng đáng kể carotenoid Nhiều công trình gần đây tập trung vào việc nghiên cứu nâng cao hiệu suất chiết lutein ester sử dụng biện pháp sinh học nhằm cải thiện hiệu quả chiết lutein ester bằng cách phá hủy màng tế bào 17 chứa sắc tố nhờ tác dụng của các enzyme nội sinh,... được xử lý với Viscozyme Có thể nói, việc sử dụng enzyme thương mại Viscozyme để xử lý cánh hoa cúc vạn thọ tươi trước khi chiết mang lại hiệu suất chiết lutein cao 21 PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu-Hóa chất 2.1.1.1 Nguyên liệu: Trong nghiên cứu này, nguyên liệu dùng để chiết lutein ester là cánh hoa cúc vạn thọ châu Phi (Tagetes erecta L.) được trồng... ra rằng việc xử lý hoa cúc vạn thọ bằng hỗn hợp enzyme có thành phần chính là cellulase đã nâng cao hiệu suất chiết xanthophyll lên đáng kể [6] Một số nghiên cứu sử dụng enzyme Viscozyme để xử lý nguyên liệu trước khi chiết xuất Trong nghiên cứu của Robert N và các đồng sự (2008), chiết xuất dầu từ nhân hạt xoài dại gabonensis không sử dụng dung môi hữu cơ, nhưng sử dụng enzyme để chiết dầu Kết quả... lai Inca Hybrid hoa kép và rất to, 10 13 cm Cây cao 50−70 cm, ra hoa sớm và vụ hoa kéo dài, vẫn còn hoa khi các loài hoa cúc vạn thọ khác đã tàn Chịu nhiệt độ đến 39–400C Giống tam nhiễm lai triploid, thuộc nhóm Solar series F1 là giống phối hợp cây lùn của vạn thọ Pháp và hoa kép to của vạn thọ Châu Phi, vừa chịu lạnh vừa chịu nóng [25] Hình 1.1 Hoa cúc vạn thọ Châu Phi 1.2 Tổng quan về enzyme 1.2.1... tố lòng đỏ trứng bằng cách bổ sung lutein hoặc lutein ester trong thức ăn [4] 1.4.4 Ứng dụng Lutein ester hóa có thể được sử dụng làm giàu lutein, tăng sắc tố trong sản phẩm trứng trong ngành công nghiệp chăn nuôi vì sự ổn định của lutein ester cao hơn lutein tự do [3] Lutein ester được sử dụng như một chất chống oxy hóa, bằng cách bổ sung, pha trộn vào dược phẩm, sử dụng trong các dạng thuốc uống Các . của Viscozyme trong việc nâng cao hiệu quả chiết lutein từ cánh hoa cúc vạn thọ. Chính vì vậy, đồ án tốt nghiệp Sử dụng enzyme thương mại Viscozyme cải tiến quy trình chiết lutein ester từ hoa. từ hoa cúc vạn thọ đã được thực hiện nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng Viscozyme trong việc nâng cao hiệu quả chiết lutein ester từ hoa cúc vạn thọ, từ đó cải tiến quy trình chiết lutein truyển. kiện xử lý hoa cúc vạn thọ bằng enzyme Viscozyme nhằm mang lại hiệu suất chiết lutein cao nhất; - Đề xuất quy trình thử nghiệm chiết xuất lutein từ hoa cúc vạn thọ đã được xử lý bằng enzyme.