2.5.NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN VÀ ỨNG DỤNG 2.5.1 khái niệm kỹ thuật tách tế bào trần thực vật a KN: Tế bào trần thực vật (protoplast) tế bào loại bỏ thành tế bào màng sinh chất bao bọc khối tế bào chất nhân tế bào b Tế bào trần sử dụng nghiên cứu: + lai loài hay khác loài + chuyển gen + có khả tạo màng tế bào nhanh chóng sở ngghiên cứu trình tổng hợp màng tế bào c Tách tế bào trần ( cách : học enzym): sau bước bản: - Mẫu non rửa với vòi nước máy.sát trùng cồn 70-75 độ sau rửa nước cất lần, sau khử trùng Na-hypochlorit hay Ca-hypochlorit khảng 7-15 phút Lá làm Clorox 10% 10 phút, rửa lại lần nước cất tiệt trùng - Ngâm vào dung dịch mannitol 8-15% 45-60 phút để tế bào co nguyên sinh - Tách lớp biểu bì mặt để enzym ngấm sâu vào nhu mô thịt - Cắt thành mảnh nhỏ, ngâm 1g đĩa petri Dung dịch enzym gồm cellulase, hemicellulase,pectinase +manitol 13% Đặt mẫu tối qua đêm (12-18 giờ, 25 độ) thu hỗn hợp protoplast - Dịch protoplast ly tâm phút, bỏ phần bã lên trên,protoplast đáy Rửa 10ml dung dịch môi trường MS + Manitol 13%,thao tác thực lần d Xác định mật độ protoplast khả sống sót Nhuộm protoplast Fluorescein diacetate để xác định sống sót protoplast Số lượng protoplast xác định buồng đếm hồng cầu e Nuôi cấy protoplast 2.5.2 Dung hợp tế bào trần lai vơ tính a Tự dung hợp màng sinh chất tế bào(-) nhóm P Protein nên tế bào trần đẩy nên không tự dung hợp Do phải làm rế bào trần tiếp xúc nhờ PEG hay sốc điện b Hóa dung hợp: Sự hóa dung hợp thực với NaNO3 0,25M, PVA 15 %…nhưng tần số dung hợp thấp nên sử dụng Virut Senday giảm hoạt tính chất thường dùng cách cho giọt hỗn hợp loại tế bào trần tiếp xúc từ từ với giọt PEG 25- 50% c.Điện dung hợp (tốtnhất): Khi đặt hỗn hợp loại tế bào trần điện trường, tế bào trần di chuyển, tiếp xúc xếp thành chuỗi dài lực điện trường Sau dùng xung điện ngắn đẻ tạo vết đứt màng, dung hợp xảy nơi tiếp xúc Khi dung hợp tế bào trần với thường có ba nguồn gen tham gia (nhân,ty thể,lạp thể) Có thể xảy tượng: - dung hợp nguyên sinh chất quan tử - có dung hợp nhân - có dung hợp nhân tế bào chất TH -> tế bào cybride TH ->tế bào lai thực thụ hybride Ứng dụng: phương pháp lai tế bào thành công tạo lai từ hai loài thuốc khác nhau, lai khoai tây cà chua 2.5.3 Biến nạp gen vào protoplast thực vật a Phương pháp đưa AND vào thể tế bào khác - Phân lập AND phương pháp khác nhau: PCR,sử dụng enzym phiên mã ngược, tách gen RE - Sử dụng vector tự nhiên để biến nạp vào tế bào + thể thực khuẩn bám vào thành tế bào đưa AND vào tế bào chủ, tế bào chủ AND genom phage biểu tổng hợp phage + Plasmid: ngày người ta thiết kế nhiều loại plasmid để đưa AND lạ vào tế bào a Biến nạp gen vào protoplast thực vật Các bước biến nạp: •Phân lập mARN gen A: chọn loại tế bào giai đoạn thích hợp mà q trình mã sảy mạnh Phân lập bawnngf kỹ thuật: điện di,sắc ký • tổng hợp gen invitro: enzym phiên mã ngược thu cADN • Sử dụng cADN đặc trưng làm phân tử đánh dấu để phân lập đoạn gen tương đồng thư viện genom • Gắn với vector: thường sử dụng plasmid kháng kháng sinh để tiện lợi cho chọn sản phẩm biến nạp sau Dùng RE để mở vòng plasmid, enzym ligase để nối AND tạo thành AND tái tổ hợp • Biến nạp AND tái tổ hợp vào tế bào: có phương pháp sau: + biến nạp hóa chất: chủ yếu dùng PEG (polyethylen glycol) + biến nạp xung điện + biến nạp súng bắn gen + biến nạp thơng qua agrobacterium • họn lọc sản phẩm biến nạp : nuôi môi trường chọn lọc chứa kháng sinh đặc hiệu, tế bào có plasmid mang gen kháng sinh sống sót phát triển,từ chọn tế bào biến nạp thành cơng • Đánh giá kết biến nạp theo dõi số phận gen biến nạp theo cách sau: + theo dõi biểu gen biến nạp + Phân lập nhân gen biến nạp kỹ thuiaatj PCR + Phân tích RFLP ... cầu e Nuôi cấy protoplast 2.5.2 Dung hợp tế bào trần lai vơ tính a Tự dung hợp màng sinh chất tế bào( -) nhóm P Protein nên tế bào trần đẩy nên khơng tự dung hợp Do phải làm rế bào trần tiếp xúc... AND vào thể tế bào khác - Phân lập AND phương pháp khác nhau: PCR,sử dụng enzym phiên mã ngược, tách gen RE - Sử dụng vector tự nhiên để biến nạp vào tế bào + thể thực khuẩn bám vào thành tế bào. .. giọt PEG 25- 50% c .Điện dung hợp (tốtnhất): Khi đặt hỗn hợp loại tế bào trần điện trường, tế bào trần di chuyển, tiếp xúc xếp thành chuỗi dài lực điện trường Sau dùng xung điện ngắn đẻ tạo vết