PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY - ĐHNLTP. HCM Gr-, họ Enterobacteriaceae Hình trực ngắn, không vỏ bọc, không bào tử 2 loài chính: S. enterica và S. bongori  Salmonella enterica chia 6 loài phụ: – ISalmonella enterica – II Salmonella salamae – IIIa Salmonella arizona – IIIb Salmonella diarizona – IV Salmonella houtenae – VI Salmonella indica  Salmonella bongori có một loài phụ V Salmonella: Vi sinh học PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY - ĐHNLTP. HCM * Nhóm gây bệnh trên người: Sal. typhi, Sal. paratyphi A, S. paratyphi C. Tác nhân gây sốt thương hàn và phó thương hàn • Nhóm gây bệnh trên thú: Sal. cholerae suis, Sal. Galinarum Kiểu kháng nguyên > 2500 kiểu  Kháng nguyên O  Kháng nguyên H  Kháng nguyên Vi  ⇒ Phức tạp trong chẩn đoán!!! Dòch tễ học PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY - ĐHNLTP. HCM Khaùng nguyeân vi khuaån Salmonella PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY - ĐHNLTP. HCM Vi khuaån Nhoùm KN Khaùng nguyeân O Khaùng nguyeân H (flagellar) Phase 1 Phase 2 S. Paratyphi A 1, 2, 12 a (1, 5) S. Typhimurium B 1, 4, 12 i 1, 2 S. Typhi D 9, 12, (Vi) c 1, 2 S. Enteriditis D 1, 9, 12 g, m (1, 7) S. Gallinarum D 1, 9, 12 - - PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY - ĐHNLTP. HCM • Phương pháp phân lập • Phương pháp miễn dòch – Huyết thanh học – ELISA (Bộ kit Hyoptest (Bommeli)) – Miễn dòch huỳnh quang • Phương pháp phân tử – PCR (Polymerase Chain Reaction) – Real Time PCR – Multiplex PCR Phương pháp chẩn đoán Salmonella PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY - ĐHNLTP. HCM Nguyên tắc: kháng thể kháng Salmonella trong huyết thanh của cơ thể thú ⇔ Kháng nguyên Salmonella  Thực hiện test  0,25ml kháng nguyên + 0,25ml huyết thanh ở độ pha loãng 1/10 trong dung dòch muối sinh lý.  Với kháng nguyên O (somatic) ủ 24g còn flagella ủ 4g ở 50 0 C  Huyết thanh cho phản ứng dương tính sẽ pha loãng 1/20- 1/320 và kiểm tra lại với kháng nguyên phù hợp Kiểm tra huyết thanh học PGS. TS. Nguyn Ngc Hi Khoa CNTY - HNLTP. HCM Kieồm tra huyeỏt thanh hoùc a b c a: aõm tớnh b: nghi ngụứ c: dửụng tớnh PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY - ĐHNLTP. HCM • * Nguyên tắc: kháng thể kháng Salmonella trong huyết thanh của cơ thể thú được nhuộm huỳnh quang ⇔ Kháng nguyên Salmonella • * Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang  Chuẩn bò kháng nguyên và cố đònh vết bôi lên phiến kính ⇒ kết hợp kháng thể  Nhuộm vết bôi: dùng conjugate có chất phát huỳnh quang  Kính hiển vi có thể chụp lại hình ảnh Phương pháp miễn dòch huỳnh quang PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY - ĐHNLTP. HCM  Salmonella > 2.500 kiểu huyết thanh  cụm gen chung: inv (invasion) và iag giúp cho quá trình xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật ⇒ gây bệnh Cấu trúc phân tử của Salmonella PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY - ĐHNLTP. HCM PCR (Polymerase Chain Reaction)  DNA đích (gen inv)  band 520bp trên gel điện di  Cặp mồi invA1 và invA2:  invA1 : 5’ - TTGTTACGGCTATTTTGACCA – 3’  invA2 : 5’ - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG – 3’ Giếng 1: Thang DNA 100 bp Giếng 2, 3, 4, 5: Các chủng Salmonella khác nhau Giếng 6: Escherichia coli Giếng 7: Vibrio cholerae Giếng 8: Clostridium perfringens [...]... oligonocleotide phát sáng rất chuyên biệt = tín hiệu phân tử (molecular beacon)  Probe dạng tự do ⇒ tín hiệu huỳnh quang từ F sẽ bò Q hấp thu ⇒ không phát sáng  Probe đã được bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích ⇒ F và Q tách ra xa nhau ⇒ tín hiệu huỳnh quang từ F không bò Q hấp thu ⇒ phát sáng PGS TS Nguyễn Ngọc Vòng mang trình tự bổ sung với DNA đích F – chất phát huỳnh quang fluorophore ADN mẫu Phân tử Beacon... đònh lượng vi khuẩn:  Chuyển gen lux vào genome phage Phage thiếu cơ chế enzyme nội bào cần thiết ⇒ không phát sáng  Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, gen của phage và gen lux sẽ thể hiện ⇒ tế bào chủ phát sáng PGS TS Nguyễn Ngọc Phân tách miễn dòch từ Hạt từ được phủ kháng thể đa dòng kháng Salmonella Có Salmonella Không có Salmonella trong dòch mẫu trong dòch mẫu Bacteriophage Bacteriophage + Salmonella... iQ Optical System (Chọn chu kỳ nhiệt và vò trí plate) Real Time PCR Đọc kết quả PGS TS Nguyễn Ngọc Salmonella enterica typhimurium – Primer Rfbj: gen rfbj (kháng nguyên O.4.) – Primer Flic: gen flic-1 (kháng nguyên H1-I – Primer Flib: gen flib (kháng nguyên H2- 1,2) Primer Gen đích Độdài Rfbj-s Rfbj-as Fli-s Fli-as Flic-s Flic-as Rfbj 24 24 24 24 24 24 fliC fliB Trình tự 5’-CCAGCACCAGTTCCAACTTGATAC 5’-GGCTTCCGGCTTTATTGGTAAGCA... + : Kháng nguyên N : Đối chứng âm P : Đối chứng dương PGS TS Nguyễn Ngọc -Đối chứng dương : ODpos - ODneg -Mẫu : ODmẫu - ODneg Giá trò (%) = ODmẫu - ODneg x 100% ODpos - ODneg Giá trò 30% Giải thích m tính Không xác đònh Dương tính PGS TS Nguyễn Ngọc Đầu dò miễn dòch Flourescence Resonance Energy Transfer (FRET) Bộ phận cảm ứng sử dụng FRET tạo sóng huỳnh quang giữa vật phát và vật nhận... mẫu Phân tử Beacon Q – chất hấp thu (quencher) Lai Fluorophore Quencher Phân tử Beacon PGS TS Nguyễn Ngọc Ưu điểm iQ – CheckTM Salmonella o Không cần điện di sau PCR o Nhanh o Qui trình đơn giản o Độ nhạy cao (102 Salmonella cfu/ml) o Độ đặc hiệu cao o Không dương tính giả/ không phản ứng chéo o Tự động PGS TS Nguyễn Ngọc Tăng sinh Salmonella (25/225ml, ủ 18 ±2 giờ ở 37OC) Ly trích DNA iCycle iQ Optical... dò miễn dòch Flourescence Resonance Energy Transfer (FRET) Bộ phận cảm ứng sử dụng FRET tạo sóng huỳnh quang giữa vật phát và vật nhận Sơ đồ của immunosensor FRET PGS TS Nguyễn Ngọc Phức hợp protein-kháng thể cố đònh trên đỉnh sợi thuỷ tinh và được gắn vào benchtop flourometer giám sát những thay đổi huỳnh quang Đầu sợi thủy tinh (a) Benchtop Fluorometer (b) PGS TS Nguyễn Ngọc Kỹ thuật bacteriophage . Sal. cholerae suis, Sal. Galinarum Kiểu kháng nguyên > 2500 kiểu  Kháng nguyên O  Kháng nguyên H  Kháng nguyên Vi  ⇒ Phức tạp trong chẩn đoán!!! Dòch tễ học PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải. HCM • * Nguyên tắc: kháng thể kháng Salmonella trong huyết thanh của cơ thể thú được nhuộm huỳnh quang ⇔ Kháng nguyên Salmonella • * Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang  Chuẩn bò kháng nguyên và cố. thanh của cơ thể thú ⇔ Kháng nguyên Salmonella  Thực hiện test  0,25ml kháng nguyên + 0,25ml huyết thanh ở độ pha loãng 1/10 trong dung dòch muối sinh lý.  Với kháng nguyên O (somatic) ủ