CÔNG NGHỆ GENE (GENETICS ENGENEERING) Nguyễn Vũ Phong Chương II QUY TRÌNH TIẾN HÀNH • Bước 1: Nuôi tế bào chủ và tế bào cho • Bước 2: Tách DNA plasmind và DNA tế bào cho • Bước 3: Cắt DNA plasmid và DNA mục tiêu • Bước 4: Nối 2 loại DNA bằng enyme nối tạo DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh • Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận (thường là vi khuẩn E.coli) • Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng vi khuẩn mang gene tái tổ hợp • Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu hiện ra sản phẩm 1. Enzyme 1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE) - 1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn - Hệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ. - Trình tự nhận biết: trình tự 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom) - Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end) . 1. Enzyme 1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE) - Khoảng 3000 RE với 230 trình tự nhận biết khác nhau. - Quy tắc đặt tên: EcoRI Eco: Escherichia coli R: dòng vi khuẩn I: thứ tự RE được tìm ra (I: đầu tiên) 1. Enzyme 1.2. Enzyme nối (Ligase) - Nối : hình thành cầu phosphodiester AATTC G G CTTAA Ligas e G CTTAA AATTC G EcoRI EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G Ligation. (lige re = latin ‘to join’) 1. DNA Ligase reacts with an AMP donor in an ATP (or NAD + dependent manner depending on the source of ligase)  activated enzyme. 2. Activated enzyme donates AMP to free 5’-PO 4 = at the nick in the lower strand of the DNA duplex, creating a high-energy diphosphate group on one side of the nick. 3. Cleavage of the di-phosphate bond liberates energy to create a new phosphodiester bond. Seals the nick in the DNA. N.B. Reaction can occur on Both Strands, allowing joining of two independent DNA molecules. 1. Enzyme 1.3. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) • Tổng hợp DNA một mạch c-DNA (complementary DNA) từ một sợi mRNA hoặc từ polyribonucleotide tổng hợp • c-DNA có thể tổng hợp thành c-DNA kép (c-DNA duplex) nhờ DNA polymerase. c-DNA kép được dùng trong việc tạo dòng c-DNA 1.4. Các enzyme khác Enzyme Chức năng DNaseI Endonuclease Nuclase BAL31 Exon nuclease S1 nuclease Cắt DNA mạch đơn Đoạn Klenow DNA polymerase chỉ còn hoạt tính exonuclease 3’-5’ Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt 1. Enzyme 2. Các vector chuyển gene Plasmid: - DNA vòng tròn - Sao chép độc lập trong tế bào - Có khả năng mang một số gene có khả năng biểu hiện thành protein Vector: - Có khả năng tự tái bản - Tồn tại độc lập trong tế bào - Mang được gene mong muốn Yêu cầu đối với vector chuyển gene. - Có trình tự khởi đầu sao chép (ori) - Trình tự nhận biết cho RE - Trình tự điều hòa (promoter) - Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp - Có gene đánh dấu (marker) để dễ dàng nhận biết. 2. Các vector chuyển gene Ứng dụng của vector chuyển gene - Tạo dòng và khuyếch đại trình tự DNA - Nghiên cứu sự biểu hiện của đoạn trình tự DNA - Chuyển gene - Sản xuất RNA - Sản xuất protein từ gene được tạo dòng. [...]... nhận gene - Thu nhận DNA từ bộ gene * Shotgun * Ngân hàng/thư viện DNA bộ gene (Bank/Library of genomic DNA) - Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học - Lập ngân hàng c-DNA * Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron) * Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine Kỹ thuật và phương pháp căn bản 2 Thu nhận gene - Thu nhận DNA từ bộ gene - Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học. .. thể chứa đoạn gene dài đến 45kb - Dùng lập thư viện gen 2.4 Phagemid 2 Các vector chuyển gene 2.5 Phage M1 3: - DNA mạch đơn - Dùng xác định trình tự nucleotide của gene - Sản xuất mẫu dò (probe) - Gây đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis) 2 Các vector chuyển gene 2.5 Plasmid Ti - Agrobacterium tumefaciens - Chuyển gen ở thực vật - 200Kb - Chuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene của tế bào... dịch mã tạo protein có đủ hoạt tính sinh học - Sản xuất protein tái tổ hợp - Sinh vật an toàn 3 Hệ thống tế bào chủ (Host) 3.3 Hệ thống tế bào thực vật 3.4 Hệ thống tế bào động vật - Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney) - Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney) - Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney - Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster...2 Các vector chuyển gene 2.1 Vector chuyển gene plasmid - Plasmid của vi khuẩn và bacteriophage - pBR322 2 Các vector chuyển gene 2.2 Phage λ - Có hệ thống xâm nhập tự động và sinh sản - Có dạng tròn hoặc dạng thẳng, 2 đoạn cos (12 nu) ở 2 đầu mút, dùng tạo cosmid và phagemid - Mang được đoạn DNA (15-23Kb) - Dùng trong thành ngân hàng gene lập 2 Các vector chuyển gene 2.3 Cosmid : - Plasmid gắn thêm... biến nạp b) Điện biến nạp (electroporation) Kỹ thuật và phương pháp căn bản 4 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào a) Hóa biến nạp b) Điện biến nạp (electroporation) c) Vi tiêm (micro-injection) d) Bắn gene DNA coated golden particles Gene gun Cell’s DNA Plant cell A plant cell with the new gene Transgenic plant Cell division Kỹ thuật và phương pháp căn bản 5 Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene a) Xác... 1 Biến tính: tạo dây đơn DNA với nhiệt độ 94oC 2 Bắt cặp: lai giữa primers và dây đơn DNA Nhiệt độ thay đổi tùy theo, khoảng 50oC 3 Kéo dài : tạo dây DNA bổ sung với tác động của polymerase và dNTPs: 72oC 2 Các thành phần của phản ứng - Primer Polymerase chịu nhiệt dNTP Dung dịch đệm Lập lại chu kỳ khoảng 30-40 lần sẽ tạo ra số lượng DNA cần khuếch đại đủ quan sát trên gel qua quá trình điện di PCR... tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng - Biểu hiện gene - Sản xuất protein tái tổ hợp 3 Hệ thống tế bào chủ (Host) 3.1 Escherichia coli (E.coli) - Dễ nuôi cấy và nhân dòng - Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau - Vi khuẩn Gram-, hình que, - Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base 3.2 Saccharomyces cerevisiae - Đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật Eukaryote - Phân lập được nhiều promotor hoạt động... thuật và phương pháp căn bản 5 Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp b) Tạo dòng c) Sự biểu hiện của gene được tạo dòng Vector biểu hiện Yêu cầu: Số lượng hợp lý bản sao cho mỗi tế bào Promotor biểu hiện Trình tự bám vào ribosome (rbs) và DNA phụ cho dịch mã tốt Sự ổn định lâu dài Tránh sự thủy giải protein (proteolysis) do các enzyme trong tế bào... thuật và phương pháp căn bản 2 Thu nhận gene - Thu nhận DNA từ bộ gene - Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học - Lập ngân hàng c-DNA * Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron) * Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine Kỹ thuật và phương pháp căn bản 3 Tạo plasmid tái tổ hợp a) Dùng đầu so le Kỹ thuật và phương pháp căn bản 3 Tạo plasmid tái tổ hợp a) Dùng đầu so le b) Dùng... và RNA - Điện di trên gel Wells Large Small + Kỹ thuật và phương pháp căn bản 1 Lai nucleic acid - Lai trên pha rắn Southern blot, Northern blot, Western blot, Dot và slot blot Kỹ thuật và phương pháp căn bản 1 Lai nucleic acid - Lai trên pha rắn Dot và slot blot dùng cho RNA và DNA Kỹ thuật và phương pháp căn bản 1 Lai nucleic acid - Lai trên pha rắn - Lai tại chổ (in situ hybridisation ): nghiên cứu . CÔNG NGHỆ GENE (GENETICS ENGENEERING) Nguyễn Vũ Phong Chương II QUY TRÌNH TIẾN HÀNH • Bước 1: Nuôi tế bào chủ và tế bào cho • Bước 2: Tách DNA plasmind và DNA tế bào cho • Bước 3: Cắt. biết khác nhau. - Quy tắc đặt tên: EcoRI Eco: Escherichia coli R: dòng vi khuẩn I: thứ tự RE được tìm ra (I: đầu tiên) 1. Enzyme 1.2. Enzyme nối (Ligase) - Nối : hình thành cầu phosphodiester AATTC G G CTTAA Ligas e G CTTAA AATTC G EcoRI EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G Ligation sau dịch mã tạo protein có đủ hoạt tính sinh học. - Sản xuất protein tái tổ hợp - Sinh vật an toàn 3.3. Hệ thống tế bào thực vật 3.4. Hệ thống tế bào động vật - Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS-