Miễn dịch thực vật THUYẾT GEN ĐỐI GEN 1. GIỚI THIỆU Trong quần thể cây ký chủ mẫn cảm đối với một loài/chủng tác nhân gây bệnh, một hiện tượng thường thấy là có một số cá thể cây vẫn có khả năng kháng lại sự tấn công. Từ các cá thể kháng này, người ta có thể chọn tạo ra các giống kháng bệnh chống lại một chủng nào đó. Giống cây tạo được gọi là giống kháng (resistant) còn chủng tác nhân gây bệnh gọi là chủng không độc (avirulent). Tuy nhiên, sau một thời gian trồng ngoài đồng ruộng, tính kháng này lại bị mất. Người ta đã nhận thấy rằng trong quần thể chủng tác nhân gây bệnh đã hình thành các đột biến có thể khắc phục được tính kháng của giống cây kháng bệnh. Trong trường hợp này, chủng tác nhân gây bệnh trở thành chủng độc (virulent) đối với giống kháng đó. Như vậy giữa tác nhân gây bệnh và cây ký chủ dường như tồn tại một mối quan hệ đồng tiến hóa dẫn tới sự tồn tại lâu dài của cả tác nhân gây bệnh và ký chủ. Mối quan hệ đồng tiến hóa này có thể được giả thích bằng thuyết gen-đối-gen. Thuyết gen-đối-gen (gene-for-gene) là nền tảng của nghiên tính kháng đặc hiệu ký chủ. Thuyết gen-đối-gen gắn liền với tên tuổi của Harol Henry Flor (1900-1991), một nhà bệnh cây học người Mỹ. Mặc dù không phải là người đầu tiên sử dụng thuật ngữ gen-đối-gen, nhưng ông là người đầu tiên chứng minh rằng biểu hiện bệnh là hậu quả mối tương tác của cả tác nhân gây bệnh và ký chủ và di truyền được. Flor đã xây dựng thuyết gen-đối-gen dựa trên nhiều thí nghiệm di truyền về tính gây bệnh và tính độc của các tổ hợp lai giữa các chủng sinh lý của nấm Melampsora lini gây bênh gỉ sắt cây lanh (Linum usitatissimum) trên các giống lanh có tính kháng và mẫn cảm khác nhau với nấm. Các thí nghiệm này chủ yếu được thực hiện từ những năm 1940 đến 1960. 2. THÍ NGHIỆM VỀ BỆNH GỈ SẮT CÂY LANH CỦA FLOR 2.1. Vòng đời nấm gỉ sắt Melampsora lini Nấm M. lini thuộc họ Melampsoraceae, bộ Uredinales, lớp nấm đảm Basidiomycetes với bộ nhiễm sắc thể n = 18. M. lini là nấm gỉ sắt đồng chủ có nghĩa hoàn thành vòng đời trên một cây ký chủ. Nấm cũng là loài nấm gỉ sắt chu kỳ lớn có nghĩa tạo đủ 5 loại bào tử trong cả vòng đời, theo trình tự là bào tử giống – bào tử xuân – bào tử hạ - bào tử đông - bào tử đảm. Vòng đời của nấm khá phức tạp gồm 2 pha đơn bội và song hạch (2 nhân). Nấm qua đông dưới dạng bào tử đông lưỡng bội (2n) trên tàn dư cây ký chủ. Vào mùa xuân, nhân lưỡng bội của bào tử đông giảm nhiễm thành nhân đơn bội (1n) và bào tử đông nảy mầm thành đảm, từ đảm sẽ hình thành 4 bào tử đơn bội gọi là bào tử đảm (1n). Bốn bào tử đảm này khác nhau về kiểu ghép cặp (mating type) trong đó 2 bào tử thuộc kiểu ghép cặp (+) và 2 bào tử còn lại thuộc kiểu ghép cặp (-). Bào tử đảm tách khỏi đảm, phát tán và tiếp xúc trên bề mặt lá cây lanh. Trong điều kiện đủ ẩm, bào tử đảm nảy mầm và xâm nhập qua biểu bì trên của lá và hình thành sợi nấm đơn bội trong mô lá. Trong mô lá, sợi nấm phát triển trong gian bào và hình thành vòi hút 1 bên trong tế bào để hấp thụ dinh dưỡng. Ở pha đơn bội này, nấm là loài dị tản (heterothallic) có nghĩa mỗi cá thể (sợi nấm) hoặc thuộc kiểu ghép cặp (-) hoặc thuộc kiểu ghép cặp (+). Tiếp theo, sợi nấm đơn bội hình thành 2 cơ quan sinh sản khác nhau. (1) ở phía biểu bì trên, nấm tạo ra ổ bào tử giống dạng bình tam giác có lỗ mở, bên trong chứa các bào tử giống (1n) đóng vai trò như giao tử đực. Nhô ra khỏi lỗ mở của ổ bào tử giống là các sợi nấm hữu thụ, phân nhánh, không có vách ngăn gọi là sợi tiếp nhân. (2) Ở phía biểu bì dưới, vẫn cùng một cá thể nấm, sợi nấm hình thành tiền ổ bào tử xuân (gồm các sợi nấm tụ tập lại) chứa các tế bào gốc (basal cells) đóng vai trò như giao tử cái. Quá trình sinh sản hữu tính bắt đầu khi bào tử giống khác kiểu ghép cặp (ví dụ là +) tiếp xúc và dung hợp (fusion) với sợi tiếp nhận (ví dụ là -). Sau khi dung hợp, nhân của bào tử giống (+) sẽ di chuyển dọc sợi tiếp nhận (-), vượt qua các vách ngăn tế bào của sợi nấm (-) tiến tới tiền ổ bào tử xuân (-), cuối cùng tới tế bào gốc (-) để tạo thành tế bào gốc chứa 2 nhân (- và +). Tiển ổ bào tử xuân sẽ phát triển thành ổ bào tử xuân có lỗ mở, bên trong hình thành các bào tử xuân 2 nhân (n+n) mọc thành chuỗi. Bào tử xuân giải phóng khỏi ổ bào tử xuân, phát tán nhờ gió, tiếp xúc, xâm nhập vào mô lá, thân và hình thành sợi nấm 2 nhân trong mô. Sợi nấm 2 nhân sẽ hình thành các ổ bào tử hạ chứa nhiều bào tử hạ 2 nhân. Bào tử hạ tiếp tục phát tán và tạo ra nhiều chu kỳ xâm nhiễm mới. Vào mùa thu, trên tàn dư lá bệnh, sợi nấm 2 nhân sẽ hình thành ổ bào tử đông chứa các bào tử đông hình trụ. Lúc đầu, mỗi tế bào của bào tử đông gồm 2 nhân riêng biệt nhưng trong thời gian ngủ nghỉ, 2 nhân sẽ tiến hành hợp nhân (karyogamy) để tạo thành 1 nhân lưỡng bội (2n). Như vậy bào tử đông thành thục là bào tử đơn nhân lưỡng bội và ngủ nghỉ qua đông để tới mùa xuân bắt đầu chu kỳ bệnh mới. Như vậy, nấm gỉ sắt lanh có pha 2 nhân chiếm ưu thế trong chu kỳ phát triển. Vì sợi nấm hay bào tử 2 nhân chứa kiểu gen của cả bố và mẹ nên di truyền tính gây bệnh và tính độc của nấm có thể được phân tích theo các qui luật di truyền Menden. 2.2. Kỹ thuật phân tích lai nấm M. lini Nấm M. lini gồm nhiều chủng có tính độc khác nhau. Để phân tích di truyền tính độc của nấm, Flor và cộng sự đã tiến hành lai chéo giữa các chủng. Kỹ thuật lai như sau: Bào tử đông được cảm ứng để tạo đảm và bào tử đảm. Các bào tử đảm được nhiễm riêng rẽ trên ký chủ mẫn cảm. Mỗi bào tử đảm sẽ hình thành các ổ bào tử giống. Trong lai chéo, bào tử giống (có kiểu ghép cặp +) từ chủng A sẽ được cho giao phối với sợi nấm tiếp nhận (có kiểu ghép cặp -) của chủng B. Việc lai chéo này khá dễ dàng vì nấm không thể tự thụ nếu cùng kiểu ghép cặp. Con cháu của chúng là các bào tử xuân (hoặc bào tử hạ) thế hệ F1. Để nhận được thế hệ F2 tự thụ nhằm phân tích phân ly tính trạng, các bào tử xuân (hoặc bào tử hạ) F1 được nhiễm riêng rẽ trên cây mẫn cảm và bào tử đông sẽ được thu thập vào mùa thu. Vào mùa xuân, các bào tử đông của mỗi dòng nấm F1 lại được cảm ứng để tạo bào tử đảm và lây nhiễm trên ký chủ mẫn cảm. Trên mỗi dòng F1, bào tử giống (+) được cho giao phối với sợi nấm tiếp nhận (-) để nhận được bào tử xuân (hoặc bào tử hạ) thế hệ F2 tự thụ. Như vậy phân ly di truyền của M. lini thông qua lai chéo là tương tự như đối với cây. Để phân tích sự phân ly tính gây bệnh/độc của nấm, các bào tử xuân (hoặc bào tử hạ) của các thế hệ F1 hoặc F2 được nhiễm trên các giống lanh đồng hợp tử mang các gen kháng khác nhau. Biểu hiện triệu chứng trên các giống này sẽ xác định kiểu gen của nấm. 2 2.3. Đặc điểm cây ký chủ. Cây lanh (Linum usitatissimum) là cây tự thụ, được trồng chủ yếu để lấy hạt và dầu, trồng nhiều ở Mỹ, Canada và Trung Quốc. Vào những năm 30, các nhà bệnh cây Mỹ đã xác định được cây lanh có thể kháng được bệnh gỉ sắt và tính kháng được điều khiển bởi di truyền với kiểu hình kháng là trội so với kiểu hình nhiễm. Cho tới nay, 31 gen kháng bệnh gỉ sắt đã được phát hiện trên lanh. Các gen này nằm trên 5 loci được ký hiệu là K (2 gen), L (13 gen), M (3 gen), N (6 gen) và P (13 gen). Trong những năm 40 và 50, Flor đã sử dụng nhiều giống lanh kháng bệnh để nghiên cứu di truyền về tính kháng bệnh của cây lanh. Các giống lanh này là các giống thuần, đồng hợp tử về tính trạng kháng nhiễm và được gọi là các giống chỉ thị 2.4. Các thí nghiệm của Flor  Năm 1942, Flor lai chủng nấm số 6 với số 22. Khi thử tính gây bệnh của 67 con cháu F2 trên 12 giống chỉ thị ông đã: • Xác định được 57 kiểu hình không độc/độc khác nhau (ông gọi là các chủng). Kết quả này gợi ý rằng trên mỗi giống chỉ thị thì kiểu hình độc và không độc là khác nhau giữa chủng 6 và chủng 22. • Kiểu hình không độc là trội so với kiểu hình độc vì trên mỗi giống chỉ thị, tỷ lệ phân ly không độc/độc = 3/1.  Năm 1946, Flor lai chủng nấm số 22 với chủng số 24. Khi thử tính gây bệnh của 133 con cháu F2 trên 14 giống chỉ thị ông thu được kết quả sau: • Xác định được 68 kiểu hình không độc/độc khác nhau (chủng). • Xuất hiện sự phân lý tính trạng không độc/độc trên 14 giống. Tỷ lệ phân ly khác nhau tùy thuộc số gen kháng cây chỉ thị: 3/1 trên 9 giống mang 1 gen kháng; 15/1 trên 2 giống mang 2 gen kháng, và 63/1 trên 1 giống mang 3 gen kháng.  Năm 1955, Flor sử dụng lại 67 con lai F2 của chủng số 6 và chủng số 22 để thử tính gây bệnh trên 32 giống chỉ thị, phần lớn chúng chỉ có một gen kháng (theo xác định của Flor). Ông thu được kết quả tương tự: • Xuất hiện sự phân ly tính trạng không độc/độc trên 24 giống chỉ thị. Tỷ lệ phân ly trên 23 giống đều là 3/1. • Đa số các cặp không độc/độc là khác nhau vì chúng phân ly độc lập với nhau. Các kết quả trên đưa Flor tới kết luận là (1) khả năng gây bệnh của nấm M. lini trên cây lanh do sự tương tác của các gen kháng/nhiễm của cây ký chủ và gen không độc/độc của nấm gây bệnh; (2) Mối tương tác này là đặc hiệu nghĩa là một gen qui đinh tính không độc/độc của nấm tương tác với chỉ một gen qui định tính kháng/nhiễm của cây ký chủ; và (3) các gen qui định tính kháng của cây và tính không độc của nấm các gen trội. 3 3. KHÁI NIỆM GEN-ĐỐI-GEN 3.1. Khái niệm Thực tế, Flor chưa bao giờ đưa ra một định nghĩa rõ ràng về lý thuyết của mình. Năm 1971, tổng kết nghiên cứu của mình và của các tác giả khác, Flor đã viết: đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính gây bệnh trong ký sinh “For each gene that conditions resistance in the host there is a corresponding gene that conditions pathogenicity in the parasite”. Khẳng định này của Flor được sử dụng rộng rãi và được xem là định nghĩa chính thức của Flor về thuyết gen-for-gen. Vì mối quan hệ gen-đối-gen thường là quan hệ trội – trội trong khi đó “gen qui định tính gây bệnh” thường được hiểu là gen lăn nên định nghĩa trên của Flor dễ gây nhầm lẫn. Do vây, khái niệm gen-đối-gen của Flor đã được biến đổi một chút cho phù hợp với lý thuyết của ông như sau: “đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính không độc trong ký sinh và 2 gen này tương tác đặc hiệu với nhau” “for each gen determining resistance in the host there is a corresponding gen for avirulence in parasite with which it specifically interacts” Quan hệ gen-đối-gen cho tới nay đã được chứng minh là tồn tại trong rất nhiều loại bệnh do hầu hết các nhóm tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng, mollicus ) gây ra. Các gen cây ký chủ qui định tính kháng (chú ý không nhất thiết phải tuân theo quan hệ gen-for-gen) được gọi chung là gen R (Resistance). Các gen ký sinh qui định tính không độc của ký sinh được gọi chung là gen Avr (Avirulence). Các ký hiệu R hoặc Avr sẽ được viết thường là r hoặc avr nếu trạng thái của gen là lăn. Các chữ số viết kèm theo (nếu có) cho biết sự tương ứng của các cặp gen. Ngoài qui định chung này, trên mỗi hệ ký sinh – ký chủ, người ta thường sử dụng các ký hiệu riêng. Ví dụ: • Cây lanh: L2, L5 <=> Nấm M. lini: AL2 (hoặc AvrL2), L5 (hoặc AvrL5) • Cây lúa: Pi-ta <=> Nấm P. oryzae : AvrPi-ta • Cây lúa: Xa5, Xa21 <=> Vi khuẩn X. oryzae: AvrXa5, AvrXa21 • Cây cà chua: Cf2, Cf9 <=> Nấm C. fulvum: Avr2, Avr9 • Cà chua: AvrPto <=> Vi khuẩn P. syringae: Pto 3.2. Đặc điểm quan hệ gen-đối-gen  Phần lớn quan hệ gen-đối-gen là quan hệ trội-trội có nghĩa đối với cây ký chủ, gen qui định tính kháng là gen trội (R) còn gen qui định tính mẫn cảm (thiếu tính kháng) là gen lặn (r); đối với ký sinh, gen qui định tính không độc (không có khả năng gây bệnh) là gen trội (Avr), còn gen qui định tính độc là gen lặn (avr). Nói cách khác cả gen kháng của ký chủ và gen không độc của ký sinh đều phải được biểu hiện để tạo ra tính kháng.  Mỗi gen ký chủ thường nhận biết và tương tác với chỉ gen tương ứng của ký sinh (và ngược lại). Điều này dẫn tới nếu ký chủ có nhiều gen kháng/nhiễm và ký sinh có nhiều gen không độc/độc thì tính kháng chỉ có thể hình thành khi ít nhất có tương tác của một cặp gen tương ứng. 4  Ví dụ: • Cây (R1, r2, r3) + ký sinh (Avr1, Avr2, Avr3) => kháng • Cây (R1, r2, r3) + ký sinh (avr1, Avr2, Avr3) => nhiễm  Số lượng chủng (race) tối đa trong quần thể tác nhân gây bệnh =2 n trong đó n là số gen kháng R trong quần thể ký chủ.  Việc xác định kiểu hình kháng hay nhiễm hoàn toàn dễ dàng khi sử dụng bảng punnett. Khi xây dựng bảng punnett cần chú ý là kiểu gen của cây ký chủ là lưỡng bội còn kiểu gen của ký sinh sẽ hoặc đơn bội hoặc lưỡng bội tùy thuộc loại tác nhân gây bệnh. Ví dụ ký sinh có kiểu gen đơn bội là vi khuẩn, nhiều loại nấm túi (như nấm đạo ôn lúa Pyricularia oryzae); ký sinh có kiểu gen lưỡng bội là tuyến trùng, các loài nấm đảm (như nấm gỉ sắt, than đen ).  Tính kháng của cây trồng tuân theo quan hệ gen-đối-gen được gọi là tính kháng gen-đối-gen. Tính kháng gen-đối-gen thường là tính kháng đặc hiệu ký chủ, tính kháng đơn gen, tính kháng gen chủ, tính kháng không bền vững.  Hậu quả của một phản ứng kháng gen-đối-gen thường là phản ứng siêu nhạy/apoptosis. 4. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN KHÔNG ĐỘC (GEN AVR) Sự tồn tại của các Avr gen và sản phẩm của chúng là các Avr protein đã được chứng minh bằng thực nghiệm dựa trên các thí nghiệm của Flor từ những năm 1940. Cho tới nay, nhiều Avr gen đã được xác định từ nhiều nhóm tác nhân gây bệnh bao gồm nấm, vi khuẩn và virus. Một số thuật ngữ liên quan hiện đang được sử dụng: Effector (chất hiệu ứng): là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh tác động lên tế bào ký chủ, nhờ đó tạo điều kiện cho sự nhiễm bệnh. Một effector được gọi là elicitor khi nó bị cây nhận biết và khởi động phản ứng phòng thủ. Elicitor (chất kích hoạt): là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh khởi động phản ứng phòng thủ dẫn tới tăng cường tính kháng và được cây nhận biết. Khi sự nhận biết được thực hiện nhờ protein R thì elicitor được xem là Avr protein. Định nghĩa Gen Avr là các gen làm cho tác nhân gây bệnh trở thành không độc khi có mặt gen kháng R của cây ký chủ. Khả năng này của gen Avr có được là do sản phẩm protein của nó cảnh báo tế bào cây ký chủ về sư tấn công của tác nhân gây bệnh và do đó khởi động phản ứng phòng thủ dẫn tới phản ứng siêu nhạy/apoptosis. Như vậy có thể xem protein Avr là elicitor được cây nhận biết thông qua gen kháng R Không giống như gen kháng R, nhìn chung, protein Avr chia sẻ ít đặc điểm chung với nhau. Dưới đây là một số đại diện Avr gen/protein Họ gen AvrBs3 của vi khuẩn Xanthomonas. Cho tới nay, khoảng 40 Avr gen của họ này đã được xác định từ nhiều loài Xanthomonas kể cả 1 gen Brg11 của vi khuẩn Ralstonia solanacearum. Các ví dụ của các Avr gen thuộc họ này bao gồm: X. campestris pv. vesicatoria AvrBs3, AvrBs4 X. oryzae pv. oryzae AvrXa5, AvrXa3, AvrXa7, AvrXa10, AvrXa27 X. oryzae pv. oryzicola Avr/pth3, Avr/pth13, Avr/pth14 5 X. campestris pv. malvacearum AvrP6, PthN X. axonopodis pv. citri Apl1, Apl2, Apl3, PthA, PthA1, PthA2, PthA3, PthA4, PthB X. campestris pv. manihotis PthB Ralstonia solanacearum Brg11 Các gen thuộc họ này mã hóa cho các protein chứa khoảng 13 - 23 các chuỗi lặp gồm 34 aa ở vùng trung tâm. Đầu C của các protein này chứa dấu hiệu nhập nhân (Nuclear Localization Signal – NLS) và một vùng hoạt hóa phiên mã (Activated Domain – AD). Cấu trúc này chứng tỏ (đã được chứng minh bằng thực nghiệm) các protein này hoạt động trong nhân và tương tác với quá trình phiên mã của tế bào ký chủ. Gen AvrPto của vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. tomato (gây bệnh đốm đen vi khuẩn cà chua). Gen này mã hóa protein AvrPto có trọng lượng phân tử thấp khoảng 18 kD và được hệ thống tiết loại 3 của vi khuẩn đưa và trong tế bào chất. Các gen Avr của nấm. Có khá nhiều gen Avr của nấm đã được phân lập. Một số protein Avr là các protein giàu cystein như AvrCf2 của nấm Cladosporium fulvum; AvrP4; AvrP123 của nấm M. lini. Một số protein Avr được nấm tiết ra ở gian bào (apoplasm) và tương tác với protein R của ký chủ ở bề mặt tế bào; vi dụ như các protein AvrCf2, vrCf4, AvrCf9 của nấm C. fulvum. Một số lại được nấm tiết trực tiếp vào tế bào chất qua vòi hút chẳng hạn như các protein kháng của nấm sương mai, phấn trắng, gỉ sắt. Các gen Avr của virus. Đối với virus thực vật, các gen Avr thường liên quan đến 1 protein chức năng của virus. Ví dụ điển hình là protein tái sinh (Replication protein) của Tobacco mosaic virus –TMV là gen không độc tương ứng với gen kháng N trong cây thuốc lá. Ngoài ra, các protein vỏ (Coat Protein – CP) của virus cũng là gen Avr phổ biến của virus. Một câu hỏi cần đặt ra là tại sao các Avr gen/protein của tác nhân gây bệnh làm giảm khả năng tấn công (mất ưu thế thích nghi) của tác nhân gây bệnh lại vẫn tồn tại trong quần thể tác nhân gây bệnh. Câu trả lời là mặc dù các gen này có thể tương tác (trực tiếp hoặc gián tiếp) với gen kháng thì trong trường hợp không có gen kháng, các gen Avr này vẫn có một số chức năng có lợi cho tác nhân gây bệnh. Ví dụ trên cây cà chua thiếu gen kháng Pto thì gen AvrPto sẽ tạo điều kiện cho sự gây bệnh của vi khuẩn bằng cách ức chế sự phòng thủ vách tế bào cây (thí nghiệm trên cây Arabidopsis). Các nghiên cứu đối với nấm Phytophthora infestans, Puccinia graminis cho thấy, ngay sau khi áp lực chọn lọc bởi gen kháng R của ký chủ bị mất thì các gen Avr tái xuất hiện. 5. GEN KHÁNG R VÀ PROTEIN R Như đã biết, nhiều loại tác nhân gây bệnh có thể tiếp xúc với cây nhưng nhìn chung cây có thể kháng lại tốt với phần lớn tác nhân gây bệnh. Thậm chí tác nhân có thể tấn công và gây bệnh thì cây vẫn có thể biểu hiện tính kháng với các mức độ khác nhau. Cho tới nay, rất nhiều gen kháng R của cây đã được xác định. Các gen kháng này có thể qui định tính kháng thông qua quan hệ gen-đối-gen hoặc không. Sản phẩm của các gen này gọi là các protein kháng R Phân loại protein kháng R. Hiện nay, các protein kháng R được chia thành 5 lớp dựa trên đặc điểm cấu trúc và vị trí hoạt động của chúng trong tế bào ký chủ. Các protein trong cùng lớp nhìn chung khá bảo thủ. 6 5.1. Pto Lớp protein thứ nhất chỉ gồm 1 thành viên là Pto phân lập từ cà chua. Pto có 1 vùng có hoạt tính xúc tác kinase. Pto là gen kháng hoạt động trong tế bào chất. Pto là protein kháng chống vi khuẩn P. syringae pv. tomato mang gen AvrPto. Pto có hoạt tính kinase điều khiển dẫn truyền tín hiệu trong tế bào chất dẫn tới phản ứng siêu nhạy. 5.2. CNL (CC-NB-LRR) Lớp protein kháng thứ hai gồm một số lượng lớn protein có cấu trúc gồm (1) một vùng khóa kéo leucine (leucine-zipper – LZ) hoặc một chuỗi xoắn kép (coiled-coil – CC) ở đầu amin; (2) một vùng có khả năng liên kết nucleotide (nucleotide binding – NB) ở vùng trung tâm; và (3) một vùng lặp giàu leucine (leucine-rich repeats - LRR) phía đầu carboxyl. Các protein của lớp này hoạt động trong tế bào chất. Các ví dụ về protein lớp CNL trình bày ở Bảng 2. 5.3. TNL (TIR-NB-LRR) Lớp protein kháng thứ ba là lớp có số lượng lớn nhất và chỉ có ở cây 2 lá mầm. Về cấu trúc, lớp protein TNL tương tự lớp CNL nhưng thay vì chuỗi CC là một chuỗi TIR. Chuỗi TIR là một vùng protein tương đồng với receptor Toll (của ruồi dấm) và receptor Interleukin-1 (của người) (TIR = Toll/Interleukin-1 Receptor). Tương tự protein kháng lớp CNL, các protein của lớp TNL cũng hoạt động trong tế bào chất. Các ví dụ về protein lớp TNL trình bày ở Bảng 2. Cả 2 lớp CNL và TNL còn được xếp vào chung một họ protein kháng gọi là họ NB- LRR. Số lượng gen kháng của họ này đươc xem là chiếm số lượng lớn nhất trong các họ protein (Ví dụ trên lúa có hơn 400 gen; Arabidopsis có 150 gen). Đối với cả 2 lớp, đầu amin (chứa vùng CC hoặc TIR) chịu trách nhiệm tương tác với phân tử được bảo vệ - guardee (xem phần 1.5) hoặc với các phân tử phía hạ lưu của đường hướng dẫn truyền tính kháng. Phần trung tâm là vùng NBS có khả năng liên kết và thủy phân ATP và do đó chịu trách nhiệm khởi động đường hướng dẫn truyền tín hiệu. Ở đầu carboxyl, chuỗi LRR chịu trách nhiệm qui định tính đặc hiệu đối với elicitor mặc dù phần lớn là gián tiếp. 5.4. Cf Lớp protein kháng thứ tư là một số các protein Cf phân lập từ cà chua như Cf2, Cf4, Cf5, Cf9 qui định tính kháng với nấm Cladosporium fulvum mang các gen Avr tương ứng là AvrCf2, AvrCf4, AvrCf5, AvrCf9. Các protein này thiếu vùng NB; không có hoạt tính kinase. Các prtein nhóm này là các protein xuyên màng với vùng LRR nằm bên ngoài (trên bề mặt tế bào). 5.5. Xa21 Lớp protein kháng thứ 5 chỉ có protein Xa21 phân lập từ lúa. Protein Xa21 là một protein xuyên màng, có một vùng LRR nằm bên ngoài (trên bề mặt tế bào) và một vùng kinase nằm bên trong tế bào chất. Một số protein R không thuộc 5 lớp trên gồm:  Hml là một enzyme khử độc và kháng nấm Cochlibolus trên ngô. 7  Mlo là một protein màng tế bào lúa miến (barley) mà các đột biến lặn của nó qui định tính kháng nấm phấn trắng và có lẽ điều khiển âm các phản ứng phòng thủ.  RPW8 là protein phân lập từ cây Arabidopsis qui định tính kháng nấm phấn trắng theo kiểu không đặc hiệu chủng. PRW8 cũng là một protein xuyên màng. 6. TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN R VÀ AVR 6.1. Tương tác trực tiếp – mô hình Elicitor – Receptor Quan hệ gen-đối-gen lúc đầu đã được giả thiết là dựa trên tương tác trực tiếp giữa protein R và Avr protein. Sự tương tác này được gọi là mô hình Elicitor – Receptor, trong đó elicitor là các protein Avr đóng vai trò là chất kích hoạt còn receptor các protein kháng đóng vai trò là chất tiếp nhận. Phản ứng kháng hình thành chỉ khi có sự tương tác trực tiếp giữa elicitor và receptor. Hiện nay, sự tương tác trực tiếp giữa 2 thành phần này mới chỉ được chứng minh là đúng trên một số ít trường hợp, tất cả đều liên quan đến các protein kháng lớp TIR/CC-NBS-LRR. Dưới đây là các trường hợp có tương tác trực tiếp. 1. Tương tác giữa protein AvrPi-ta (của nấm Pyricularia oryzae) và protein Pi-ta (lúa). 2. Tương tác giữa AvrL567 (của nấm M. lini) và các protein L5, L6, L7 (họ các protein kháng thuộc locus L của cây lanh) 3. Tương tác giữa AvrPopP2 (của vi khuẩn R. solanacearum) và protein RRS1 (của Arabidopsis). Mô hình tương tác trực tiếp không thể giải thích được tại sao chỉ với một số gen kháng, cây trồng có thể nhận biết được một số lượng lớn các effector của tác nhân gây bệnh 6.2. Tương tác gián tiếp – mô hình bảo vệ (Guard model) Sự tương tác giữa gen kháng R và Avr để dẫn tới phản ứng kháng gần đây đã được chứng minh chủ yếu thực hiện theo cách gián tiếp gọi là “mô hình bảo vệ”. Theo mô hình này, protein kháng R của ký chủ sẽ liên kết và “bảo vệ” một protein A. Protein được bảo vệ (guardee) này sẽ tương tác với protein Avr của tác nhân gây bệnh và hoạt hóa protein R dẫn tới kích hoạt các phản ứng dẫn tới tính kháng. Thực sự protein kháng R của cây không phát hiện protein Avr mà phát hiện hoạt động của nó có nghĩa nếu protein Avr khi có mặt trong tế bào mà không hoạt động tức không tương tác, thường thông qua hoạt tính enzyme của nó đối với phân tử được bảo vệ, thì protein kháng R sẽ không phát hiện. Mô hình bảo vệ giải thích được tại sao chỉ với một số gen kháng, cây trồng có thể nhận biết được một số lượng lớn các effector của tác nhân gây bệnh. Mô hình này đã được chứng minh bằng thực nghiệm trên nhiều trường hợp. Dưới đây là một số ví dụ: 1. AvrPphB của vi khuẩn P. syringae và protein kháng RPS5 của cây Arabidopsis. AvrPphB là một protease nhóm cystein. Sau khi được vi khuẩn đưa vào trong tế bào cây, AvrPphB sẽ cắt một phân tử protein kinase của ký chủ là PBS1. Protein kháng RPS5 sẽ nhận biết được việc cắt này và khởi động phản ứng kháng. 8 2. AvrRpm1 (hoặc AvrB) của vi khuẩn P. syringae và protein kháng RPM1 của cây Arabidopsis. Khi được đưa vào trong tế bào, AvrRpm1 (hoặc AvrB) sẽ phosphoryl hóa một protein của ký chủ là RIN4. Protein kháng RPM1 giám sát hiện trạng của RIN4 và do đó nhận biết sự phosphoryl hóa của RIN4 và khởi động phản ứng phòng thủ. 7. ĐỒNG TIẾN HÓA GIỮA GEN AVR VÀ R 7.1. Sự đa dang trong quần thể tác nhân gây bệnh Một loài tác nhân tác nhân gây bệnh tồn tại trong hệ sinh thái nông nghiệp cũng như hệ sinh thái tự nhiên rất không đồng nhất về mặt di truyền (đa dạng về mặt di truyền). 7.1.1. Cơ chế tạo ra tính đa dạng của tác nhân gây bệnh Cơ chế tạo ra tính đa dạng di truyền của tác nhân gây bệnh khá phong phú, phụ thuộc đặc điểm của từng nhóm. Một cơ chế chung cho tất cả các nhóm tác nhân gây bệnh là đột biến. Ngoài ra, mỗi nhóm tác nhân gây bệnh còn có một số cơ chế riêng biệt sau 7.1.1.1. Nấm - Sinh sản hữu tính Nấm và vi sinh vật giống nấm gây bệnh cây được phân loại thành các ngành (Division) khác nhau trên cơ sở sinh sản hữu tính, ví dụ N gành Nấm Trứng (Oomycota) (ví dụ như Phytophthora) sinh sản hữu tính tạo bào tử trứng (oospore); Ngành Nấm Đảm (Basidiomycota) (ví dụ như các loại nấm gỉ sắt) sinh sản hữu tính tạo bào tử đảm (basidiospore); Ngành Nấm Túi (Ascomycota) (ví dụ như nấm đạo ôn lúa Magnaporthe oryzae) sinh sản hữu tính tạo bào tử túi (ascospore). Trong quá trình sinh sản hữu tính, nấm có thể trao đổi vật liệu di truyền thông qua tái tổ hợp dẫn tới kiểu hình (kể cả các tính trạng kháng bệnh) của con cháu khác với bố mẹ. Nấm sinh sản hữu tính nhờ sự tương hợp hữu tính (sexual compatibility) và được điều khiển bởi các gen qui định kiểu ghép cặp (mating type) khác nhau. Nếu sự sinh sản hữu tính được thực hiện từ 2 cá thể khác nhau thì nấm được gọi là loài dị tản (heterothallic). Ví dụ nấm Phytophthora infestans là một loài dị tản, có 2 kiểu ghép cặp ký hiệu là A1 và A2. Chỉ khi 2 mẫu nấm P. infestans độc lập (dị tản) có kiểu ghép cặp khác nhau mới có thể sinh sản hữu tính. Nếu sự sinh sản hữu tính được thực hiện từ cùng một cá thể (tự thụ) thì nấm được gọi là loài đồng tản (homothallic). Chú ý sinh sản hữu tính đồng tản không được điều khiển bởi gen qui định kiểu ghép cặp và cũng không tạo ra sự đa dạng di truyền. Sự giao phối chéo (intersterility) khác loài chỉ xảy ra đối với nấm đảm và cũng chỉ xảy ra giữa các loài khá đồng nhất về di truyền. Sinh sản cận tính (parasexuality), thường được định nghĩa chính thức là một hình thức sinh sản hữu tính trong loài, nhưng cũng có thể xảy ra giữa các loài có quan hệ gần gũi như đã được chứng minh đối với một số loài nấm trứng như Phytophthora. Chú ý trong sinh sản cận tính khác loài, có sự trao đổi và tái tổ hợp vật liệu di truyền nhưng không có phân bào giảm nhiễm (meiosis). Nhiều loài nấm Phytophthora thường phát hiện thấy cùng gây bệnh trên một cây và việc giao phối cận tính có thể xảy ra, nhưng con lai thường bất dục. 9 vi dụ chỉ khoảng 4-5% con lai giữa P. palmivora và P. cinnamomi có khả năng sinh bào tử trứng. Sư trao đổi vật liệu di truyền thông qua sinh sản có nghĩa từ thế hệ bố mẹ sang thế hệ con cháu được gọi là chuyển gen theo chiều dọc (vertical gene transfer). 7.1.1.2. Nấm – chuyển gen theo chiều ngang Cho tới nay, nhiều bằng chứng cho thấy nấm có khả năng chuyển vật liệu di truyền không thông qua sinh sản giữa các cá thể trong loài và khác loài. Sự di chuyển vật liệu di truyền theo kiểu này được gọi là chuyển gen theo chiều ngang (horizontal gene transfer). Sự chuyển gen theo chiều ngang có thể thực hiện thông qua plasmid (vd plasmid của nấm Neurospora; chú ý plasmid của nấm thường là dạng sợi thẳng, kích thước khoảng 2-10 kb); virus (ví dụ virus của nấm Rhizoctonia solani) 7.1.1.3. Nấm – Đột biến Đối với nấm, ngoại trừ nấm đảm, thì giai đoạn vô tính và sinh sản vô tính chiếm ưu thế trong chu kỳ phát triển. Nhiều loài thậm chí giai đoạn hữu tính không xảy ra trong tự nhiên (ví dụ như đối với nấm đạo ôn lúa Magnaporthe oryzae). Như vậy đột biến là một cơ chế quan trọng dẫn tới sự đa dạng của nấm. 7.1.1.4. Vi khuẩn – sinh sản hữu tính Đối với vi khuẩn, có ít nhất 3 loại sinh sản giống như sinh sản hữu tính tồn tại trong quần thể:  Biến nạp (transformation) : là hình thức chuyển gen trong đó vi khuẩn nhận hấp thụ qua vách tế bào vật liệu di truyền được giải phóng ra bởi vi khuẩn cho. Sau khi biến nạp, vật liệu di truyền của tế bào chi sẽ được tổng hợp vào bộ gen của tế bào vi khuẩn nhận.  Giao nạp (conjugation): là hình thức chuyển gen giữa 2 tế bào vi khuẩn khác “giới tính” ký hiệu là F + và F Khi 2 tế bào vi khuẩn tiếp xuc với nhau sẽ hình thành một cầu nối (pilus) và plasmid (hoặc một mảnh genome) của tế bào F + sẽ chuyển sang tế bào F - qua pilus.  Tải nap (transduction): là hình thức chuyển gen từ tế bào cho sang tế bào nhận thông qua vector là thực khuẩn thể (Bacteriophage). 7.1.1.5. Vi khuẩn – đột biến Tương tự như nấm, vì vi khuẩn sinh sản vô tính là chủ yếu nên đột biến là cơ chế quan trọng nhất dẫn tới sự đa dạng di truyền của vi khuẩn. 7.1.1.6. Virus – tái tổ hợp Một cơ chế quan trọng dẫn tới sự đa dạng di truyền của virus là tái tổ hợp (recombination). Hiện tượng tái tổ hợp rất phổ biến đối với virus thực vật. Do virus tái sinh trong tế bào chất hoặc nhân của tế bào ký chủ nên tái sinh virus phụ thuộc hoàn toàn vào bộ máy phiên mã và tái sinh của tế bào ký chủ. Nếu tế bào bị nhiễm nhiều loại virus thì các phân tử virus (khác loài hoặc chủng) có thể trao đổi chéo với nhau thông qua tái sinh chẳng hạn các enzyme polymerase của ký chủ sẽ chuyển từ khuôn của phân tử virus này sang virus khác dần tới tạo ra một phân tử lai được hình thành từ 2 khuôn khác nhau. Ví dụ về tái tổ hợp là Tomato yellow leaf curl Vietnam virus 10 [...]... fulvum Xa21 Lúa X oryzae Hm1 HS1pro1 Mlo Rpg1 RPW8 RRS1-R RTM1 RTM2 Ve1, Ve2 Ngô Củ cải Lúa miến Lúa miến Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Cà chua Cochliobolus carbonum Heterodera schachtii B graminis Puccinia graminis Erysiphe cichoracearum Ralstonia solanacearum Tobacco etch virus Tobacco etch virus Verticillium alboatrum CC-NB-LRR TIR-NB-LRR Cf Xa21 L M N P RPP1 RPP4 RPP5 RPS4 Cf2 Cf4 Cf5... 12 sinh) tại một quần thể phụ bị phá vỡ thì một cân bằng mới dễ dàng được thiết lập do sự di chuyển của tác nhân gây bệnh cũng như sự chuyển gen của cây ký chủ thông qua giao phấn hoặc phát tán hạt từ các quần thể phụ lân cận Bảng 2 Lớp gen R Gen R Gen Avr Ký chủ Ký sinh Pto Pto AvrPto, AvrPtoB Cà chua P syringae Bs2 Dm3 Gpa2 Hero HRTb I2 Mi Mla Pib Pi-ta R1 Rp1 RPM1 RPP8b RPP13 RPS2 RPS5 Rx1a Rx2... tương tự bước thứ nhất, là tạo ra giống kháng mới mang gen kháng R2 (có kiểu gen R1/R2/rn Giống kháng này có thể kháng lại chủng tác nhân gây bệnh có kiểu gen avr1/Avr2/Avrn do có sự nhận biết giữa sản phẩm của gen R2 (ký chủ) và Avr2 (ký sinh) Bước thứ 4, tương tự bước thứ 2, là sự chọn lọc các đột biến tự phát các cá thể có kiểu gen avr1/avr2/Avrn hình thành trong quần thể tá nhân gây bệnh Như vậy sự... Ralstonia solanacearum Tobacco etch virus Tobacco etch virus Verticillium alboatrum CC-NB-LRR TIR-NB-LRR Cf Xa21 L M N P RPP1 RPP4 RPP5 RPS4 Cf2 Cf4 Cf5 Cf9 CP Avr-pita AvrPm1, AvrB AvrPt2 AvrPphB CP CP Helicase AvrPs4 Avr2 Avr4 Avr5 13 14 ... là giống A có kiểu gen r1/r2/rn hoàn toàn bị nhiễm bệnh đối với tác nhân gây bệnh B có kiểu gen Avr1/Avr2/Avrn Bước đầu tiên là đưa 1 gen kháng R1 vào giống A để có giống kháng R1 có kiểu gen R1/r2/rn Sự nhận biết đặc hiệu giữa sản phẩm của gen R1 (ký chủ) và Avr1 (ký sinh) đã tạo ra sự kháng bệnh Bước thứ 2 là sự chọn lọc các cá thể ký sinh mang đột biến tự phát avr1/Avr2/Avrn Do các cá thể mang đột... trong quần thể tác nhân gây bệnh không độc ở bước 2 và 4 vốn, về lý thuyết, không thể nhân lên trong quần thể cây kháng là do 1 trong 2 khả năng: (i) đột biến có thể được mang từ nơi khác tới hoặc (ii) đột biến hình thành tại chỗ nếu quần thể tác nhân gây bệnh không độc có thể gây bệnh ở mức độ yếu Thời gian tồn tại của giống kháng có thể kéo dài nếu đưa 2 hoặc nhiều gen kháng vào giống kháng Giống cây... mỗi một dạng chuyên hóa, các tác nhân gây bệnh có thể phân nhóm lại thành các race trên cơ sở tính gây bệnh trên các giống cây khác nhau; ví dụ F oxysporum f.sp cubense gây bệnh trên chuối gồm 4 race (1 ,2, 3 ,4) Tương tự, loài vi khuẩn R solanacearum gồm 5 race được phân biệt dựa trên tính gây bệnh trên các cây ký chủ khác nhau 7.3 Đồng tiến hóa giữa gen Avr và gen kháng R 7.3.1 Đồng tiến hóa trong sản... curl Vietnam virus (ToLCV) ở phía bên phải của bộ gen 7.1.1.7 Virus – đột biến Đột biến cũng là cơ chế quan trọng dẫn tới sự đa dạng của virus thực vật Do tốc độ sinh sản rất nhanh, trong quần thể các phân tử virus trên cùng một cây thường tồn tại nhiều đột biến 7 .2 Các lực điều khiển sự tiến hóa của tác nhân gây bệnh Nhiều yếu tố tham gia điều khiển sự tiến hóa của tác nhân gây bệnh Các lực chính bao... thời khắc phục tất cả các gen kháng này càng thấp Tuy nhiên việc tạo giống vừa mang nhiều gen kháng chủ vừa duy trì các tính trạng nông học tốt không dễ dàng 7.3 .2 Đồng tiến hóa trong hệ sinh thái tự nhiên Trong hệ sinh thái tự nhiên, cơ chế đồng tiến hóa giữa ký sinh-ký chủ cũng tương tự như trong sản xuất nông nghiệp Tuy nhiên biểu hiện và hậu quả của sự đồng tiến hóa này có nhiều điểm khác biệt: Trong... động đến sự tiến hóa của tác nhân gây bệnh ở mức loài hoặc dưới loài Ví dụ,đã có bằng chứng cho thấy 3 loài nấm P mirabilis, P ipomoeae, và P infestans tiến hóa từ một tổ tiên chung và nhiễm trên 3 họ thực vật hoàn toàn khác nhau Ở mức dưới loài, hậu quả của tương tác giữa tác nhân gây bệnh với các loài/giống cây ký chủ khác nhau đã dẫn tới hình thành các khái niệm chủng sinh lý (race), dạng chuyên hóa . gen-đối-gen. Thuyết gen-đối-gen (gene-for-gene) là nền tảng của nghiên tính kháng đặc hiệu ký chủ. Thuyết gen-đối-gen gắn liền với tên tuổi của Harol Henry Flor (190 0-1 991), một nhà bệnh cây học. nhiễm và được gọi là các giống chỉ thị 2. 4. Các thí nghiệm của Flor  Năm 19 42 , Flor lai chủng nấm số 6 với số 22 . Khi thử tính gây bệnh của 67 con cháu F2 trên 12 giống chỉ thị ông đã: • Xác định. chua: Cf2, Cf9 <=> Nấm C. fulvum: Avr2, Avr9 • Cà chua: AvrPto <=> Vi khuẩn P. syringae: Pto 3 .2. Đặc điểm quan hệ gen-đối-gen  Phần lớn quan hệ gen-đối-gen là quan hệ trội-trội có