Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 523 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO CÂY SÂM CAU (CURCULIGO ORCHIOIDES GAERTN) THE EFFECT OF PHYTOHORMONE ON MULTIPLE SHOOTS IN VITRO OF CURCULIGO ORCHIOIDES GAERTN SVTH: Nguyễn Thị Út, Nguyễn Thị Xuân Tâm, Từ Thị Tú Lớp 06CSM, Trường Đại học Sư phạm GVHD: Võ Châu Tuấn Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm TÓM TẮT Cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thuộc họ Thuỷ tiên (Amaryllideaceae) là cây dược liệu với đặc tính chống ung thư có nguy cơ tuyệt chủng. Do đó, vấn đề bảo tồn loài này rất cần thiết. Ở đây chúng tôi trình bày kết quả ảnh hưởng của 6-benzyl adenine (BA), Kinetin (Kn), BA + Kn đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Sâm cau từ chồi đỉnh. Số chồi phát sinh cao nhất trên môi trường MS bổ sung tổ hợp 1.0 mg/l BA + Kn. ABSTRACT Curculigo orchioides Gaertn is an endangered medicinal plant with anticancer properties belonging to Amaryllideaceae. Therefore, the need for conservation of this plant is crucial. Here, we describe effect of 6-benzyl adenine (BA), Kinetin (Kn), BA + Kn on the multiple shoot in vitro of C. orchioides from shoot tip explant Maximum number of shoot buds induction on MS medium supplemented with BA + KN (each at 1.0 mg/l). 1. Mở đầu Ngành Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ra đời hằng năm mang lại lợi ích lớn cho nhiều nước trên thế giới. Bên cạnh việc khắc phục nhược điểm của biện pháp nhân giống truyền thống, nó còn thể hiện ưu điểm vượt trội: tạo ra lượng lớn cây giống sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền trong thời gian ngắn; tạo sinh khối tế bào làm nguyên liệu cho công nghiệp và y dược. Cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn) là loài dược thảo quý hiếm. Theo y học cổ truyền Ấn Độ và cục dược lí Trung Quốc, rễ cây Sâm cau có tác dụng trị một số bệnh như ung thư, vàng da, hen suyễn, bồi bổ cho phụ nữ sau khi sinh, người già… Do khai thác quá mức và không kiểm soát nên Sâm cau có nguy cơ tuyệt chủng. Trong bài báo cáo này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn ) nhằm tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho việc nhân nhanh chồi in vitro làm cơ sở cho xây dựng quy trình nhân nhanh loài cây dược liệu quý này. 2. Nội dung 2.1. Vật liệu và phương pháp 2.1.1. Vật liệu Chồi đỉnh của cây Sâm cau ngoài tự nhiên và đỉnh sinh trưởng của chồi in vitro sau Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 524 8 tuần tái sinh. 2.1.2. Phương pháp Chồi đỉnh của cây Sâm cau nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA (1 - 4 mg/l) Đỉnh sinh trưởng của chồi in vitro nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA (0.5 - 4 mg/l), Kn (0.5 - 4 mg/l), BA + Kn (0.5 - 4 mg/l). Các mẫu cấy được nuôi trong môi trường MS bổ sung 30 g/l đường Sacarose, agar 8.0 g/l, than hoạt tính 1.0 g/l, pH = 5.8, điều kiện ánh sáng 2000 - 2500 lux, nhiệt độ 25 ± 2 0 C. 2.2. Kết quả và thảo luận 2.2.1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi in vitro Chồi đỉnh sau thời gian 8 tuần nuôi cấy, kết quả được trình bày ở bảng 2.1 Bảng 2.1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi in vitro BA (mg/l) Tỷ lệ mẫu bật chồi không nhiễm(%) Số chồi/mẫu cấy Chiều cao chồi (cm) 1,0 83,33 1,00 ± 0,00 3,90 ± 0,18 1,5 66,67 1,00 ± 0,00 4,36 ± 0,12 2,0 50,00 1,00 ± 0,00 4,86 ± 0,08 2,5 83,33 1,00 ± 0,00 4,98 ± 0,18 3,0 83,33 1,00 ± 0,00 5,13 ± 0,35 3,5 50,00 1,00 ± 0,00 5,20 ± 0,23 4,0 100,00 1,50 ± 0,28 5,50 ± 0,14 Kết quả nghiên cứu cho thấy trên môi trường MS bổ sung BA 4.0 mg/l là tốt nhất cho tái sinh chồi in vitro. Số chồi đạt được là 1.50 chồi/mẫu cấy với chiều cao trung bình đạt 5.50 cm. Theo nghiên cứu của Purohit (1994), phần lớn các loài cây thuộc họ Thuỷ tiên có khả năng tái sinh chồi tốt trên môi trường bổ sung BA ở nồng độ cao. 1 2 Hình 2.1. Ảnh chồi Sâm cau trên môi trường tái sinh 1: Mẫu bắt đầu nuôi cấy trên môi trường tái sinh 2: Chồi In vitro sau 8 tuần nuôi cấy Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 525 2.2.2. Ảnh hưởng của BA, Kn, BA + Kn đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Sâm cau. Đỉnh sinh trưởng dài 1 cm, tách từ môi trường tái sinh tốt nhất được chuyển sang môi trường nhân nhanh sau thời gian 8 tuần nuôi cấy. Kết quả được trình bày ở bảng 2.2 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của BA, Kn, BA + Kn đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Sâm cau sau 8 tuần nuôi cấy. Chất kích thích sinh trưởng (mg/l) Số chồi/mẫu cấy Chiều cao chồi (cm) BA 0,5 5,00 ± 0,41 2,58 ± 0,50 1,0 5,75 ± 1,25 2,65 ± 0,49 1,5 7,75 ± 1,11 1,43 ± 0,34 2,0 8,00 ± 0,41 0,69 ± 0,18 2,5 8,25 ± 1,03 0,25 ± 0,02 3,0 4,75 ± 0,48 0,23 ± 0,04 3,5 4,25 ± 0,48 0,23 ± 0,37 4,0 3,5 ± 0,65 0,20 ± 0,04 Kn 0,5 1,25 ± 0,25 2,57 ± 0,40 1,0 1,75 ± 0,48 3,30 ± 0,33 1,5 1,18 ± 0,12 2,91 ± 0,26 2,0 1,00 ± 0,40 2,30 ± 0,52 2,5 1,00 ± 0,40 2,21 ± 0,35 3,0 0,75 ± 0,25 2,15 ± 0,26 3,5 1,00 ± 0,00 1,10 ± 0,46 4,0 1,00 ± 0,00 0,50 ± 0,35 BA + Kn 0,5 + 0,5 7,00 ± 0,40 2,85 ± 0,08 1,0 + 1,0 15,75 ± 1,65 3,05 ± 0,06 1,5 + 1,5 10,05 ± 0,65 3,05 ± 0,13 2,0 + 2,0 9,00 ± 0,91 2,95 ± 0,23 2,5 + 2,5 8,00 ± 0,91 2,85 ± 0,15 3,0 + 3,0 7,50 ± 0,86 2,85 ± 0,10 3,5 + 3,5 5,75 ± 0,48 2,77 ± 0,09 4,0 + 4,0 5,00 ± 0,70 2,75 ± 0,16 Từ kết quả nghiên cứu ta thấy môi trường MS bổ sung BA (0.5 – 4.0 mg/l) đều có Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 526 khả năng phát sinh cụm chồi, số chồi tăng dần từ 0.5 – 2.5 mg/l và có xu hướng ức chế phát sinh cụm chồi từ 3.0 – 4.0 mg/l. Số chồi đạt cao nhất ở nồng độ 2.5 mg/l ( với 8.25 chồi/mẫu cấy sau thời gian 8 tuần). Tuy nhiên ở nồng độ 2.0 – 4.0 mg/l cụm chồi hầu như không phân hoá mà có xu hướng tạo phôi . Theo nghiên cứu của Nagesh (2008), môi trường MS bổ sung 2.0 mg/l là tốt nhất với số chồi đạt 5.9 chồi/mẫu. Trên môi trường MS bổ sung Kn (0.5 – 4 mg/l) đều không có khả năng kích thích phát sinh cụm chồi. Số chồi chỉ đạt cao nhất là 1.75 chồi/mẫu ở nồng độ 1.0 mg/l trong thời gian 8 tuần. Như vậy cũng là cytokinin nhưng Kn hầu như không có khả năng kích thích phát sinh cụm chồi đối với cây Sâm cau Tuy nhiên ở đối tượng khác như cây Picrorhizo kurroa ở nồng độ 1.0 – 5.0 mg/l đều có khả năng phát sinh cụm chồi (Lal và cs, 1988). Trên môi trường bổ sung tổ hợp BA và Kn với tỉ lệ 1:1 (0.5 – 4.0 mg/l) đều có khả năng phát sinh cụm chồi, số chồi tăng từ 0.5 – 1.0 mg/l, sau đó giảm dần từ 1.5 - 4.0 mg/l, đạt cao nhất ở 1.0 mg/l với 15.75 chồi/mẫu sau 8 tuần nuôi cấy. Theo nghiên cứu của Nagesh (2008) môi trường tối ưu cho nhân nhanh chồi là MS bổ sung tổ hợp BA + Kn 1.0 mg/l với số chồi đạt 9.96 chồi/mẫu cấy. 2 1 3 4 Hình 2.2. Chồi Sâm cau trên môi trường nhân nhanh 1. Mẫu bắt đầu chuyển sang môi trường nhân nhanh 2. Chồi in vitro trên môi trường 2.5 mg/l BA sau 8 tuần nuôi cấy 3. Chồi in vitro trên môi trường 1.0 mg/l Kn sau 8 tuần nuôi cấy 4. Chồi in vitro trên môi trường 1.0 mg/l BA + Kn sau 8 tuần nuôi cấy Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 527 3. Kết luận Từ kết quả nghiên cứu đạt được chúng tôi rút ra kết luận sau: - Môi trường MS bổ sung 1.0 – 4.0 mg/l BA đều có khả năng tái sinh chồi in vitro cây Sâm cau, tuy nhiên môi trường MS có bổ sung 4.0 mg/l BA là tốt nhất (đạt 1.50 chồi/mẫu và chiều cao trung bình 5.50 cm sau 8 tuần nuôi cấy). - Môi trường MS bổ sung 30 g/l đường sacarose, 8.0 g/l agar, 1.0 g/l than hoạt tính, 1.0 mg/l tổ hợp BA + Kn là tối ưu cho nhân nhanh chồi in vitro cây Sâm cau. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Dương Công Kiên (2003), Nuôi cấy mô thực vật II, Nxb Đại học Quốc gia Thành ph Hồ Chí Minh. [2] Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo Trình Nhập Môn Công Nghệ Sinh Học, Nxb Đại Học Huế. [3] Bhavisha B. Wala and Yogesh T. Jasrai (2003), “Micropropagation of an endangered Medicinal plant: Curculigo orchioides Gaertn”, Plant Tissue Cult, 13(1), pp.13-19. [4] Lal, N., P.S. Ahuja, A.K. Kukreja & B. Pandey (1988), “Clonal propagation of Picrorhiza kurroa Royk ex Benth by shoot tip culture”, Plant Cell Rep, 7, pp. 202- 205. [5] Murashige T, Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”, Physiol Plant, pp. 97-473. [6] Nagesh K. J. and Shanthamma C (2008), “In vitro propagation and antioxidant Cell.Dev.Biol – Plant, 43, pp.150 – 154. [7] Purohit SD, Dave A and Gotam K (1994), “Micropropagation of safed musli (Chlorophytum borivilianum), a rare Indian medicinal herb”. Plant cell tiss. Org. Cult, 39, pp. 93-96. . Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 523 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI IN VITRO CÂY SÂM CAU (CURCULIGO. chúng tôi trình bày kết quả ảnh hưởng của 6-benzyl adenine (BA), Kinetin (Kn), BA + Kn đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Sâm cau từ chồi đỉnh. Số chồi phát sinh cao nhất trên môi trường. Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 525 2.2.2. Ảnh hưởng của BA, Kn, BA + Kn đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Sâm cau. Đỉnh sinh trưởng dài