BIỆT HÓA TẾ BÀO GèC MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI THÀNH NGUYÊN BÀO XƯƠNG Trần Công Toại*; Huỳnh Duy Thảo*; Phan Kim Ngọc**; Nguyễn Phương Thảo* TÓM TẮT Máu cuống rốn (MCR) người chứa nguồn tế bào gốc (TBG) có khả biệt hóa thành số kiểu tế bào khác thể Chúng nghiên cứu phương pháp thu nhận, phân lập biệt hóa TBG thành nguyên bào xương để ứng dụng lĩnh vực y học tái tạo, đặc biệt cơng nghệ mơ ghép xương §ã phân lập tế bào đơn nhân từ MCR dung dịch ly giải hồng cầu ficoll - hypaque Tế bào cảm ứng tạo xương cách nuôi môi trường IMDM với 15% FCS bổ sung dexamethasone, ascorbic acid, β - glycerol phosphate, vitamin D2 FGF - Tế bào có thay đổi hình thái giống với tế bào xương Kết nhuộm dương tính với Alizarin red, Von kossa alkaline phosphatase Kết chạy RT - PCR dương tính với osteopontin osteocalcin §ã xây dựng qui trình thu nhận, phân lập biệt hóa TBG từ máu cuống rốn người thành nguyên bào xương * Từ khóa: Máu cuống rốn; Tế bào gốc; Biệt hóa tạo xương; Osteopontin; Osteocalcin DIFFERENTIATion of HUMAN UMBILICAL CORD BLOOD STEM CELLS INTO OSTEOBLASTIC LINEAGE CELLS Tran Cong Toai; Huynh Duy Thao; Phan Kim Ngoc; Nguyen Phuong Thao SUMMarY Human umbilical cord blood (UCB) is an incredible source of stem cells which are able to differentiate into many kind of cells of the body Our team has developed a procedure to collect, isolate, and differentiate UCB stem cells into osteoblast for application in regenerative medicine especial for bone tissue engineering We have isolated mononuclear cells from umbilical cord blood by erythrolysis solution and ficoll - hypaque solution Mononuclear cells were induced into osteoblast by using an osteogenic medium IMDM plus 15% FCS, dexamethasone, ascorbic acid, β - glycerol phosphate, vitamin D2 and FGF - Cells started to change shape, assuming the typical osteocyte like shape Cells were positive with Alizarin red stain, Von kossa stain, and alkaline phosphatase stain RT - PCR for osteopontin and osteocalcin gene markers were positive We confirmed the validity of a protocol regarding the isolation, culture and differentiation of UCB stem cells into osteoblasts * Key words: Umbilical cord blood; Stem cells; Osteogenic differentiation; Osteopontin; Osteocalcin * Tr-ờng Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch; ** Đại học Khoa hc Tự nhiênThành phố Hồ Chi Minh Ph¶n biƯn khoa häc: GS TS Lª Gia Vinh ĐẶT VẤN ĐỀ Máu cuống rốn người chí tế nguồn mẫu dồi bào thần kinh… MCR nh-ng trước sử dụng để chưa quan tâm điều trị số bệnh nghiên cứu, bị bỏ máu hệ thống miễn xử lý loại dịch có liên quan đến rác thải y tế số bệnh di truyền, MCR chứa nhiều dòng ung thư rối TBG trẻ có khả loạn chức có liên phân chia tốt, quan máu [1] biệt hóa thành số Ngồi ra, ưu điểm loại tế bào khác MCR dễ thu nhận, số như: nguyên bào xương lượng máu thu [9, 11], nguyên bào sụn nhiều [7], thu nhận [9], tế bào mỡ [9], máu không gây ảnh nguyên bào sợi, nguyên hưởng đến sức khoẻ bào cơ, tế bào gan bà mẹ bé [6] Khi tiến hành nghiên cứu ứng VẬT LIỆU VÀ dụng không gặp nhiều PHƯƠNG PHÁP khó khăn, cản trở mặt NGHI£N CøU đạo đức sinh học luật VËt liÖu nghiªn pháp nghiên cøu cứu TBG phơi người Mẫu MCR thu nhận từ MCR ngày sản phụ sinh nhiều người quan tâm Bệnh viện Hùng Vương, nghiên cứu xem phải đạt tiêu chuẩn nguồn cung cấp [2, 4]: sản phụ đồng TBG thay cho nguồn ý cho MCR để nghiên TBG từ tủy xương cứu, theo dõi lâm máu ngoại vi tương sàng, làm xét nghiệm lai trước sinh Thai lấy khoảng 36 - 42 tuần tuổi Thai nhi sinh khỏe mạnh, không dị tật bẩm sinh Mẫu MCR Sử dụng hai phương âm tính với xét pháp khác để phân nghiệm HIV, HBsAg, lập tế bào đơn nhân từ anti - HCV, VDRL MCR Sử dụng dung Ph-ơng pháp nghiên dch ficoll - hypaque (1,077g/ml, GE cứu 2.1 Phân lập tế bào đơn nhân từ MCR: LÊy MCR sau cắt cuống rốn qua ng tnh mch rn bng bơm tiêm vụ trựng, cho vào thùng vận chuyển đưa phịng thí nghiệm Bảo quản máu tạm thời tủ lạnh 40C, chờ xử lý Healthcare BioSciences AB) dung dịch ly giải hồng cầu để thu nhận tế bào đơn nhân Dịch tế bào đơn nhân Tế bào đơn nhân sau sau phân lập phân lập đánh giá tỉ lệ sống/chết nuôi chai nuôi T cách nhuộm tế bào 25 cm2 mật độ 106 - 107 với trypan blue (Sigma, tế bào/ml với môi trường USA) xác định mật độ Iscove’s modified tế bào/ml Nhuộm dịch tế dulbecco’s medium bào đơn nhân với dung (Sigma, USA), bổ sung dịch Giemsa (Merck, 15% fetal calf serum Germany) để đánh giá (Sigma, hình thái tế bào 2.2 Nu«i cÊy: USA), kháng sinh 100 UI/ml penicilin 100 streptomycin mg/ml Nuôi tế bào tủ ấm dung dịch trypsin - với 5% C02, 370C EDTA (Gibco, Mü) Tế Thay môi trường ngày/1 lần Sau bào cấy chuyền đến - lần thứ tiến hành tuần nuôi cấy, tế bào biệt hóa thành ngun ni đạt mật độ phù hợp bào xương với thí để tiến hành cấy chuyền nghiệm sau: (khoảng 60 - 80% diện tích chai ni) Thí nghiệm 1: mẫu tế bào cy chuyn 2.3 Biệt hoá thành ln th 3, nuụi mụi nguyên bào x-ơng: trng IMDM, b sung Tế bào sau thời gian 15% FCS, kháng sinh nuôi cấy sơ cấp đạt mật penicilin độ phù hợp (khoảng 60% streptomycin Sử dụng - 80% diện tích chai làm mẫu chứng âm ni) cấy chuyền Thí nghiệm 2: mẫu tế sang chai nuôi với bào cấy chuyền lần thứ 3, đạt mật độ phù hợp với mơi trường sau: biệt hóa thay mơi IMDM, 15% FCS, 0,1 trường cảm ứng biệt hóa mM Dex, 10 mM b - Gl, tạo nguyên bào xương 100 µg/ml AA, 10-7 M với mơi trường: IMDM, vitamin D2 kháng 15% FCS, 0,1 mM sinh dexamethasone (Dex), 10 mM b Thí nghiệm 4: mẫu tế - bào cấy chuyền lần thứ glycerolphosphate (b - 3, đạt mật độ phù hợp Gl), 100 µg/ml ascorbic biệt hóa thay mơi acid (AA) kháng sinh trường cảm ứng biệt hóa Thí nghiệm 3: mẫu tế tạo nguyên bào xương bào cấy chuyền lần thứ với môi trường sau: 3, đạt mật độ phù hợp IMDM, 15% FCS, 0,1 biệt hóa thay mơi mM Dex, 10 mM b - Gl, trường cảm ứng biệt hóa 100 µg/ml AA, 10 ng/ml tạo ngun bào xương FGF - kháng sinh Nu«i cÊy tÕ bµo ngun bào sợi hình chiếm ưu Sau 14 MCR in vitro Tế bào sau phân lập ngày nuôi (10X), tế bào hai phương pháp dạng giống nguyên bào nuôi mơi sợi chiếm ưu trường IMDM có bổ với tế bào hình sung 15% huyết dạng phẳng mỏng bám sát bề mặt chai nuôi kháng sinh Sau ngày nuôi cấy (10X) bắt đầu xuất tế bào có hình dạng giống ngun bào sợi, hình trịn, hình Sau 14 ngày, tế bào đạt mật độ cấy chuyền (khoảng 70 - 80% din tớch chai nuụi) Xác định tạo thành v nhng t bo phng nguyên bào x-ơng in bám sát bề mặt chai nuôi vitro Sau 10 ngày ni cấy (10X), tế bào giống * KÕt qu¶ nhm: Tế bào sau biệt hóa nốt màu đen lớn, thành nguyên bào xương rải rác có nốt khoảng 21 ngày xác xương màu đen nhỏ định tạo thành chất nốt xương Chúng tiến hành nhuộm mẫu với thuốc Tế bào nhuộm với nhuộm fast red violet LB Alizarin red (10X) vµ salt để xác định có ni mơi trường mặt enzyme alkaline biệt hóa tạo xương, phosphatase, kÕt qu¶ nhuộm chất xương cho thÊy: tế bào sau tạo phản ứng với nhuém có xu hướng kết thuốc nhuộm tạo màu tụ vào thành cụm đỏ đặc trưng thuốc (cơ sở hình thành nhuộm, tế bào nhuộm nốt xương), ë nơi với Von kossa (10X): có tạo cụm, màu hồng nốt xương tạo phản xuất đậm nhiều ứng với thuốc nhuộm tạo nhng chỗ khỏc chai nuụi, chng t nguyờn bo xương in enzyme alkaline hoạt vitro, tiến hành chạy RT động nơi - PCR với marker mạnh osteopontin sớm) * RT - PCR: Để khẳng định kết biệt hóa tế bào thành (marker osteocalcin (marker muộn) với trình tự mồi Kết cho thấy: Thang b-Actin Mẫu Mẫu chứng âm b - actin Trình tự khuếch đại 330 bp b actin Trình tự khuếch đại 450bp bp Hình 1: RT - PCR cho marker osteopontin (14 ngày) sau biệt hóa Chạy RT - PCR xuất vạch có kích thước sản phẩm 330 bp cho gen osteopontin BÀN LUẬN Hình 2: RT - PCR cho marker osteocalcin (27 ngày) sau biệt hóa Kết có mẫu 64 cho kết dương tính với xuất vạch có kích thước 405 bp cho gen osteocalcin hypaque cho mật độ tế Nhìn chung, mẫu MCR bào cao gấp 1,7 lần so đạt tiêu chuẩn để phân với sử dụng dung dịch li lập nuôi cấy TBG giải hồng cầu Tỉ lệ tế Thể tích máu sử dụng để bào sống/chết phân phân lập 58,73 ± 3,30 ml lập ficoll - hypaque cao (99,87% so Mật độ tế bào sau với 94,98%) phương phân lập từ phương pháp li giải hồng cầu pháp cho thấy: phương pháp sử dụng ficoll - Sè chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày trun thèng häc viƯn qu©n y Có nhiều phương pháp bào/ml 32,8 ± 127,4 x khác để phân lập 107 tế bào/ml MNC từ MCR W Như vậy, kết Schwinger CS sử nghiên cứu nµy gần dụng 21 mẫu MCR, thể giống với W Schwinger tích máu 65,0 ± 22,6 ml, Tuy nhiên, trước víi phương pháp phân phân lập ficoll lập MNC kh¸c hypaque, chúng tơi tiến ficoll, ficoll lần, dung hành làm Buffycoat để thu dịch HES gelatin nhận tế bào bạch Trong đó, phương pháp cầu/MNC Đây ficoll lần dung dịch xem bước HES cho kết tốt làm giàu hay thu nhận nhất, mật độ tế bào đơn MNC, giúp tiết kiệm nhân thu lÇn lượt: nhiều dung dịch 21,5 ± 22,7 x 107 tế ficoll - hypaque đảm bảo ngun mu 80 tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y có chứa TBG cần phân cấy tế bào điều kiện in lập Tuy nhiên, mật độ tế vitro bào thu đ-ợc khụng cao Hỡnh thỏi t bo ca bng W Schwinger dịch đơn nhân sau V× tác giả sử dụng thể phân lập cách tích máu nhiều nhuộm với Giemsa dùng ficoll lần (tốn có khác nhiều dung dịch ficoll phương pháp: phương hơn), tác giả pháp dùng ficoll không đưa số liệu % tế hypaque, tế bào đơn bào sống/chết Tỉ lệ tế nhân đồng dịch bào sống/chết thu ë tế bào tng i sch (ớt tng i cao, > ln tạp tế bào hồng cầu, 90% tÕ bµo sèng Mật tiểu cầu mảnh vỡ tế độ tế bào thu đảm bào) Ngồi ra, kích bảo mặt số lượng, phù thước tế bào đồng hợp để tiến hành ni hơn, bao gồm tế bào t¹p chÝ y - d-ợc học quân số 1-2009 81 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày trun thèng häc viƯn qu©n y đơn nhân, nhân trịn tế bào dạng chiếm gần hết phần hình thoi Ngồi ra, cịn bào tương tế bào, có kích có xuất tế thước trung bình bào phẳng bám sát Tuy nhiên, mặt chai ni có khác lớn tế bào hình kết ni cấy Mật độ đạt để cấy phương pháp: sử chuyền sớm so với dụng ficoll - hypaque để phương pháp li giải tế phân lập, tế bào bắt đầu bào hồng cầu bám dính vào chai ni Víi phương ph¸p sử sớm, tế bào ni dụng dung dịch li giải tế mơi trường lẫn tạp Sau bào hồng cầu, dịch tế bào ngày, chai ni thu khơng có bắt đầu xuất với tế bào đơn tế bào có hình dạng nhân, bạch cầu đa nhân giống ngun bào sợi, cịn sót lại tế bo hng 82 tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y cầu, tiểu cầu mảnh vỡ nhiều môi trường Tuy tế bào Có thể, thời nhiên phương pháp gian tác dụng dung này, thời gian đạt dịch chưa đạt hiệu mật độ cấy chuyền tối ưu theo qui trình, nÕu thường lâu so với để dung dịch tác động phương pháp ficoll hoàn toàn ảnh hưởng hypaque Nhìn chung, đến chất lượng tế bào phương pháp phân lập nuôi cấy (khả sống, cho kết nuôi tốt thời gian bám dính, phát Tế bào phát triển mọc triển cấy chuyền lâu tốt, cấy chuyền hơn) Để khác phục tình khoảng thời gian từ trạng trên, thay môi - tuần sau nuôi trường nuôi lần/ngày Chúng sử dung môi (giúp loại bỏ tế trường IMDM, 15% FCS bào không bám mảnh kháng sinh để nuôi tế vỡ tế bào) tốn bào Ở đây, có s tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 83 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y loi mơi trường khác BlulletKitTM) Nhìn sử dụng Oscar K chung, môi trường nuôi Lee CS sử dụng cấy cho MCR đa IMDM, 20% FBS, 10 dạng, sử dụng môi ng/ml bFGF, mM trường IMDM, DMEM, glutamine kháng sinh; a - MEM, môi trường Myoung Woo Lee CS thương mại pha sẵn sử dụng DMEM, 10% Huyết sử FBS, mM glutamine dụng FBS, FCS kháng sinh; Erices [9] huyết MCR, Yu - Jen Chang lại sử số yếu tố tăng dụng a - MEM, 20% trưởng (FGF) kháng FBS, ng/ml b - FGF sinh kháng sinh; Karren Bieback CS [10] sử dụng MSCGM 84 môi * Môi trường biệt hóa: §ể biệt hóa tạo ngun trường bào xương in vitro cn (MSCGM tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y phải bổ sung số yếu phosphatase; Marcus tè cần thiết như: Dex, Jäger C Rosada sử AA, b - Gl, vitamin D dụng nhuộm hóa mơ FGF Nồng độ miễn dịch với yếu tố biệt hóa sử kháng thể khác nhau; dụng khác nhau, tùy theo Sarah Maurice chạy RT tác giả có PCR với marker yếu tố thiếu (glyceraldehyde - - p, Dex, AA b-Gl collagen Cuối cùng, để xác định týp I, bone sialoprotein, core binding tạo thành nguyên bào factor - a1, osteocalcin, Sarah xương in vitro, sử osteopontin); dụng nhiều cách khác Maurice sử dụng flow để đánh giá như: cytometry để đánh giá Smruti M Phadnis [8] tạo thành nguyên bào Karen Bieback sử dụng xương in vitro Có thể cách nhuộm alkaline dựng tng phng phỏp tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 85 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện qu©n y khác để đánh giá tế biệt Theo Sarah bào biệt hóa, nên Maurice, gen osteopontin sử dụng kết hợp nhiều xuất điều phương pháp để xác định kiện ni cấy, ngồi Dex, tạo thành nguyên bào AA b - Gl cần phải bổ xương mét cách sung thêm vitamin D3 xác Oscar K Lee FGF9 Nếu chạy RT - PCR điều kiện ni khơng có điều kiện biệt hóa có vitamin D3 FGF9, Dex, AA b - Gl Kết khơng xuất gen quả: RT - PCR cho gen osteopontin osteopontin Kết chạy RT - PCR cho gen osteocalcin dương tính osteocalcin xuất Tuy nhiên, Sarah điều kiện ni Maurice chạy RT - PCR cấy, ngồi Dex, AA b với gen osteopontin - Gl phải bổ sung vitamin osteocalcin cã khác D3 FGF9 S cú mt 86 tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y riêng lẻ vitamin D3 đồng thời vitamin D2 FGF9 không làm FGF9) Điều chứng xuất osteocalcin gen tỏ, nÕu có vitamin D Kết FGF9, không đủ nghiên cứu mạnh để kích thích hoạt gần giống với Sarah động gen osteocalcin Maurice Ở đây, chúng (một gen sử dụng vitamin D2 muộn tế bào xương), thay cho vitamin D3, có tham gia kết lại cho giống đồng thời yếu tố Gen osteopontin làm xuất xuất thí gen nghiệm (có bổ sung vitamin Chúng tơi sử dụng D2 vitamin D2 thay cho FGF9) Gen osteocalcin vitamin D3 để biệt hóa xuất thí TBG MCR thành nguyên nghiệm (có bổ sung bào xương in vitro tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 87 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y Vitamin D2 hồn tồn có Trần Văn Bé Nghiên thể sử dụng để thay cứu hoàn thiện kỹ thuật chiết tách TBG tạo máu vitamin D3 từ máu cuống rốn để điều KẾT LUẬN Chúng thiết lập qui trình thu nhận, phân lập, ni cấy biệt hóa TBG MCR thành nguyên bào xương in vitro để ứng trị bệnh lý máu Đề tài cấp sở, Sở Khoa học Công nghệ Môi trường, Sở Y tế TP HCM, 2004 Trần Văn Bé Tiêu dụng công nghệ tái chuẩn - kiểm tra chất lượng truyền máu tạo mô xương ghép huyết học Nhà xuất Y học, 1999 TÀI LIÖU THAM KHẢO Trần Minh Hiếu, Thi Nguyễn Lam, Hiền Lê Thị Diệu, Linh Đỗ Duy, 88 t¹p chí y - d-ợc học quân số 1-2009 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày trun thèng häc viƯn qu©n y Mật Bửu Thu thập, xử Thái Mai Duyên Thi lý, đông lạnh MCR Y Tình trạng nhiễm trùng học Việt Nam, 2002, 268 lấy MCR Y häc Việt Nam, 221 (2), tr (1), tr - Huỳnh Nghĩa Tình - hình thu thập, sàng lọc Nguyễn Thị Thủy, xử lý MCR Bệnh Thái Mai Duyên Thi viện Truyền máu - Huyết Khảo sát thể tích MCR học TP Hồ Chí Minh Y Tạp chí Y học Việt Nam, học Việt Nam, 2004, 299 1998, 221 (2), tr - (6), tr - 12 Smruti M Phadnis Huỳnh Nghĩa Xác Human umbilical cord định tối ưu tiêu chuẩn blood serum promotes người cho MCR Y học growth, proliferation, as Việt Nam, 2006, 322, tr well as differentiation of 28 - 34 human bone marow derived progenitor cells In t¹p chÝ y - d-ợc học quân số 1-2009 89 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống häc viƯn qu©n y vitro cell, 42, pp 283 - blood Stem Cells, 2004, 286 pp 625 - 634 Erices A., P Conget, J J Minguell Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood Br J haematol 2000, Apr, 109 (1), pp 235 - 242 10 Kern Karen Bieback, Susanne, Kluter Harald, Eichler Hermann Critical Parameters for Isolation the of Mesenchymal Stem Cells from 90 Umbilical cord t¹p chÝ y - d-ợc học quân số 1-2009 ... ưu điểm loại tế bào khác MCR dễ thu nhận, số như: nguyên bào xương lượng máu thu [9, 11], nguyên bào sụn nhiều [7], thu nhận [9], tế bào mỡ [9], máu không g? ?y ảnh nguyên bào sợi, nguyên hưởng đến... x? ?y dựng qui trình thu nhận, phân lập biệt hóa TBG từ máu cuống rốn người thành nguyên bào xương * Từ khóa: Máu cuống rốn; Tế bào gốc; Biệt hóa tạo xương; Osteopontin; Osteocalcin DIFFERENTIATion... c? ?y tế bào nguyờn bào sợi hình chiếm ưu Sau 14 MCR in vitro Tế bào sau phân lập ng? ?y nuôi (10X), tế bào hai phương pháp dạng giống nguyên bào nuôi môi sợi chiếm ưu trường IMDM có bổ với tế bào