Phỏt hin virut EBV trờn bnh nhõn ung th vũm hng bng phn ng PCR Lờ Thanh H*; Nguyn Lnh Ton* Nguyn ỡnh Phỳc**; Lờ Thanh Hũa*** Tóm tắt T bnh phm l mụ sinh thit ca 3 bnh nhõn (BN) c chn oỏn ung th vũm hng (UTVH), phỏt hin h gen EBV bng phn ng PCR. S dng k thut dũng húa v gii trỡnh t, ton b chui ARN thụng tin on gen LMP-1 ca EBV c xỏc nh trong c 3 mu bnh phm nghiờn cu. * T khoỏ: Ung th vũm mi hng; EBV; LMP-1. Detect Epsstein-Barr virus in patients with nasopharyngeal carcinoma by polymerase chain reaction Summary Genomic DNA from biopsy tissue of 3 patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC) was extracted. Using PCR, cloning and sequencing, the entire mRNA of the LMP-1 gene of EBV was detected. We detected EBV in biopsy tissue of these 3 patients. * Key words: Nasopharyngeal carcinoma; EBV; LMP-1. T VN đề Ung th vũm mi hng l mt loi khi u ỏc tớnh xut phỏt t lp biu mụ ph ca vựng vũm mi hng. Loi ung th ny c xp vo cỏc khi u biu mụ ca ng tiờu hoỏ v hụ hp trờn, l mt trong 5 loi ung th ph bin nht ngi Vit Nam v hay gp nht trong ung th vựng tai mi hng. Trờn th gii, cng hay gp cỏc nc vựng ụng Nam v phớa nam Trung Qu c [6]. V nguyờn nhõn ca bnh, cú rt nhiu gi thit, tp trung thnh ba nhúm ch yu ú l do virut Epstein-Barr, do di truyn v do cỏc yu t mụi trng, tp quỏn n ung, hoỏ cht. Trong thi gian gn õy, cú rt nhiu cụng trỡnh nghiờn cu ca cỏc tỏc gi trong v ngoi nc v mi liờn quan gia virut Epstein-Barr v ung th vũm mi hng. EBV l mt thnh viờn thuc nhúm herpesvirut týp 4 gõy nhim bnh trờn ngi [3]. Cu trỳc * Bệnh viện 103 ** Học viện Quân y *** Viện Công nghệ Sinh học Phản biện khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn h gen ca EBV l chui ADN xon kộp, mch h, kớch thc khong 172 kb. H gen ca EBV gm 6 t hp gen mó húa cho cỏc loi protein khỏng nguyờn, ký hiu l EBNA, ú l EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C v EBNA-LP v 3 t hp gen mó húa cho protein mng l LMP- 1, LMP-2A v LMP-2B [1, 5]. Nhiễm tiềm tàng EBV là khởi đầu sớm cho quá trình tiến triển ung thư [8]. Trong các protein có vai trò quan trọng đối với quá trình tiến triển thành UTVH ở giai đoạn sớm, LMP-1 là một loại đặc biệt do protein này có khả năng gây ung thư thực nghiệm trên chuột và LMP-1 cũng có khả năng gây ra nhiều kiểu biến đổi kiểu hình tế bào lympho B và tế bào biểu mô khác [2]. Một bằng chứng quan trọng chứng minh vai trò của LMP-1 trong quá trình tiến tri ển UTVH là protein LMP-1 biểu hiện và tìm thấy trong 78% số mẫu mô bệnh nhân UTVH. Sản phẩm ARN thông tin của LMP-1 là kết quả ghép-nối (splicing) của 3 chuỗi exon, chịu trách nhiệm tổng hợp protein màng có phân tử lượng là 63 kDa. LMP-1 có mức độ biến đổi cấu trúc rất cao giữa các chủng, đặc biệt ở vùng gen của exon 3 tại đầu 3’, trong đó có những chủng EBV phân lập ở Việt Nam [4, 7]. Trong nghiên cứu này sử dụng phản ứng PCR, k ỹ thuật dòng hóa và giải trình tự để xác định sự tồn tại đoạn gen LMP-1 của EBV trong mẫu mô sinh thiết của 3 BN được chẩn đoán xác định là UTVH. ĐèI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP nghiªn cøu 1. Đối tượng nghiên cứu. Mẫu mô sinh thiết của BN UTVH tại Bệnh viện Tai Mũi Họng TW được sử dụng để tách ADN tổng số, bao gồm cả hệ gen của virut. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Phản ứng PCR: Phản ứng PCR được thực hiện dùng cặp mồi do chúng tôi thiết kế như sau: LMP1F (mồi xuôi): 5’-ATGGAACGCGACCTTGAGAG-3’ LMP1R (mồi ngược): 5’-TTAGTCATAGTAGCTTAGCTGAAC-3’ Sản phẩm của toàn bộ gen LMP-1 có kích thước 1,3 - 1,35 kb, thay đổi tuỳ từng chủng. Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: nhiÖt ®é thêi gian sè chu kú 94 0 C 5 phút 1 94 0 C 1 phút 55 0 C 1 phút 72 0 C 2 phút 35 72 0 C 10 phút 1 4 0 C Nhiệt độ bảo quản tạm thời sản phẩm * Dòng hóa và giải trình trình tự: Sản phẩm đoạn gen LMP-1 của EBV, sau khi tinh sạch, dòng hoá vào plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen Inc.). Chọn lọc và tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp theo quy trình của hãng Bioneer (Hàn Quốc). Trình tự nucleotid ADN của plasmid tái tổ hợp mang gen LMP-1 được giải trình trên máy tự động ABI-3100 Genetic Analyzer. Phân tích chuỗi nucleotid bằng các chương trình SeqEd1.03, AssemblyLIGN1.9, MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) và so sánh đối chiếu bằng chương trình GENEDOC 2.6.002 (http:// www.nrbsc.org/gfx/genedoc/). 28 KÕT QUẢ nghiªn cøu VÀ BµN LUẬN 1. Kết quả thực hiện PCR, dòng hoá sản phẩm và tách dòng. Bằng cặp mồi LMP1F-LMP1R, sản phẩm PCR thu được có kích thước dự kiến khoảng 1.300 bp. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% trình bày ở hình 1 cho thấy đoạn ADN của EBV có độ dài khoảng 1.300 bp. Như vậy, hệ gen của EBV đã được tách từ mô sinh thiết của BN UTVH và sau khi thực hiện PCR đã cho sản phẩm ADN có chất l ượng và kích thước phù hợp. Hình 1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên thạch agarose 0,8%. M: Thang chuẩn ADN. Đường chạy 1 - 3: sản phẩm PCR 3 mẫu ADN lần lượt của BN 1, 2, 3. Kiểm tra sản phẩm dòng hóa bằng điện di trên thạch agarose 0,8% (hình 2). Khi cắt ADN plasmid tái tổ hợp có chứa sản phẩm PCR (gen LMP-1) đã cho 2 băng ADN: 3,9 kb của vector và khoảng 1.300 bp của gen LMP-1 đang nghiên cứu. M 1 2 3 H×nh 2: Kết quả t¸ch dßng đoạn gen LMP-1 EBV trên thạch agarose 0,8%. M: Thang chuẩn AND. Đường chạy 1 - 3: sản phẩm tách dòng 3 mẫu ADN lần lượt của BN 1, 2, 3. 2. Kết quả giải trình tự gen LMP-1. Đoạn ADN thu được gọi là khung gen của LPM-1, kích thước khoảng 1,3 kb, chính xác hơn sau khi phân tích là 1.268 bp, bao gồm 3 exon và 2 intron, có cấu trúc giống như tất cả các khung gen LMP-1 của các chủng trên thế giới [4]. 30 60 90 120 A TGGAACGCGACCTTGAGAGGGGCCCACCGGGCCCGCCACGGCCCCCTCTAGGACCCCCCCTCTCCTCTTCCATAGGCCTTGCTCTCCTTCTCCTGCTCTTGGCGCTACTGTTCTGGCTG M E R D L E R G P P G P P R P P L G P P L S S S I G L A L L L L L L A L L F W L> _ _________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 150 180 210 240 TATATCATTATGAGTGACTGGGCTGGAGGAGCGCTCCTTGTCCTCTATGCCTTTGCTCTAATGCTTATTATTATCATTCTGATCATCTTTATCTTCAGAAGAGACCTTCTCTGTCCACTT Y I I M S D W A G G A L L V L Y A F A L M L I I I I L I I F I F R R D L L C P L> _ _________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 270 300 330 360 GGAGGTTTTGGTCTACTCCTACTGATGATCACCCTCCTGCTCATCGCTCTTTGGAATTTGCACGGACAGGCATTGTACCTTGGAATTGTGCTGCTCATCTTCGGCTGCTTACTTGTCTTA G G F G L L L L M I T L L L I A L W N L H G Q A L Y L G I V L L I F G C L L V L> _ _________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 390 420 450 480 GGTCTCTGGATCTACTTCTTGGAGATTCTCTGGCGGCTTGGTGCCACCATCTGGCAGCTTTTGGCCTTCATCCTAGCCTTCTTCCTAGACATCATCCTGCTTATTATTACTCTCTATCTA G L W I Y F L E I L W R L G A T I W Q L L A F I L A F F L D I I L L I I T L Y L> _ ______________________________________________ _ __EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 510 540 570 600 CAACAAAACTGGTGGACTCTATTGGTTGATCTCCTTTGGCTCCTCCTGTTTCTGGCCATTTTAATCTGGATGTATTACCATGGACAACGACACACTGATGAACACCACCACGATGACTCC Q Q N W W T L L V D L L W L L L F L A I L I W M Y Y H G Q R H T D E H H H D D S> _ _________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 630 660 690 720 CTCCCGCACCCTCAACAAGCTACCGACGATTCTAGCCATGAATCTGACTCTAACTCCAACGAGGGCAGACACCACCTGCTCGTAACTGGAGGCGCCGACGGACCCCCACTCTGCTCTCAA L P H P Q Q A T D D S S H E S D S N S N E G R H H L L V T G G A D G P P L C S Q> _ _________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 750 780 810 840 A ACCTACGCGCACCTGGATGTGGTCCTGACAATGGCCCACAGGACCCTGACAACACTGATGCCAATGGCCCACAGGACCCTGACAACACTGATGACAATGGCCCACAGGACCCTGACACC N L R A P G C G P D N G P Q D P D N T D A N G P Q D P D N T D D N G P Q D P D T> EBVS7- V N-mRNA > 30 60 90 120 A TGGAACGCGACCTTGAGAGGGGCCCACCGGGCCCGCCACGGCCCCCTCTAGGACCCCCCCTCTCCTCTTCCATAGGCCTTGCTCTCCTTCTCCTGCTCTTGGCGCTACTGTTCTGGCTG M E R D L E R G P P G P P R P P L G P P L S S S I G L A L L L L L L A L L F W L> _ _________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 150 180 210 240 TATATCATTATGAGTGACTGGGCTGGAGGAGCGCTCCTTGTCCTCTATGCCTTTGCTCTAATGCTTATTATTATCATTCTGATCATCTTTATCTTCAGAAGAGACCTTCTCTGTCCACTT Y I I M S D W A G G A L L V L Y A F A L M L I I I I L I I F I F R R D L L C P L> _ _________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 270 300 330 360 GGAGGTTTTGGTCTACTCCTACTGATGATCACCCTCCTGCTCATCGCTCTTTGGAATTTGCACGGACAGGCATTGTACCTTGGAATTGTGCTGCTCATCTTCGGCTGCTTACTTGTCTTA G G F G L L L L M I T L L L I A L W N L H G Q A L Y L G I V L L I F G C L L V L> _ _________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 390 420 450 480 GGTCTCTGGATCTACTTCTTGGAGATTCTCTGGCGGCTTGGTGCCACCATCTGGCAGCTTTTGGCCTTCATCCTAGCCTTCTTCCTAGACATCATCCTGCTTATTATTACTCTCTATCTA G L W I Y F L E I L W R L G A T I W Q L L A F I L A F F L D I I L L I I T L Y L> _ ______________________________________________ _ __EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 510 540 570 600 CAACAAAACTGGTGGACTCTATTGGTTGATCTCCTTTGGCTCCTCCTGTTTCTGGCCATTTTAATCTGGATGTATTACCATGGACAACGACACACTGATGAACACCACCACGATGACTCC Q Q N W W T L L V D L L W L L L F L A I L I W M Y Y H G Q R H T D E H H H D D S> _ _________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 630 660 690 720 CTCCCGCACCCTCAACAAGCTACCGACGATTCTAGCCATGAATCTGACTCTAACTCCAACGAGGGCAGACACCACCTGCTCGTAACTGGAGGCGCCGACGGACCCCCACTCTGCTCTCAA L P H P Q Q A T D D S S H E S D S N S N E G R H H L L V T G G A D G P P L C S Q> _ _________________________________________________EBVS7-VN-mRNA_________________________________________________________> 750 780 810 840 A ACCTACGCGCACCTGGATGTGGTCCTGACAATGGCCCACAGGACCCTGACAACACTGATGCCAATGGCCCACAGGACCCTGACAACACTGATGACAATGGCCCACAGGACCCTGACACC N L R A P G C G P D N G P Q D P D N T D A N G P Q D P D N T D D N G P Q D P D T> EBVS7- V N-mRNA > 0.5kb 2.3kb 9.4kb 23.0kb 4.3kb 6.5kb 2.0kb M 1 2 3 0.5k 2.3k 2.0k 4.3k 6.5k 9.4k 23.0k Hình 3: Trình tự mARN gen LMP-1 của EBV (1.116 bp). Mũi tên chỉ dẫn vị trí ghép nối giữa exon 1 và 2, giữa exon 2 và 3 để tạo nên mARN hoàn chỉnh. Sau khi bỏ 2 intron, chúng tôi thu được chuỗi nucleotid ARN thông tin của 1 chuỗi gen có độ dài 1.113 bp. Kết quả giải trình tự và sắp xếp nulceotid và acid amin của gen LMP-1 của một chuỗi (hình 3). KÕT LUẬN Sử dụng cặp mồi LMP1F-LMP1R, chúng tôi đã thực hiện thành công phản ứng PCR 3 mẫu ADN tách chiết từ mô sinh thiết của 3 BN được chẩn đoán UTVH. Sản phẩm thu được đã dòng hóa và giải trình tự gen, phân tích kết quả cho thấy đây chính là đoạn gen LMP-1 của EBV. Kết quả cuối cùng cho thấy trong cả 3 mẫu sinh thiết của 3 BN UTVH đều có tồn tại EBV. Như vậy, có thể sử dụng quy trình trong nghiên cứu này để phát hiện EBV ở BN UTVH. 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Đình Phúc và Lê Thanh Hòa. Virut Epstein-Barr gây ung thư vòm mũi họng và một số phương pháp hiện đại ứng dụng trong chẩn đoán. Tổng quan. Tạp chí Công nghệ Sinh học. 2008, 6 (2), tr.1-18. 2. Cohen JI. Virology and molecular biology of Epstein-Barr virus. In Epstein-Barr virus. Edited by Tselis A and Jenson HB. Taylor and Francis Group LLC, New York NY.2006, pp.21-37. 3. Kaye KM, Izumi KM, Kieff E. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 is essential for B- lymphocyte growth transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1993, 90 (19), pp.9150-9154. 4. Middeldorp JM, Brink AA, van den Brule AJ, Meijer CJ. Pathogenic roles for Epstein-Barr virus (EBV) gene products in EBV-associated proliferative disorders. Crit Rev Oncol Hematol. 2003, 4 (1), pp.1-36. 5. Miller WE, Edwards RH, Walling DM and Raab-Traub N. Sequence variation in the Epstein-Barr virus latent membrane protein 1. J Gen Virol. 1994, 75 (10), pp.2729-2740. 6. Murray PG and Young LS. Epstein-Barr virus infection: basis of malignancy and potential for therapy. Expert Rev Mol Med. 2001, 3 (28), pp.1-20. 7. Nguyen-Van D, Ernberg I, Phan-Thi Phi P, Tran-Thi C, Hu L. Epstein-Barr virus genetic variation in Vietnamese patients with nasopharyngeal carcinoma: full-length analysis of LMP1. Virus Genes. 2008, 37 (2), pp.273-281. 8. Pathmanathan R, Prasad U, Sadler R, Flynn K, Raab-Traub N. Clonal proliferations of cells infected with Epstein-Barr virus in preinvasive lesions related to nasopharyngeal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 1995, 333, pp.693-698. . BN UTVH. 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Đình Phúc và Lê Thanh Hòa. Virut Epstein-Barr g y ung thư vòm mũi họng và một số phương pháp hiện đại ứng dụng trong chẩn đoán. Tổng quan. Tạp chí. của BN UTVH tại Bệnh viện Tai Mũi Họng TW được sử dụng để tách ADN tổng số, bao gồm cả hệ gen của virut. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Phản ứng PCR: Phản ứng PCR được thực hiện dùng cặp. gen LMP-1 của EBV. Kết quả cuối cùng cho th y trong cả 3 mẫu sinh thiết của 3 BN UTVH đều có tồn tại EBV. Như v y, có thể sử dụng quy trình trong nghiên cứu n y để phát hiện EBV ở BN UTVH.