ĐỀ TÀI : Phân tích acid amin bằng ĐỀ TÀI : Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký phương pháp sắc ký TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ KHOA CƠ KHÍ CÔNG NGHỆ GVHD : PHẠM TRẦN THÙY HƯƠNG NHÓM :2.5 A.ĐẶT VẤN ĐỀ A.ĐẶT VẤN ĐỀ Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protei protei n là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất n là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl và ít nhất một nhóm amino một nhóm carboxyl và ít nhất một nhóm amino trừ prolin chỉ có nhóm NH(thực chất là một acid trừ prolin chỉ có nhóm NH(thực chất là một acid imin). imin). Có khoảng hơn 20 loại amino acid khác nhau, Có khoảng hơn 20 loại amino acid khác nhau, do đó việc phân tích chúng để do đó việc phân tích chúng để xác định thành xác định thành phần axit amin hoặc phần axit amin hoặc hàm lượng hàm lượng của các protein, của các protein, peptide, và các chế phẩm dược phẩm khác peptide, và các chế phẩm dược phẩm khác rất rất cần thiết. cần thiết. B.NỘI DUNG B.NỘI DUNG I.Xử lý mẫu- Tạo dẫn xuất I.Xử lý mẫu- Tạo dẫn xuất 1. Thủy phân protien,peptide 1. Thủy phân protien,peptide Có nhiều cách thủy phân : bằng axit, kiềm, enzim tùy Có nhiều cách thủy phân : bằng axit, kiềm, enzim tùy vào loại thực phẩm và thành phần của protien. vào loại thực phẩm và thành phần của protien. Thứ tự thủy phân : Thứ tự thủy phân : +Đốt nóng lò ở 105 ÷ 112 +Đốt nóng lò ở 105 ÷ 112 o o C khoảng 20 -30 phút C khoảng 20 -30 phút trước khi thủy phân trước khi thủy phân +Cân mẫu và làm giàu protein (tùy vào loại thực +Cân mẫu và làm giàu protein (tùy vào loại thực phẩm) phẩm) +Dùng tác nhân để thủy phân (như HCl phải có +Dùng tác nhân để thủy phân (như HCl phải có phenol để ngăn cản halogel hóa của tyrosin ) phenol để ngăn cản halogel hóa của tyrosin ) 2. 2. Tạo dẫn xuất: Tạo dẫn xuất:  Tăng độ nhạy trong quá trình phân tích người ta thường Tăng độ nhạy trong quá trình phân tích người ta thường tạo dẫn xuất acid amin, trong đó có các axit amin phản tạo dẫn xuất acid amin, trong đó có các axit amin phản ứng với một tiền chất để mang lại khả năng hấp thụ mạnh ứng với một tiền chất để mang lại khả năng hấp thụ mạnh tia UV/Vis hoặc một tạo một hợp chất huỳnh quang. tia UV/Vis hoặc một tạo một hợp chất huỳnh quang. Có nhiều chất để tạo dẫn xuất với protien như: Có nhiều chất để tạo dẫn xuất với protien như:  o-phthalaldehyde (OPA), Phenylisothiocyanate (PITC), o-phthalaldehyde (OPA), Phenylisothiocyanate (PITC), carbamate 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl (AQC) Ứng với mỗi dẫn xuất thì chọn detector có bước (AQC) Ứng với mỗi dẫn xuất thì chọn detector có bước sóng khác nhau. sóng khác nhau.  Việc tạo dẫn xuất phải thực hiện qua nhiều bước. Việc tạo dẫn xuất phải thực hiện qua nhiều bước.  Quy trình sấy khô Quy trình sấy khô  Chuẩn bị hóa chất,dung dịch dùng sấy khô lại Chuẩn bị hóa chất,dung dịch dùng sấy khô lại  Cho vào bình định mức Cho vào bình định mức  Tiến hành sấy khô hút chân không cho đến khô Tiến hành sấy khô hút chân không cho đến khô  Chuẩn bị dung dich dẫn xuất Chuẩn bị dung dich dẫn xuất Chuẩn bị hỗn hợp theo tỉ lệ các chất tùy vào phương Chuẩn bị hỗn hợp theo tỉ lệ các chất tùy vào phương pháp dẫn xuất pháp dẫn xuất  Tạo dẫn xuất Tạo dẫn xuất - Rút 20µl hỗn hợp dung dịch tạo dẫn xuất mới pha ở - Rút 20µl hỗn hợp dung dịch tạo dẫn xuất mới pha ở trên, cho vào mỗi ống mẫu đã sấy khô trên, cho vào mỗi ống mẫu đã sấy khô - Lắc vài giây - Lắc vài giây - Để yên 20 phút ở nhiệt độ 20-25oC - Để yên 20 phút ở nhiệt độ 20-25oC - Sấy khô - Sấy khô a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA  o-phthalaldehyde hoặc ortho- o-phthalaldehyde hoặc ortho- phthalaldehyde (OPA) là các hợp phthalaldehyde (OPA) là các hợp chất hóa học với công thức C chất hóa học với công thức C 6 6 H H 4 4 (CHO) (CHO) 2 2 . .  Thường được viết tắt OPA, phân tử Thường được viết tắt OPA, phân tử này là một dialdehyde bao gồm hai này là một dialdehyde bao gồm hai nhóm formyl (CHO) gắn liền kề trên nhóm formyl (CHO) gắn liền kề trên một vòng benzene. Là chất rắn màu một vòng benzene. Là chất rắn màu vàng nhạt được dùng trong việc tổng vàng nhạt được dùng trong việc tổng hợp các hợp chất dị vòng và là một hợp các hợp chất dị vòng và là một thuốc thử trong phân tích của các thuốc thử trong phân tích của các acid amin. acid amin. OPA OPA a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA  Ortho-phthalaldehyde Ortho-phthalaldehyde (OPA) được hòa tan và ổn định (OPA) được hòa tan và ổn định trong dung dịch nước ở pH <11,5. Nó nhạy cảm với tia trong dung dịch nước ở pH <11,5. Nó nhạy cảm với tia cực tím và oxy không khí. cực tím và oxy không khí.  o-phthalaldehyde (OPA) phản ứng với các acid amin o-phthalaldehyde (OPA) phản ứng với các acid amin trong với sự có mặt của các hợp chất thiol, hình thành trong với sự có mặt của các hợp chất thiol, hình thành các sản phẩm huỳnh quang. Phản ứng này được sử các sản phẩm huỳnh quang. Phản ứng này được sử dụng cho việc tạo các dẫn xuất trong phân tích của các dụng cho việc tạo các dẫn xuất trong phân tích của các axit amin bằng sắc ký trao đổi ion. axit amin bằng sắc ký trao đổi ion. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Có 2 phương pháp tạo dẫn xuất OPA: tạo dẫn xuất tiền cột Có 2 phương pháp tạo dẫn xuất OPA: tạo dẫn xuất tiền cột (Precolumn derivatization) và tạo dẫn xuất sau cột (derivatization (Precolumn derivatization) và tạo dẫn xuất sau cột (derivatization postcolumn). postcolumn). Dẫn xuất tiền cột:  Nguyên tắc chung tạo Precolumn derivatization là tạo dẫn xuất của các axit amin với o- phthalaldehyde (OPA), tiếp theo là tách HPLC ngược pha, các sắc ký lỏng được trang bị một máy dò fluorometric để phát hiện các dẫn xuất acid amin. Cường độ huỳnh quang của phức OPA- acid amin được theo dõi với bước sóng kích thích 348 nm và bước sóng phát xạ 450 nm. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Dẫn xuất tiền cột:  o-phthalaldehyde (OPA) phản ứng với các acid amin với sự có mặt của hợp chất thiol để hình thành các sản phẩm huỳnh quang. N-acetyl-L- cysteine và 2 -mercaptoethanol có thể được sử dụng như là các thiol.  OPA tự nó không phát huỳnh quang và do đó không ảnh hưởng đến kết quả phân tích. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Dẫn xuất tiền cột:  Độ hòa tan và độ ổn định của nó trong dung dịch nước Độ hòa tan và độ ổn định của nó trong dung dịch nước cùng với tốc độ phản ứng nhanh nên có thể tạo dẫn cùng với tốc độ phản ứng nhanh nên có thể tạo dẫn xuất tự động và phân tích bằng cách sử dụng một máy xuất tự động và phân tích bằng cách sử dụng một máy lấy mẫu tự động, dẫn xuất này có độ nhạy rất cao, giới lấy mẫu tự động, dẫn xuất này có độ nhạy rất cao, giới hạn phát hiện tối thiểu là 50 fmol (10 hạn phát hiện tối thiểu là 50 fmol (10 -15 -15 mol) mol)  Tuy nhiên, vì không có khả năng phản ứng với acid Tuy nhiên, vì không có khả năng phản ứng với acid amin thứ cấp nên làm hạn chế ưu thế của phương pháp amin thứ cấp nên làm hạn chế ưu thế của phương pháp tạo dẫn xuất này. Phương pháp này không phân tích tạo dẫn xuất này. Phương pháp này không phân tích được các acid amin thứ cấp (ví dụ như proline). được các acid amin thứ cấp (ví dụ như proline). [...]... lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC) 5 Xử lý kết quả:  Công thức tính kết quả: Hàm lượng mỗi axit amin trong mẫu phân tích được tính bằng số mg có trong 1g mẫu bằng công thức: S M CV 1000 A= SC M II Định lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC) 5 Xử lý kết quả:  Với: A – nồng độ axit amin i trong mẫu, mg/g  SM – diện tích peak axit amin i trên sắc ký đồ của mẫu... trường hợp tạo dẫn xuất tiền cột vì sự chuẩn bị mẫu và tạo dẫn xuất yêu cầu thời gian dài II Định lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC) Nguyên tắc của phương pháp: • HPLC là phương pháp sắc ký được phát triển dựa trên phương pháp ghi sắc ký cột, các chất phân tích khi qua cột sắc ký do có ái lực khác nhau với pha động( dung môi) và pha tĩnh (các hạt nhồi trong cột) mà chúng ra khỏi... tích acid amin trở nên thuận lợi và có độ chính xác rất cao Cùng với sụ ra đời của các thiết bị sắc kí với nhiều ưu điểm nổi bật về tốc độ phân tích và độ chính xác, phương pháp phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký đặc biệt là sắc ký lỏng cao áp đã đem lại hiệu quả rất lớn mà các phương pháp phân tích thông thường không đáp ứng được ... đồ của mẫu  SC - diện tích peak axit amin i trên sắc ký đồ của chuẩn  C – nồng độ axit amin chuẩn i tính theo đường chuẩn  V – tổng thể tích định mức mẫu  M – Khối lượng mẫu thực phẩm dùng để phân tích axit amin, g C Kết luận  Việc phân tích acid amin rất phổ biển trong mọi lĩnh vực, trong y học, thực phẩm, nghiên cứu…với việc tạo ra các dẫn xuất đã góp phần phân tích acid amin trở nên thuận lợi... cho máy sắc kí: nhiệt độ, vận tốc dòng, bước sóng của đầu dò  Khởi động máy và tiến hành chạy sắc ký, sau đó xử lý số liệu và tính toán kết qủa II Định lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC) 5 Xử lý kết quả:  Xem và so sánh sắc ký đồ của chuẩn và mẫu  Thông số thời gian  Diện tích peak  Chiều cao peak trên sắc ký đồ  Nhận dạng peak và thứ tự các axit amin trên sắc ký đồ ... ) II Định lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC) 3 Dụng cụ hóa chất       Dung dịch HCL 6M có bổ sung phenol 1% (10 μl phenol cho vào 1 ml hcl Bình khí nitơ Chất tạo dẫn xuất như Phenylisothiocyanate ( PITC) , Triethylamine (TEA) Ethanol loại dùng cho HPLC Nước cất lần 2 Dụng cụ và thiết bị hỗ trợ cho sắc ký II Định lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)... ghi sắc ký dưới tác dụng của trọng lực, người ta đặt lên dung môi áp suất khoảng 400at để sự dịch chuyển xảy ra nhanh hơn • Phương pháp này cho phép chúng ta sử dụng các hạt có kích thước nhỏ trong cột hấp phụ và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha tĩnh và các phân tử chất phân tích đi qua nó Điều này sẽ tăng cường khả năng phân tích các chất có trong hỗn hợp II Định lượng axit amin bằng phương pháp sắc. .. dẫn xuất tiền cột thì dẫn xuất này có độ nhạy thấp hơn tuy nhiên ưu điểm là có thể phân tích được acid amin thứ cấp b Phương pháp tạo dẫn xuất NBD-F  Nguyên tắc chung tạo dẫn xuất NBD-F là phản ứng của các acid amin với 7fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1.3-diazole (NBD-F), NBD-F phản ứng với các acid amin kể cả các acid amin thứ cấp để tạo thành sản phẩm cao huỳnh quang, tiếp theo là tách HPLC pha đảo... b Phương pháp tạo dẫn xuất NBD-F  Các điều kiện tốt nhất cho phản ứng tạo dẫn xuất là ở nhiệt độ 60oC và môi trường kiềm trong 5 phút, sau đó dùng acid HCl bổ sung vào hỗn hợp để hạn chế ảnh hưởng của chất chất nền huỳnh quang  Ưu điểm: Độ nhạy của phương pháp này gần với phương pháp tạo dẫn xuất tiền cột OPA nhưng có ưu điểm hơn là phản ứng được với acid amin thứ cấp  Giới hạn phát hiện của phương. .. trình oxy hóa bằng hypochlorite natri cho phép các amin thứ cấp phản ứng với OPA a Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Dẫn xuất sau cột  Cường độ huỳnh quang của phức OPA- acid amin được đo với một bước sóng kích thích 348 nm và phát xạ bước sóng 450 nm vì vậy khi tiến hành phân tích dùng đầu dò huỳnh quang 348nm  Giới hạn phát hiện tối thiểu khoảng một vài chục pmol cho hầu hết các dẫn xuất acid amin, tuyến . ĐỀ TÀI : Phân tích acid amin bằng ĐỀ TÀI : Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký phương pháp sắc ký TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ KHOA CƠ KHÍ CÔNG. axit amin bằng phương II. Định lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC) pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC) • HPLC là phương pháp sắc ký được phát triển dựa trên phương HPLC là phương. HPLC là phương pháp sắc ký được phát triển dựa trên phương pháp ghi sắc ký cột, các chất phân tích khi qua cột sắc ký do pháp ghi sắc ký cột, các chất phân tích khi qua cột sắc ký do có ái lực