Chương 4: ENZYME SỬ DỤNG TRONG KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Tóm tắt: Enzyme là những protein hoạt tính sinh học vả dựa vào loại phản ứng xúc tác mà trong sinh học phân tử có thể chia enzyme thành 6 nhóm khác nhau. Trong đó các nhóm enzyme giới hạn, enzyme polimerase, enzyme nối, các enzyme nuclease được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực của sinh học phân tử và kĩ thuật di truyền. Enzyme được sử dụng trong các kĩ thuật sinh học phân tử như RFLP, PCR, tách dòng phân tử Nội dung của chương gồm 3 vấn đề cơ bản: (1). Enzyme giới hạn, (2). các nhóm enzyme khác; (3). Enzyme nuctease. Hệ thống enzyme có thể chia thành 6 nhóm tuỳ theo loại hình phản ứng mà các enzyme này xúc tác. Nhóm enzyme nuclease có tác dụng cắt và phá huỷ ADN, nhóm ADN-ligase có chức năng nối các trình tự ADN lại. nhóm enzyme ADN-polimerase tham gia tổng hợp chuỗi polinucleotit, nhóm enzyme ADN- polimerase sửa chữa có chức năng sửa chữa những sai sót trong phân tử ADN, nhóm enzyme topoisommerase tác dụng mở xoắn ADN, nhóm enzyme phiên mã ngược reverse-transcriptase xúc tác cho quá trình phiên mã ngược từ ARN thành cADN. Các nhóm enzyme trên có vai trò hết sức quan trọng trong các thao tác với ADN và trong công nghệ ADN tái tổ hợp. Trong số đó có các nhóm enzyme giới hạn, enzyme sửa chữa ADN, ADN-polimease, ADN-ligase §1. ENYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME HOẶC ENZYME CẮT HẠN CHẾ (RESTRICTION ENDONUCLEASE - RE) 1.1. Khái niệm Nhóm enzyme nuclease gồm DN-ase và RN-ase có khả năng bẻ gãy liên kết phosphodiester kết quả là phân huỷ phân tử ADN hoặc ARN. Nhóm enzyme ADN-ase gồm 2 loại: Exonuclease (enzyme cắt ADN ngoại bào) có tác dụng cắt từng cặp nucleotit từ hai đầu của đoạn ADN đi dần vào bên trong (hình 4.1). Enzyme exonuclease có thể cắt tỉa từng cặp nucleotit ở cả hai mạch (cắt kép) hoặc cắt từng nucleotit trên một sợi ADN (cắt đơn). Endonuclease (enzyme cắt ADN nội bào) có tác dụng cắt rời ADN tại những vùng xác định gồm vài cặp nucleotit nằm cạnh nhau định vị trong phân tử ADN, tạo thành những phân đoạn ADN nhỏ hơn. Enzyme endonuclease có thể cắt đơn 50 hoặc cắt kép (hình 4.1). Hình 4.1. Đặc điểm cắt của exonuclease và endonuclease Một loại enzyme endonuclease có thể nhận biết vị trí nhất định bên trong phân tử ADN và cắt đặc hiệu, cắt một lần tại một điểm đó. Những kết luận trên đã được phát hiện trong thập kỉ 60 của thế kỉ XX. Trong những thí nghiệm ở vi khuẩn người ta đã phát hiện một nhóm các enzyme có thể nhận biết và phân cắt phân tử ADN của phagơ khi ADN ngoại lai này bảo vệ tế bào chủ xâm nhập. Các enzyme này bảo vệ tế bào chủ khỏi bị nhiễm phagơ - đó là các enzyme giới hạn. Enzyme cắt hạn chế (enzyme giới hạn) là loại enzyme nuclease có khả năng nhận biết được điểm cắt và cắt tại điểm xác định. Tuy nhiên vấn đề đặt ra là, liệu enzyme giới hạn cắt ADN của chính tế bào chủ? Những nghiên cứu cho thấy các enzyme giới hạn phân huỷ bất kì ADN ngoại lai nào xâm nhập vào tế bào; trong tế bào hệ thống enzyme sửa đổi (methylase) sửa đổi ADN tế bào chủ bằng cách methyl hoá các bazơ xác định của đoạn trình tự nhận biết, nhờ vậy ngăn cản enzyme giới hạn cắt vào ADN của tế bào chủ. Những enzyme này là đại diện của một trong các nhóm enzyme quan trọng nhất 51 dùng trong thao tác ADN. 1.2. Các nhóm enzyme giới hạn Các enzyme giới hạn có ba nhóm I, II, III và các enzyme giới hạn được dùng phổ biến ngày nay thuộc nhóm II. Enzyme giới hạn nhóm II có cơ chế tác động đơn giản nhất, chúng là các nuclease, và vì chúng cắt tại một vị trí nằm bên trong sợi ADN và không phân huỷ ADN từ hai đầu, nên gọi là endonuclease. Bảng 4.1. Đặc điểm của các loại enzyme giới hạn Đặc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Điểm cắt Xa điểm nhận biết hơn 1000 bp Nằm trong điểm nhận biết Nằm ngoài điểm nhận biết nhận biết Khả năng methy hóa gốc Adenine Có Không Có Điều kiện để cắt ATP,Mg ++ , Mg ++ S-AdoMet Mg ++ hoặc Mn ++ Mg ++ , S-AdoMet Cấu trúc của enzyme (số chuỗi polipeptide) Khác nhau Giống nhau Khác nhau Hình 4.2. Quá trình methyl hoá bởi enzyme methylase Cách gọi tên các enzyme giới hạn dựa trên các quy ước quốc tế. Tên chi và tên loài của sinh vật, mà ở đó tìm thấy enzyme, được dùng để đặt cho phần 52 đầu của tên enzyme, phần đó gồm chữ thứ nhất của tên chi và hai chữ đầu của tên loài. Chẳng hạn enzyme tách chiết được từ một nòi của Escherichia coli thì đặt tên là Eco, còn enzyme tách từ Bacillus amiloliquefaciens thì gọi là Bam Hai loại enzyme được sử dụng rộng rãi được tách ra từ các vi khuẩn nói trên là EcoRI và BamHI. Ví dụ: EcoRI: RE tách từ vi khuẩn E. coli, dòng R, nhóm I. HindIII: RE tách từ vi khuẩn Heamophilus influenzae, dòng d, nhóm III. Enzyme giới hạn có tính đặc hiệu, mỗi enzyme cụ thể nhận biết một đoạn trình tự đặc thù các bazơ trên ADN, đoạn nhận biết phổ biến nhất có chiều dài từ 4 - 6 bp. Nếu một trình tự ADN có 4 bp thì cứ 4 4 = 256 bp lặp lại một lần, trình tự có 5 bp thì cứ 4 5 = 1024 bp lặp lại, trình tự có 6 bp thì cứ 4 6 = 4096 bp mới lặp lại. Chẳng hạn, một enzyme nhận biết trình tự có 4 bp sẽ tạo ra đoạn ngắn hơn so với trình tự có 6 bp. Loại hình của các đoạn ADN do một enzyme cụ thể tạo ra tuỳ thuộc vào trình tự nhận biết và vào vị trí của điểm cắt trong trình tự này. Như chúng ta đã thấy, chiều dài của đoạn này phụ thuộc vào tần số lặp lại của trình tự nhận biết. Điểm cắt thực tế của enzyme quyết định hình dạng của đầu bị cắt. Hình dạng này rất quan trọng đối với việc thao tác tiếp ADN. Có hai kiểu hình dạng các đoạn có thể sinh ra: (1) Các đoạn đầu bằng (blunt ends); (2) Các đoạn đầu dính (so le) với 2 kiểu: đoạn có đầu 3' nhô ra; và đoạn có đầu 5' nhô ra. Hình 4.3. Các kiểu cắt của RE nhóm II Các enzyme như PstI và EcoRI tạo ra các đoạn ADN có đầu dính, chúng có thể bắt cặp bazơ với trình tự bổ sung cũng do chính enzyme đó tạo ra. Như vậy, bằng cách cắt hai mẫu ADN khác nhau bởi cùng một enzyme và trộn các 53 đoạn đó với nhau có thể tạo ra ADN tái tổ hợp. Bằng cách này các đoạn ADN nguồn khác nhau có thể nối lại với nhau nếu chúng có các đầu dính do enzyme giới hạn sinh ra. Khi các vùng bổ trợ ghép với nhau thì bộ khung photphodiester được gắn lại bằng ADN ligase. Trong thực nghiệm, người ta trộn một lượng thích hợp enzyme với ADN caanf nghiên cứu trong dung dịch đệm, cho phản ứng diễn ra ở 37 0 C. Hoạt tính enzymc được do bằng đơn vị tương đương với lượng enzyme cần thiết để một microgam ADN trong một giờ ở 37 0 C. 1.3. Lập bản đồ cắt giới hạn Phần lớn các đoạn ADN đều có các điểm nhận biết đối với nhiều enzyme giới hạn khác nhauvà nếu biết được vị trí tương đối của một số điểm này thì có thể lập được bản đồ các điểm giới hạn. Trong kĩ thuật này, người ta sử dụng các enzyme giới hạn để cắt một đoạn ADN, sau đó điện di trên agrose, chụp ảnh phân tích được kích thước các đoạn ADN bị cắt. Từ các kết quả phân tích có thể xác định được vị trí tương đối của các điểm được cắt trên phân tử ADN. Hình 4.4. Kiểu cắt của một số loại enzyme Giả sử chúng ta muốn lập bản đồ các điểm cắt của các enzyme BamHI, EcoRI và Psd đối với đoạn ADN có chiều dài 15kb, kết quả thu được như sau: Nếu chỉ sử dụng riêng lẻ một loại enzyme thì đoạn ADN dài 15 kb sẽ bị cắt thành 2 đoạn có kích thước khác nhau. BamHI cắt đoạn ADN thành 2 đoạn với kích thước 14 kb và 1 kb EcoRI cắt đoạn ADN thành 2 đoạn với kích thước 12 kb và 3 kb PstI cắt đoạn ADN thành 2 đoạn với kích thước 8 kb và 7 kb 54 Nếu sử dụng phối hợp 2 hoặc 3 loại enzyme thì đoạn ADN bị cắt thành 3 hoặc 4 đoạn nhỏ: BamHI + EcoRI cắt đoạn ADN thành 3 đoạn với kích thước 11 kb, 3 kb và 1 kb. BamHI + PstI cắt đoạn ADN thành 3 đoạn với kích thước 8 kb, 6 kb và 1 kb. EcoRI + PstI cắt đoạn ADN thành 3 đoạn với kích thước 7 kb, 5 kb và 3 kb. BamHI + EcoRI+PstI cắt đoạn ADN thành 4 đoạn với kích thước 6kb, 5kb, 3kb, 1kb. Hình 4.5. Các enzyme BamHI, EcoRI và PstI cắt trình tự 15kb thành 2 phân đoạn ADN có kích thước khác nhau Việc phát hiện các enzyme giới hạn là bước đột phá quan trọng trong lĩnh vực sinh học phân tử nói chung cũng như công nghệ tái tổ hợp AND nói riêng. Thực chất những enzyme dùng trong công nghệ ADN tái tổ hợp thuộc enzyme giới hạn nhóm II. Chúng phân cắt khu vực bên trong phân tử ADN tại một trình tự nucleotit nhất định và tạo ra hỗn hợp (quần thể) các đoạn ADN với kích thước khác nhau. Cho đến ngày nay người ta đã tách được hơn 1200 enzyme giới hạn nhóm II từ các cơ thể procariot. Trên 70 enzyme giới hạn hiện đang được bán sẵn trên thị trường. Các RE có thể nhận biết những trình tự ngắn của ADN và cắt đúng vào vị trí đó phân chia phân tử ADN thành những đoạn có độ dài đặc trưng. Các RE khác nhau thì có đoạn nhận biết với trình tự bazơ đặc trưng khác nhau. Sơ đồ mô tả các vị trí cắt khác nhau của một phân tử ADN được gọi là bản đồ cắt hạn chế. Nhiễm sắc thể của Eukaryot chứa phân tử ADN gồm nhiều gene và nó có thể bị cắt bởi enzyme cắt hạn chế thành nhiều đoạn nhỏ, chính vì vậy có thể sử dụng enzyme giới hạn trong ứng dụng lập bản đồ cắt hạn chế. 55 Hình 4.8. Điện di đồ các phân đoạn ADN bị cắt bởi sự phối hợp các enzyme a. BamHI + EcoRI b. BamHI + PstI c EcoRI + PstI d. BamHI + EcoRI+PstI Quy trình lập bản đồ cắt hạn chế theo quy trình dưới đây: 1. Nghiên cứu đa dạng kiểu hình trong quần thể. 2. Tách chiết phân tử ADN. 3. Sử dụng enzyme RE. 4. Điện di trên gene agarose. Phân đoạn cắt bởi RE-A ADN chuẩn Phân đoạn cắt bởi RE-B Hình 4.7. Sơ đồ các bảng điện di của các mẫu thí nghiệm và ADN chuẩn Ngoài ứng dụng thiết lập bản đồ cắt giới hạn người ta còn sử dụng enzyme giới hạn kết hợp với enzyme nối để tạo vector tái tổ hợp (hình 4.8). 56 Hình 4.8. Sử dụng enzyme giới hạn và enzyme nối để tạo ADN tái tổ hợp §2. CÁC NHÓM ENZYME KHÁC 2.1. Polimerase Các polimerase tham gia vào quá trình tái bản ADN và phiên mã tổng hợp ARN và được sử dụng nhiều trong kĩ thuật di truyền. Các pohmeasase gồm 2 nhóm: (1) ADN-polimerase xúc tác tổng hợp chuỗi polinucleotit theo chiều từ 5' đến 3'. Taq polimerase (enzyme tách từ vi khuẩn suối nước nóng) có khả năng chịu nhiệt, sử dụng trong phản ứng chuỗi PCR. Enzyme phiên mã ngược (Reverse Transcriptase: RT-ase) xúc tác tổng hợp CADN từ khuôn ARN; (2) Các ARN-polimerase tham gia tổng hợp ARN. Ngoài các enzyme trên còn có nhiều enzyme tham gia sửa chữa những sai sót trên phân tử ADN. 2.1.1. Taq polimerase Taq polimerase được tách chiết từ một loại vi khuẩn Thermus aquaticus suối nước nóng. Taq polimerase được sử dụng trong PCR và RAPD tổng hợp đoạn ADN trong điều kiện có dung dịch đệm, Mg + primers. Hiện nay các nhà khoa học có thể phân lập gene xác định enzyme polimerase, tách dòng và biểu hiện gene này. Chính vì vậy bằng công nghệ ADN tái tổ hợp có thể tạo ra lượng lớn enzyme Taq polimerase sử dụng trong kĩ thuật di truyền. 2.1.2. ADN-polimerase I Enzyme ADN-polimerase I, ngoài chức năng polimerase, còn có hoạt tính 57 của exonuclease 5' → 3' và 3' → 5'. Enzyme này xúc tác phản ứng thay thế sợi, trong phản ứng đó chức năng exonuclease 5' → 3' phân huỷ sợi không làm khuôn trong khi polimerase tổng hợp bản sao mới. Chức năng exonuclease 5'→3' của ADN polimerase I có thể được loại bỏ bằng cách cắt enzyme để tạo ra đoạn Klenow. Đoạn này vẫn duy trì các hoạt tính polimerase và exonuclease 3'→ 5'. Đoạn Klenow được sử dụng khi cần sao chép một phân tử ADN mạch đơn. 2.1.3. Enzyme phiên mã ngược Enzyme phiên mã ngược được phát hiện từ 1970 có chức năng tổng hợp ADN từ ARN. Trong tự nhiên, enzyme này do Retrovirus sản sinh để phiên mã ngược từ hệ gene ARN của chúng để thực hiện quá trình xâm nhập vào hệ gene của tế bào chủ. Reverse Transcriptase được sử dụng trong kĩ thuật tạo cADN bằng phản ứng PCR ngược (RT-PCR). Hiện nay người ta sử dụng các loại enzyme phiên mã ngược như: Avian Myeloblastosis virus reverse transcriptase (AMV-RT) và Moloney Murine Leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV- RT), trước đây AMV-RT phải tách chiết từ virus Myeloblastosis gia cầm, còn M-MLV-RT từ virus gây bệnh Leukemia ở chuột. Các enzyme này là sản phẩm của gene pol của virus và hiện nay các enzyme này đã nhận được từ công nghệ ADN tái tổ hợp. Enzyme phiên mã ngược là một ADN-polimerase phụ thuộc ARN, vì vậy nó sản sinh ra sợi ADN từ sợi khuôn ARN. Nó không có hoạt tính exonuclease kèm theo. Enzyme này chủ yếu được sử dụng để sao chép các phân tử mARN khi chuẩn bị cADN (ADN bổ trợ hoặc ADN bản sao) để tách dòng, mặc dù nó cũng có tác động trên khuôn ADN. 2.1.4. T4 ADN-polimerase Enzyme T4 ADN-polimerase có nguồn gốc từ phage T4 kí sinh trong tế bào vi khuẩn. Hoạt tính của enzyme này giống như hoạt tính đoạn Klenow và được sử dụng trong tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao. Bởi vì hoạt tính exonuclease 3'-5' mạnh hơn T4 ADN-polimerase. 2.1.5. Terminal transferase Enzyme Terminal transferase được li trích từ tuyến ức bò, có chức năng xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotit vào đầu 3'-OH tự do của ADN. Terminal transferase được sử dụng khi thêm đuôi polinucleotit để tạo đầu so le cho ADN trong kĩ thuật tạo dòng. 2.1.6. Enzyme Alkaline phosphatase Enzyme Alkaline phosphatase được phân lập từ E. coli hay từ ruột bò. Chức năng của enzyme này là loại bỏ nhóm 5' phossphate của ADN, ARN và 58 các nucleotit tự do. Enzyme Alkaline phosphatase sử dụng để loại bỏ 5'phossphate của ADN và ARN trước kho đánh dấu phóng xạ bằng 32 P; sử dụng trong kĩ thuật tạo dòng, khi vector được "mở" bởi RE và enzyme làm mất 5' phosphate để vector không thể nối lại được. 2.1.7. Enzyme T4 polinucleotit kinase Enzyme T4 polinucleotit kinase có nguồn gốc từ phagene T4 kí sinh trong E. coli. Chức năng của enzyme T4 polinucleotit kinase ngược lại với Alkaline phosphatase, xúc tác cho phản ứng thêm vào nhóm phosphate ở đầu 5' của ADN hay ARN. T4 polinucleotit kinase sử dụng để đánh dấu phóng xạ ở đầu 5' của ADN trong kĩ thuật xác định trình tự ADN và phosphoryl hoá các trình tự ADN không có nhóm phosphate ở đầu 5' để chuẩn bị cho phản ứng nối của kĩ thuật tạo dòng. 2.2. Enzyme nối ADN-ligase Enzyme nối ADN-ligase xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn ADN và ARN. ADN-ligase là một enzyme nối quan trọng trong tế bào vì chức năng của nó là sửa chữa các mối liên kết photphodiester bị đứt gãy một cách ngẫu nhiên hoặc trong tái bản ADN hay tái tổ hợp ADN. ADN-ligase được sử dụng trong kĩ thuật tạo dòng và thường được kết hợp với các enzyme Alkaline phosphatase và polinucleotit kinase. Nhóm enzyme ligase được sử dụng nhiều nhất trong các thí nghiệm với ADN và ARN chủ yếu gồm E. coli ADN-ligase, T4 ADN-ligase và T4 ARN-ligase. 2.2.1. E. coli ADN-1igase Enzyme E. coli ADN-ligase được tách chiết từ E. coli, xúc tác cho các phản ứng nối hai trình tự ADN có đầu dính (so le). Hình 4.9. Enzyme E. coli xúc tác phản ứng nối hai trình tự có đầu dính 2.2.2. T4 ADN - ligase Enzyme T4 ADN-ligase chiết từ phage T4 kí sinh ở E. coli, xúc tác cho phản ứng nối hai trình tự có đầu bằng, được sử dụng nhiều trong kĩ thuật tạo 59 [...]... của phân tử lại ARN -ADN 3.5 RN-ase H Enzyme RN-ase H có khả năng loại bỏ ARN trong phân tử lai ARN ADN và thường được sử dụng để loại ARN sau phản ứng phiên mã ngược để tiếp tục tổng hợp mạch thứ hai của CANAtạo ADN mạch kép THẢO LUẬN 1 Thế nào là enzyme cắt và enzyme cắt hạn chế? Các nhóm enzyme giới hạn 2 Vấn đề đặc điểm của các loại enzyme dùng trong kĩ thuật sinh học phân tử 3 Trình bày các kiểu... trên phân tử ADN, tạo đột biến mất đoạn trên ADN khi phối hợp với nuclease Sĩ 3 .4 RN-ase A Enzyme RN-ase A có hoạt tính rất mạnh, có thể chịu đựng được nhiệt độ 0 90 C trong 60 phút Enzyme RN-ase A có khả năng cắt liên kết phosphodiester ngay sau một bazơ pyrimidine của ARN Enzyme RN-ase A được sử dụng để loại bỏ ARN trong chế phẩm ADN hoặc protein, loại bỏ các đoạn không bắt cặp 60 trên ARN của phân tử. ..dòng 2.2.3 T4 ARN-ligase Enzyme T4 ARN-ligase chiết từ phage T4 kí sinh ở E coli, xúc tác cho phản ứng nối hai trình tự ARN bằng liên kết phosphodiester Enzyme T4 ARNligase thường được sử dụng để đánh dấu phóng xạ ở đầu 3' của ARN trong kĩ thuật sản xuất mẫu dò (probe) Như vậy, enzyme ligase có hiệu quả trong sự gắn các khe hở của các trình tự có đầu dính hoặc đầu bằng với... các loại enzyme dùng trong kĩ thuật sinh học phân tử 3 Trình bày các kiểu cắt của enzyme giới hạn, cho ví dụ Nêu những ứng dụng cơ bản của RE 4 Thế nào là bản đồ cắt giới hạn? cho ví dụ minh hoạ 5 Nhóm enzyme nhân ADN và nối ADN 6 Nghiên cứu chỉ thị sinh học phân tử bằng phương pháp sử dụng các loại enzyme cắt hạn chế 61 ... từ Aspergillus oryzae có tác dụng phân giải ADN mạch đơn, mạch kép Enzyme nuclease S1 được sử dụng phân tích đặc điểm cấu trúc phân tử lai ADN - ARN, loại bỏ đầu so le để tạo đầu bằng, loại bỏ các nút vòng trên ARN trong phản ứng phiên mã ngược tạo cADN 3.3 Exonuclease III Ezyme Exonuclease III chiết từ E coli xúc tác phản ứng phân giải tuần tự các nucleotit từ đầu 3 '- OH tự do của ADN theo chiều từ... là 370C, nhưng nó có thể hoạt động ở nhiệt độ thấp hơn nhiều (4 ÷ 150C) §3 ENZYME NUCLEASE Enzyme nuclease là nhóm enzyme phân cắt ADN (ADNse) và ARN (ARNse) 3.1 DN-ase I Enzyme DN-ase I có khả năng cắt liên kết ngay sau một bazơ pyrimidine trên ADN mạch đơn hay mạch kép Trong thực nghiệm DN-ase I được sử dụng để loại ADN trong chế phẩm ARN và protein, tạo điểm đứt trong kĩ thuật đánh dấu mẫu dò 3.2 . Chương 4: ENZYME SỬ DỤNG TRONG KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Tóm tắt: Enzyme là những protein hoạt tính sinh học vả dựa vào loại phản ứng xúc tác mà trong sinh học phân tử có thể chia. nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực của sinh học phân tử và kĩ thuật di truyền. Enzyme được sử dụng trong các kĩ thuật sinh học phân tử như RFLP, PCR, tách dòng phân tử Nội dung của chương. chiết phân tử ADN. 3. Sử dụng enzyme RE. 4. Điện di trên gene agarose. Phân đoạn cắt bởi RE-A ADN chuẩn Phân đoạn cắt bởi RE-B Hình 4. 7. Sơ đồ các bảng điện di của các mẫu thí nghiệm và ADN