Chương BẢO TỒN NGOẠI VI ( Ex situ) Hai chiến lược bảo tồn In situ Ex situ, kỹ thuật có phương pháp kỹ thuật khác Định nghĩa UNCED, 1992 “Bảo tồn Ex situ bảo tồn thành phần đa dạng sinh học điều kiện sinh sống tự nhiên chúng”; “Bảo tồn In situ bảo tồn hệ sinh thái nơi sinh sống tự nhiên, trì phục hồi phát triển quần thể loài thực vật trồng trọt, thực vật hóa nơi chúng phát triển đặc tính đặc thù chúng” Bảo tồn Ex situ bao gồm lấy mẫu, vận chuyển, tích trữ, bảo quản vật liệu quan thu thập, bảo tồn In situ liên quan đến thiết kế, quản lý giám sát nguồn gen mục tiêu chỗ Bảo tồn In situ bảo tồn động, bảo tồn Ex situ bảo tồn tĩnh Trong bảo tồn Ex situ có phương pháp khác nhau, phương pháp có kỹ thuật đặc thù Bảo tồn Ex situ ứng dụng công nghệ cao bảo tồn hạt, bảo tồn In vitro, bảo tồn DNA, bảo tồn hạt phấn, ngân hàng gen đồng ruộng vườn thực vật Kỹ thuật bảo tồn Ex situ phù hợp cho bảo tồn trồng, loài hoang dại họ hàng hoang dại trồng, bảo tồn In situ phù hợp với loài hoang dại giống địa phương Gần đây, sau cách mạng xanh năm 1960, giống trồng cải tiến suất cao đồng di truyền, đặc biệt lương thực lúa lúa mỳ Bên cạnh lợi ích cách mạng xanh, hậu làm suy giảm đa dạng trồng tăng lên Nông dân bỏ rơi giống trồng địa phương giống truyền thống có khả thích nghi, thay giống cải tiến đồng di truyền Để ứng phó với vấn đề này, trung tâm nghiên cứu nông nghiệp quốc tế (IARCs) nhóm tư vấn nghiên cứu nơng nghiệp quốc tế bắt đầu thu thập nguồn gen loài trồng để bảo tồn Ủy ban tài nguyên di truyền thực vật Quốc tế thành lập, năm 1974 để xây dựng hợp tác toàn cầu nỗ lực thu thập, bảo tồn đa dạng di truyền thực vật bị đe dọa Ngày toàn cầu có 1.300 ngân hàng gen vật liệu di truyền, trì đánh giá 6.100.000 mẫu nguồn gen (FAO,1996), tập trung lớn vào nguồn gen lương thực ngũ cốc, số họ đậu số loài dễ bảo tồn hạt Những năm gần bảo tồn gen đồng ruộng cho phép bảo tồn lồi trồng khơng thể khó bảo tồn hạt Kỹ thuật bảo tồn bảo tồn In vitro bảo tồn lạnh phát triển giúp tăng khả bảo tồn tất loài vật liệu di truyền 4.1 KHÁI NIỆM Bảo tồn ngoại vi (Ex situ Off-site) đưa nguồn gen khỏi điều kiện tự nhiên sinh sống chúng khỏi hệ thống sản xuất đến lưu giữ Trung tâm với điều kiện kỹ thuật bảo đảm sức sống nguồn gen lâu dài, giữ nguyên biến dị, di truyền có nguồn gen phục vụ sử dụng cho nghiên cứu tái tạo quần thể nguồn gen Phương pháp bảo tồn ngoại vi phụ thuộc vào loài trồng, điều kiện quan nghiên cứu để áp dụng phương pháp bảo tồn khác - Ngân hàng gen hạt (seed genebanks) bao gồm ngân hàng hạt quan bảo tồn ngân hàng hạt cộng đồng (Community seed banks) - Ngân hàng gen đồng ruộng (field genebanks) - Bảo tồn In vitro với hai nhóm trồng kết hạt trồng sinh sản sinh dưỡng chia thành hai loại bảo tồn tế bào/mô bảo tồn hạt phấn - Ngân hàng AND (DNA banks) http://www.ebook.edu.vn 120 - Bảo tồn lạnh (Cryoconservation genebanks) - Vườn thực vật (Botanical gardens) - Ngân hàng gen (Genebanks) Ngân hàng gen lưu giữ, trì tái sinh trở lại mẫu sống giống trồng địa, giống địa phương, giống cải tiến, hoang dại họ hàng hoang dại Nguồn gen ngân hàng gen đảm bảo củng cố vững nguồn cung cấp lương thực, thực phẩm nhu cầu khác cho người, sản xuất nông nghiệp nghiên cứu tương lai 4.2 BẢO TỒN HẠT (SEED GENEBANK) (đối với hạt chịu làm khô -Orthodox seed conservation) Bảo tồn ngân hàng hạt kỹ thuật sử dụng rộng rãi để bảo tồn nguồn tài nguyên di truyền thực vật Hạt nguồn gen làm khô, tồn trữ điều kiện nhiệt độ thấp OoC, lạnh lạnh sâu Theo ghi nhận FAO, kỹ thuật bảo tồn 90% triệu mẫu nguồn gen bảo tồn Ex situ toàn cầu Mặc dù kỹ thuật bảo tồn lồi có hạt chống chịu nhiệt độ thấp làm khơ Hạt nhiều lồi khơng sống sót điều kiện lạnh làm khơ Các lồi khơng chống chịu loài nhân giống sinh dưỡng củ, mầm phải bảo tồn kỹ thuật khác Bảo tồn ngân hàng hạt cộng đồng không cần kỹ thuật cao trung tâm bảo tồn hay quan kinh doanh Nông dân nhiều nước phát triển phụ thuộc vào hệ thống cung cấp hạt giống khơng thức, sở giữ lại hạt vụ trước để làm giống sản xuất cho vụ sau Một số tồn trữ, xử lý để trao đổi hạt giống nội hay cộng đồng Những thành phần tham gia cung cấp hạt giống khơng thống hình thức cấu trúc địa Dịng thơng tin trao đổi hạt giống theo truyền thống tập quán địa phương Quản lý ngân hàng hạt giống cộng đồng, hệ thống cung cấp hạt giống địa phương phù hợp với số loại nguồn gen Ngân hàng hạt giống cộng đồng thể chế có vai trò quan trọng để bảo tồn giống địa phương sản xuất nơng nghiệp Cán bảo tồn phải có kiến thức ngân hàng hạt giống kiến thức cộng đồng, sở thiết kế bảo tồn hay cải tiến công tác bảo tồn Ngân hàng hạt giống cộng đồng có vai trị quan trọng đến nhận hỗ trợ từ nhà khoa học quốc gia Bảo tồn hạt loại nguồn gen khác nhau, thời gian bảo quản để áp dụng kỹ thuật đặc thù bảo tồn ngân hàng gen hạt + Bảo tồn dài hạn nguồn gen (Base collection), phải hạ độ ẩm hạt xuống – 6% bảo quản điều kiện nhiệt độ -10 đến -20oC cho bảo tồn dài hạn + Mẫu nguồn gen hoạt động (Active collections ), hạ độ ẩm hạt xuống ± % bảo quản điều kiện nhiệt độ 0°C để bảo tồn trung hạn + Nguồn gen công tác (Working collections) vật liệu cho tạo giống, bảo tồn ngắn hạn, bảo tồn chương trình đánh giá vật liệu nhà tạo giống kỹ thuật bảo tồn thông thường tồn trữ hạt giống Độ ẩm hạt làm khô đến độ ẩm bảo quản ( tùy theo lồi), bảo quản điều kiện nhiệt độ mơi trường Tuy nhiên phương pháp bảo tồn hạt với loài trồng khác nhau, loài hạt cứng, có hạt mềm, hạt lớn, hạt nhỏ Các loài hạt cứng nhỏ loài tạo hạt bình thường, nhiều lồi hạt cứng có giá trị cao cao su (Hevea sp), cacao ( Theobrroma cacao) loài ăn thân gỗ nhiệt đới Những loại hạt có đặc điểm mẫn cảm với làm khơ, ví dụ hạt mít giảm độ ẩm xuống 28oC gây hại làm sức sống hạt, chịu lạnh, kích thước hạt thường lớn, khối lượng 1000 hạt http://www.ebook.edu.vn 121 vượt 500 gam, hạt sầu riêng (Durio zibethinus) đến 14.000 g Như hạt bảo tồn điều kiện nhiệt độ thấp lại yêu cầu độ ẩm bảo tồn cao Hình 4-1: Sơ đồ dịng hoạt động bảo tồn ngân hàng hạt nguồn gen (Nguồn N Kameswara Rao, Jean Hanson, M Ehsan Dulloo, Kakoli Ghosh, David Nowell and Michael Larinde, 2006) Bảo tồn hạt khô áp dụng với nhiều lương thực sinh sản hạt hạt khơ q trình chín, chịu q trình làm khơ để bảo quản điều kiện ẩm độ thấp lạnh Theo Roberts, 1973 hạt dạng dạng hạt khô (orthodox), bảo tồn hạt khô phổ biến bảo tồn Ex situ theo báo cáo “ Thực trạng nguồn tài nguyên di truyền thực vật giới cho lương thực nông nghiệp FAO,1996” Nguồn gen bảo tồn trung tâm hai hình thức nguồn gen (Base collection) nguồn gen hoạt động (Active collection) Nguồn gen bảo tồn dài hạn thường nhân lưu sang nguồn gen hoạt động Điều kiện bảo tồn nguồn gen điều kiện nhiệt độ - 10 đến - 20oC, thường - 18oC, độ ẩm hạt 5± 1% (wb), bao đựng hàn kín Nguồn gen hoạt động bảo tồn ngắn hạn trung hạn (đến 30 năm), nhà tạo giống, nhân giống, nghiên cứu sử dụng Điều kiện nhiệt độ bảo tồn đến -10 oC, điều kiện tồn trữ nghiêm nghặt nguồn gen Dưới điều kiện bảo quản hạt lồi khác có tuổi thọ khác Bởi vậy, khó để xác định xác thời gian bảo tồn cho nguồn gen hoạt động Nguồn gen nguồn gen hoạt động khái niệm sở chức điều kiện bảo quản Hai hình thức giống khâu chế biến trước cho vào bảo tồn, lượng hạt cho vào bảo tồn khác Nguồn gen hoạt động số lượng mẫu lớn mẫu nguồn gen Một trung tâm thực hai hình thức hệ thống thơng tin có liên quan với http://www.ebook.edu.vn 122 4.2.1 Thu nhận mẫu nguồn gen hạt đưa vào ngân hàng hạt Thu nhận mẫu nguồn gen nhận vật liệu di truyền loài để đưa vào bảo tồn ngân hàng gen hạt, thu nhận mẫu bước trình bảo tồn ngân hàng hạt Mục đích chủ yếu bảo tồn hạt khô đảm bảo giữ đa dạng di truyền cho sử dụng tương lai Bảo tồn hạt phương pháp quan trọng để bảo tồn nguồn tài nguyên di truyền bị đe dọa, nguồn gen khó bảo tồn In situ, bổ sung đa dạng chưa đầy đủ cho sử dụng, bảo tồn phục vụ cho chương trình tạo giống với mục tiêu khác Bảo tồn hạt nước nước ta ưu tiên loài lương thực, nguồn gen có giá trị kinh tế cao, nguồn gen bị đe dọa, nguồn gen giống địa phương, loài họ hàng hoang dại + Thu nhận hạt đưa vào bảo tồn ngân hàng hạt Thu nhận mẫu hạt đưa vào bảo tồn từ trực tiếp trường mẫu nguồn gen thu thập trước Thu thập trường tiến hành vào thời gian hạt lồi trồng chín sức sống hạt tốt nhất, dựa màu sắc hạt chúng Màu sắc hạt nhận biết thời điểm chín khác lồi trồng Nhìn chung chín chuyển từ xanh sang màu vàng, nâu hay đỏ, vàng nâu, nâu tía Ví dụ cà chua chín chuyển từ xanh sang màu đỏ, dưa chuột xanh sang vàng nâu, lúa màu xanh sang vàng rơm Tuy nhiên lồi trồng có nhiều loại màu sắc cần có nghiên cứu xác định thời điểm hạt chín để thu thập cho bảo tồn hạt Hạt thu thời điểm chín nâng cao tuổi thọ, khả nảy mầm, sức sống hạt trình bảo tồn Kỹ thuật bảo tồn áp dụng chung cho toàn mẫu hạt, yêu cầu thu hạt tạo thành mẫu bảo tồn phải có độ chín đồng Dụng cụ chứa mẫu hạt cho thu thập sử dụng túi giấy, túi ni lơng, bao vải, bình thủy tình, bình nhựa sọt nhựa Dụng cụ chứa đảm bảo không bị tổn thương cho hạt hay trình vận chuyển, tách hạt, làm khô hạt hay không bị tăng nhiệt độ cao gây hư hỏng hạt Các dụng cụ chứa phải thơng thống, mở nắp miệng túi tránh gây ẩm ẩm độ cao dụng cụ chứa hô hấp hạt + Sơ chế mẫu hạt nguồn gen: Sau thu nhận nguồn gen tiến hành phơi sấy để giảm độ ẩm, làm xử lý nấm bệnh Hạt hay chín thường có độ ẩm cao (10 đến 20% tùy loài), ẩm độ cao gây hư hỏng hạt nhanh hô hấp sinh nhiệt độ ẩm độ cao khối mẫu, nguyên nhân dễ nhiễm bệnh vào lô hạt Làm sơ bộ, tách hạt làm khô cần thực sau thu thập tránh rủi ro giảm khối khối lượng mẫu vận chuyển Những phương pháp đơn giảm làm vỏ ngồi đập, trải hạt giấy, phịng thống, với loại khơ dễ tách tách hạt Những mọng bổ tách hạt sử dụng phương pháp lên men, hạt sau tách làm nước, làm khô sơ thấm quay túi lưới để nước Nếu thu thập thời gian dài điều kiện môi trường nóng ẩm, hạt sau làm khơ sơ tiếp tục làm khô chất hút ẩm chất silic dioxyt với tỷ lệ hạt/chất hút ẩm 3:2 đến : 1, lớp túi hạt, xếp lớp chất hút ẩm đặt dụng cụ chứa kín để tránh hút ẩm khơng khí vào dụng cụ chứa + Ghi nhận thông tin Thu thập ghi chép tồn thơng tin theo u cầu với nguồn gen (passport data), phương pháp thu thập nội dung thông tin cần thiết với nguồn gen trình bày chi tiết chương Những thơng tin trình sơ chế bổ sung thêm cập nhật vào sở liệu, ghi nhãn dụng cụ chứa Sau hồn thành cơng việc thu thập thực địa mẫu nguồn gen vận chuyển kho bảo tồn ngân hàng gen điều kiện bảo đảm nhiệt độ, độ ẩm không gây tổn thương giới đến mẫu hạt nguồn gen http://www.ebook.edu.vn 123 + Kiểm tra sâu bệnh hại hạt nguồn gen Kiểm tra bệnh hạt giống trước đưa mẫu nguồn gen vào kho bảo tồn, đặc biệt mẫu nguồn gen từ nước cần thực kiểm dịch nghiệm ngặt theo luật bảo vệ thực vật kiểm dịch thực vật quốc gia, trước đưa đến kho ngân hàng gen hạt tránh rủi ro dịch bệnh cho ngân hàng gen Những mẫu có bệnh cần xử lý hóa chất tẩy trùng loại bỏ trường hợp tẩy trùng Sản phẩm chuyển gen (GMOs) cần nhận biết nguy hiểm di truyền bảo tồn với tập hợp trồng khác, sản phẩm chuyển gen vào mẫu bảo tồn làm biến đổi nguồn gen bảo tồn thông qua thụ phấn Những thông tin nguồn gen cần đầy đủ từ nơi cung cấp kỹ thuật quản lý nguồn gen đặc thù với sản phẩm GMO 4.2.2 Đăng ký nguồn gen vào ngân hàng gen hạt Đăng ký nguồn gen gắn số hiệu để nhận biết mẫu nguồn gen đó, gọi mẫu nguồn gen số: xx để phân biệt với mẫu khác ngân hàng gen Đồng thời số ký hiệu phục vụ cho quản lý, tra cứu sử dụng nguồn gen, số gắn trước đưa mẫu vào ngân hàng Các bước thực đăng ký mẫu nguồn gen thực mơ tả sơ đồ sau: Hình 4-2: Các bước thực đăng ký mẫu nguồn gen vào ngân hàng gen hạt ( Nguồn N Kameswara Rao, Jean Hanson, M Ehsan Dulloo, Kakoli Ghosh, David Nowell and Michael Larinde, 2006) Bước 1: Kiểm tra hồ sơ văn pháp lý nguồn gen Thông tin người thu thập (passport information) gồm: tên giống, tên người thu thập, thông tin di truyền, vật liệu di truyền, vật liệu cải tiến, chọn lọc để tránh trùng lặp ngân hàng gen Thơng tin tối thiểu cần có sở liệu sau: http://www.ebook.edu.vn 124 - Thông tin thu thập - Tên thông thường, chi , loài - Số hiệu thu thập - Địa phương thu thập - Ngày thu thập - Số thu thập - Thơng tin hồn chỉnh sau thu thập - Tên thơng thường, chi , lồi, giống - Tên mẫu đặc điểm nhận biết liên quan đến mẫu - Thông tin phả hệ phương pháp tạo giống - Kiểu hình - Chủ sở hữu mẫu nguồn gen Ngồi thơng tin ban đầu thu thập nguồn gen, nghiên cứu nhận biết, phân biệt mẫu nguồn gen đăng ký thơng qua thí nghiệm trồng mẫu nguồn gen cạnh nhà có mái che đồng ruộng Đánh giá tất đặc điểm, tính trạng hình thái mẫu nguồn gen phân biệt mẫu, cần đặc điểm khác biệt với mẫu khác Đánh gía tính khác biệt mẫu nguồn gen áp dụng phương pháp đánh giá tính khác biệt khảo nghiệm DUS (của UPOV,1991), phân tích thống kê xác định dựa tham số t-test Khi so sánh kiểu hình, khơng đủ minh chứng tính khác biệt mẫu nguồn gen, sử dụng phương pháp hóa sinh để phân biệt điện di protein hạt isozyme để bổ sung cho so sánh hình thái Marker DNA AFLPs, SSRs SNPs công cụ mạnh xác định khác biệt mẫu, áp dụng để kiểm tra mối quan hệ di truyền mẫu hỗ trợ đáng tin cậy hiệu qủa Bên cạnh thông tin nhận biết, mẫu nguồn gen phải có chứng vệ sinh an tồn bệnh nấm, vi khuẩn, virus côn trùng gây hại Bệnh nấm, vi khuẩn virus ký sinh hạt nguy hiểm khó loại bỏ xử lý thuốc hóa học hay biện pháp xử lý khác Trong trường hợp không xử lý phải loại bỏ thu thập mẫu nguồn gen khác thay Chất lượng mẫu hạt đủ cho bảo tồn, chất lượng mẫu hạt đánh giá tỷ lệ nảy mầm, sức sống hạt Tỷ lệ nảy mầm mẫu hạt trồng khơng thấp 85%, lồi hoang dại không nhỏ 75% Số lượng mẫu hạt tối thiểu để đăng ký đơn vị đăng ký mẫu nguồn gen (base unit) ước lượng cỡ mẫu tiêu chuẩn cho lồi cơng thức sau: BS = (PP x NP)/(GR x FG) Trong đó: BS số hạt yêu cầu cho đăng ký; PP = quần thể mong muốn lần nhân; NP số lần nhân tối thiểu GR % nảy mầm điều kiện tiêu chuẩn ; FG % nảy mầm đồng ruộng ( nhỏ nảy mầm tiêu chuẩn 1% với điều kiện tốt 5% với điều kiện đồng ruộng xấu) Ví dụ + + + + Quần thể mong muốn lần nhân 100 cá thể Tỷ lệ nảy mầm = 95% Tỷ lệ nảy mầm đồng ruộng = 90% ( ruộng xấu) Số lần nhân tối tiểu = lần nhân (100 x3) = 351 hạt Đơn vị cư số hạt tối thiểu để đăng ký = = (0,95 x0,90) http://www.ebook.edu.vn 125 Cuối văn pháp lý cho bảo tồn nguồn gen văn thỏa thuận với người thu thập hay sở hữu nguồn gen (có thể cá nhân, tổ chức Viện nghiên cứu, công ty ) cho phép bảo tồn sử dụng mẫu nguồn gen Trường hợp mẫu nguồn gen không đủ điều kiện trên, cần hoàn chỉnh bổ sung trước đăng ký Ví dụ: số liệu thơng tin ban đầu, số lượng chất lượng không đảm bảo, sâu bệnh hại hay chưa thủ tục pháp lý Bước 2: Thủ tục đăng ký nguồn gen Mẫu nguồn gen đủ điều kiện tối thiểu tiến hành đăng ký mã số nguồn gen theo thủ tục sau: - Xắp xếp vật liệu theo thứ tự tên giống (theo vần alphabe chữ cái) - Kiểm tra lại gói mẫu theo danh sách mẫu chuẩn bị trước - Nếu danh sách khơng đáp ứng sửa hay điều chỉnh lại danh sách - Kiểm tra lại liệu ban đầu để đưa mã số cho mẫu nguồn gen - Đưa mã số nguồn gen theo thứ tự - Viết mã số nguồn gen lên túi danh sách - Đưa tồn thơng tin vào file sở liệu ngân hàng gen Phương pháp làm mã số cho ngân hàng gen mới: hệ thống mã số cho ngân hàng gen phải đảm bảo đơn giản, thực tế, dễ sử dụng Thường sử dụng dãy số tự nhiên làm mã số, cộng thêm ký hiệu khác để có thơng tin thêm Ví dụ mẫu nguồn gen Việt Nam có dãy mã VNGR-1, VNGR-2 Trong trường hợp ngân hàng gen lớn cần ký hiệu mã số theo loài trồng, xắp xếp loài chi thành nhóm Khơng ký hiệu dãy số ví dụ từ - 500 mẫu nguồn gen lúa, 501-1000 mẫu nguồn gen ngô, 1001 - 1500 mẫu nguồn gen đậu tương nhầm lẫn khó quản lý ngân hành gen hạt 4.2.3 Độ mẫu hạt nguồn gen Làm hạt trước đưa vào kho tồn trữ nhằm loại bỏ tạp chất, vật chất vô chất hữu cơ, hạt khác lồi, hạt sâu bệnh, hạt chưa chín để nâng cao chất lượng mẫu trước bảo tồn Làm cịn giảm kích thước mẫu đưa vào kho đỡ tốn khơng gian kho chi phí bảo tồn Quá trình làm sơ nơi thu thập chưa tách hạt, cần phải tách hạt khỏi quả, cành giai đoạn này, tách hạt với loại khác phương pháp tách, độ ẩm tách khác để không gây tổn thương hạt Hạt lồi trồng có lớp chất nhày (mucilate) bao bọc hạt, cà chua, dưa chuột tách hạt phương pháp lên men dùng axit để tách hạt (tham khảo giáo trình sản xuất giống cơng nghệ hạt giống) Làm hạt mẫu nguồn gen thực hoạt động bản: - Loại bỏ tạp chất sàng với kích thước mắt sàng khác nhau, loại bỏ tạp chất hạt không kích thước với mẫu nguồn gen (hạt lép, lửng, méo mó, dị dạng) - Kiểm tra bệnh trùng hạt để loại bỏ hạt nhiễm sâu bệnh - Kiểm tra hạt tổn thương giới - Phân tích độ bổ sung vào sở liệu - Sau làm kiểm tra lại lần cuối tiêu - Làm mẫu hạt thực thủ công hay thiết bị làm chuyên dụng, làm máy cần ý tốc độ để không tổn thương mẫu hạt Mẫu phân tích độ lấy từ mẫu nguồn gen, cân cân điện tử, chia lấy mẫu phân tích áp dụng phương pháp chia đôi thay đổi Sau làm sạch, cân khối http://www.ebook.edu.vn 126 lượng hạt sạch, khối lượng tạp chất, khối lượng hạt khác dạng tính độ cơng thức: Ví dụ : Tổng khối lượng mẫu = 250 g; khối lượng hạt = 245,2g, tạp chất = 3,5 g, hạt khác = 1,3 g tính độ thu kết 245,2 x100 Độ sạch(%) = = 98,08% 250 Các thông tin sau làm bổ sung vào cở sở liệu loại mẫu, phương pháp tách hạt, phương pháp làm sạch, ngày làm sạch, tổng khối lượng mẫu nguồn gen sau làm sạch, mức độ tạp chất phần trăm độ mẫu 4.2.4 Độ ẩm mẫu hạt làm khô trước bảo tồn + Xác định độ ẩm hạt Độ ẩm hạt (SMC) tổng lượng nước hạt bao gồm nước tự nước liên kết tế bào hạt Xác định độ ẩm hạt hai phương pháp (1) phương pháp sấy (2) máy đo độ ẩm hạt, độ ẩm hạt tính: Ghi chú: SMC độ ẩm hạt, wb khối lượng tươi ( ISTA,2005) Phương pháp sấy thực theo quy trình ISTA,2005 sau: Hình 4-3: Sơ đồ dịng trình xác định độ ẩm hạt ( Nguồn N Kameswara Rao cộng 2006) Nhiệt độ sấy hạt lồi khác có u cầu nhiệt độ sấy khác nhau, số loài yêu cầu nhiệt độ cao, ổn định số loài khác yêu cầu nhiệt độ sấy thấp ổn http://www.ebook.edu.vn 127 định Theo ISTA, 2005 hạt có dầu sấy nhiệt độ thấp, hạt khơng có dầu sấy nhiệt độ cao Ví dụ số lồi quan trọng bảng 23: Bảng 4-1: Xác định độ ẩm hạt số loài trồng quan trọng phương pháp sấy ( ISTA,2005) Xác định độ ẩm hạt số loài trồng sấy nhiệt độ thấp, ổn định Ớt (Capsicum) Hạt lanh (Linum) Vừng (Sesamum) Bông (Gossypium) Lạc ( Arachis) Đậu tương (Glycine) Cà tím( Solanum) Hành (Allium) Tất loài thân gỗ Củ cải ( Raphanus) Brassica Xác định độ ẩm hạt số loài trồng sấy nhiệt độ cao, ổn định Măng tây(Asparagus) Dưa chuột(Cucumis) Bí(Cucurbita) Đậu ( Phaselus) Rau diếp (Lactuca) Cao lương ( Sorghum) Cà rốt (Daucus) Ngô (Zea) Cà chua ( Lycopersicon) Đậu mỏ ( Cicer) Lúa ( Oryza) Dưa hấu (Citrullus) Làm khô trước xác định độ ẩm hạt độ ẩm 17% thực sau: - Cân mẫu hạt, mẫu - g khối lượng cốc chứa hạt - Đặt mẫu phịng thí nghiệm với điều kiện ấm khơ - Cân lại mẫu gồm cốc chứa - Tính độ ẩm hạt khối lượng tươi Dụng cụ thiết bị cần thiết cho phương pháp xác định độ ẩm sấy chủ yếu gồm: Tủ sấy đối lưu luồng khí khơ, chu kỳ 15 phút hay ngắn hơn, có khả trì ổn định phạm vi 1oC, có nhiệt kế xác 0,5oC Dụng cụ chứa hạt sấy khơng bị ăn mịn, kính, thủy tinh, kích thước chiều cao dụng cụ đựng mẫu đảm bảo phù hợp với kích thước mẫu, cân phân tích xác 0,001 - 0,0001g Cỡ mẫu lấy mẫu kiểm tra độ ẩm: Ngân hàng gen hạt thường có số lượng hạn chế, lấy mẫu phân tích thường lấy mẫu nhỏ Sử dụng lần lặp lại mẫu 0,5 đến gam tối thiếu 10 hạt để xác định độ ẩm Mẫu phải đại diện cho mẫu nguồn gen Lấy mẫu lần giữ hạt bình chứa kín, ổn định độ ẩm tránh làm thay đổi độ ẩm Hạt số loài yêu cầu nghiền để xác định độ ẩm - Dán nhãn cân khối lượng hộp sấy, có nắp đồng thời ghi khối lượng vào cột (W1) sổ theo dõi để tính độ ẩm - Cho hạt chuẩn bị trước ngầu nhiên vào hộp sấy (mỗi mẫu hạt 0,5 đến gam) đậy lắp cân khối lượng (W2) - Đưa hộp sấy có hạt vào tủ sấy 130 - 133oC, sấy - tùy theo lồi (ví dụ với ngơ, với ngũ cốc khác) - Lấy hộp mẫu khỏi tủ sấy để nguội 45 phút, cân khối lượng (W3) W2 − W3 Độ ẩm (%) = x100 W − W1 Trong W1 khối lượng hộp sấy có nắp W2 khối lượng hộp chứa hạt trước sấy có nắp W3 hộp mẫu sấy Độ ẩm mẫu hạt trung bình 02 lần nhắc lại tính ví dụ sau: Ví dụ http://www.ebook.edu.vn 128 14,86 − 14,43 x100 = 9,47 14,86 − 10,32 14,99 − 14,53 Độ ẩm lần lặp lại 2= x100 = 9,45 14,99 − 10,14 9,47 + 9,45 Độ ẩm hạt (% wb) = = 9,46 Nếu mẫu có làm khơ trước, sử dụng cơng thức sau để tính độ ẩm cuối mẫu M 1xM Độ ẩm cuối (%)= ( M + M 2) − 100 Độ ẩm hạt lần lặp lại = Trong đó: M1 % độ ẩm làm khô lần đầu, M2 % độ ẩm sau sấy ( lần 2) Với hạt có dầu sấy điều kiện nhiệt độ thấp ổn định thời gian sấy dài hơn, đặt hộp sấy 103oC± 2oC sấy thời gian 17± Phương pháp xác định độ ẩm khác dùng máy đo độ ẩm, máy đo cần điều chỉnh độ xác theo tiêu chuẩn phương pháp sấy, kiểm tra với loài trồng, thao tác kỹ thuật kiểm tra phương pháp sấy quan để đảm bảo độ xác Ngày nhiều ngân hàng gen hạt sử dung công nghệ cao để xác định giám sát độ ẩm cảm biến số (digital humidity sensor), phương pháp dựa lượng nước thoát làm thay đổi cân nước kho tồn trữ Mẫu hạt đựng buồng kín xác định dựa đường cong chia độ (calibration), phương pháp biểu thông qua độ ẩm liên kết (RH) Phương pháp ống chia độ (calibration) để đo độ ẩm hạt nhanh, mối quan hệ xác số thước đo độ ẩm với độ ẩm thực hạt xác định sấy ISTA gọi phương pháp ống nhiệt Trên sở nhiều mẫu nhiều giống, nhiều khu vực, nhiều năm khác phạm vi độ ẩm thơng thường lồi (6 - 25%) Đường cong chia độ (calibration) thiết lập từ điểm ô trái ngược đánh giá sấy, Xác định độ ẩm máy đo độ ẩm gồm bước - Lấy hai mẫu ngẫu nhiên có khối lượng thể tích u cầu máy đo đặc thù - Đặt mẫu buồng hạt đọc - Độ ẩm (phần trăm khối lượng) ngang với bình lần đọc Hình 4-4: Quá trình làm khơ hạt nguồn gen ( Nguồn N Kameswara Rao cộng 2006) http://www.ebook.edu.vn 129 Phân bón hàng năm khác so với lâu năm lượng bón, thời gian bón phương pháp bón Lượng phân bón phương pháp bón đảm bảo cân đối đạm, lân, kali phân hữu cơ, ngắn ngày tập trung bón lót, bón thức lần bón trước hoa khơng bón nhiều lần, lâu năm tập trung bón – lần năm Phương pháp bón tập trung giảm khả bị sâu, bệnh gây hại + Phòng trừ sâu bệnh cỏ dại Phòng trừ sâu bệnh kỹ thuật quan với ngân hàng gen đồng ruộng, biện pháp cụ thể bệnh virus: - Chọn khu bảo tồn bệnh - Cách ly tránh truyền bệnh - Luân canh trồng với nguồn gen hàng năm - Xử lý đất trước trồng, - Cây ăn áp dụng kỹ thuật nhân giống bệnh vi ghép yêu cầu bắt buộc Phòng trừ cỏ dại ruộng bảo tồn nguồn gen đồng ruộng áp dụng kỹ thuật phòng trừ cỏ dại tay hay phun thuốc trừ cỏ Phòng trừ cỏ dại tay cần tiến hành thường xuyên, tránh cỏ dại lấn át cây, đặc biệt với loài trồng cạn Khi phòng trừ cỏ dại thuốc hóa học cần lựa chọn thuốc, thời gian phun, nồng độ liều lượng phun phù hợp với loài Thụ phấn bổ sung tạo hạt cho giao phấn, thu phấn 01 lô thụ cho để thu lượng hạt đủ cho phân phối trao đổi nguồn gen Sản xuất thu hoạch hạt trồng lại vụ ngắn ngày có kỹ thuật khác nhau, thu hoạch hạt nguồn gen thường thu tay, số lượng dòng lớn số cá thể dịng nhỏ Q trình thu hoạch thường tập trung vào thời gian định năm cần có kế hoạch chi tiết cho thu hoạch cập nhật thông tin vào sở dự liệu 4.3.5 Đánh giá đặc điểm ngân hàng gen đồng ruộng a) Đánh giá đặc điểm hình thái Sau thu thập nguồn gen cần đánh giá mô tả đặc điểm nuồn gen cách hệ thống, từ bắt đầu nhận nguồn gen đến nhân tăng số hạt bao gồm: mô tả, đánh giá bản, đánh giá chi tiết nhân tài liệu hóa - Liệt kê mơ tả ban đầu: Quá trình đánh giá bắt đầu danh sách mô tả nguồn gen, mô tả giúp chuẩn hóa thuật ngữ tiêu trật tự, đặc điểm theo logic khoa học Mô tả theo hệ thống mô tả tiêu chuẩn IPGRI, nhiều tính trạng mơ tả cho điểm đến 9, điểm mức tốt nhất, số tính trạng đặc điểm thang điểm cuối 3, hay Xác định giai đoạn sinh trưởng để đánh giá, mô tả cho điểm kỹ thuật quan trọng, giai đoạn mẫn cảm đặc điểm biểu rõ nét, ổn định điển hình Minh họa đánh giá số tính trạng lúa theo Hệ thống đánh giá tiêu chuẩn cho lúa IRRI, 2002 (Standard Evaluation System for Rice - SES) - Chiều cao (Ht) Ghi chú: Đo trực tiếp từ mặt đất đến hạt đỉnh đầu ( kể râu) Tại giai đoạn sinh trưởng: 7-9 Thang điểm Bán lùn (đất thấp: nhỏ 110 cm; đất cao: nhỏ 90 cm Trung bình (đất thấp: 110-130 cm; đất cao (90125 cm) Cao (đất thấp: 130 cm; đất cao: 125 cm) http://www.ebook.edu.vn 148 + Sức sống mạ (Vg) Ghi chú: có số yếu tố ảnh hưởng tương tác đến sức sống mạ (khả đẻ nhánh, cao ) sử dụng tháng điểm để đánh giá vật liệu di truyền giống điều kiện bất thuận không bất thuận Thang điểm Rất khỏe (sinh trường nhanh; có 5-6 giai đoạn nhánh quần thể Sức khỏe (sinh trưởng nhanh; 4-5 1-2 nhánh Bình thường(cây có lá) Yếu (các cằn; 3-4 lá; mảnh , chưa đẻ nhánh Tại giai đoạn: Sức sống mạ: Sức sống sinh dưỡng: Rất yếu (sinh trưởng còi cọc; chuyển màu vàng) - Cơ sở để thu thập thông tin cho liệt kê mô tả: Số liệu ban đầu (passport data) bao gồm thông tin mẫu nguồn gen, địa điểm thu thập, thời gian, tên địa phương, tên khoa học đặc điểm khác Đặc điểm nhận biết: bao gồm đặc điểm có khả di truyền cao, dễ nhận biết qua quan sát đặc điểm ổn định qua mơi trường dạng hạt, dạng bông, màu sắc hoa Đánh giá bản: đánh giá hạn chế số tính trạng quan trọng để nhận biết nguồn gen gồm: tính trạng số lượng ảnh hưởng mơi trường tính trạng cây, lá, hoa, quả, sâu bệnh, chống chịu khác Đánh giá sâu đặc điểm tính trạng tiềm nơng sinh học sử dụng chương trình cải tiến giốngcây trồng b) Đánh gía đặc điểm nơng sinh học Để đánh giá đặc điểm nông sinh học cần bố trí nguồn gen đồng ruộng với thiết kế thí nghiệm tiêu chuẩn kích thước thí nghiệm, ngẫu nhiên, lặp lại Thí nghiệm tiêu chuẩn đánh giá đặc điểm tỷ lệ sống sót, sức sống sinh trưởng, thời gian sinh trưởng, thời gian chín, khả chống chịu sâu bệnh, bất thuận, suất yếu tố tạo thành suất, chất lượng dinh dưỡng Phương pháp kỹ thuật đánh giá phù hợp lồi loại tính trạng 4.3.6 Sử dụng ngân hàng gen đồng ruộng Cũng phương pháp bảo tồn khác, sử dụng ngân hàng gen đồng ruộng phục vụ cho chọn tạo giống trồng thương mại, sử dụng làm bố mẹ chương trình lai, nghiên cứu di truyền, trao đổi nguồn vật liệu di truyền vật liệu trồng trọt Sử dụng cho chương trình khác cảnh quan, du lịch sinh thái… 4.4 BẢO TỒN ĐÔNG LẠNH Khái niệm bảo tồn đơng lạnh (Cryopreservation) q trình tế bào mơ trì nhiệt độ thấp 0oC, điển hình điều kiện ni tơ lỏng -196oC Tại nhiệt độ thấp tế bào sinh vật dừng hoạt động sinh học, kể phản ứng sinh hóa, hoạt động trao đổi chất, hô hấp Các phần dung dịch, nước đóng băng suốt, tế bào bảo tồn thường bị gây hại q trình đóng băng tiếp xúc với nhiệt độ ấm phòng Một số lồi trồng quan trọng khơng thể bảo tồn hạt loài lấy củ, rễ, thân bụi thân gỗ Một số kỹ thuật bảo tồn loài nhân giống sinh dưỡng phát triển bảo tồn nuôi mô In vitro, phương pháp có tiềm để bảo tồn nguồn gen vật liệu nhân giống sinh duỡng Nhưng có hai trở ngại kỹ thuật bảo tồn In vitro không ổn định, xuất biến dị xô ma khó bảo tồn dài hạn http://www.ebook.edu.vn 149 vật liệu mô hay tế bào Khắc phục hạn chế bảo tồn In vitro, phương pháp bảo tồn đông lạnh nhiệt độ cực thấp phát triển, kéo dài thời gian bảo tồn lồi khó bảo tồn In vitro Các kỹ thuật cải tiến bảo tồn In vitro phát triển nước có khác để bảo tồn nguồn gen ( Griffs Litz,1998, Perez cs, 1999) Trong báo cáo hàng năm IPGRI, kết bật nghiên cứu bảo tồn đông lạnh sử dụng bảo tồn ăn nhiệt đới Cây ăn Châu Á trồng quan trọng, việc bảo tồn loài gặp thách thức hạt số ăn khó bảo tồn ngân hàng gen hạt chúng mẫn cảm với độ ẩm nhiệt độ, bảo tồn đồng ruộng chi phí cao, dễ bị điều kiện bất thuận sâu bệnh gây hại nguồn gen Chính giới có nhiều nghiên cứu bảo tồn nguồn gen lồi phương pháp bảo tồn đông lạnh bảo tồn In vitro Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp quốc tế Australia (ACIAR) phát triển kỹ thuật tiến bảo tồn nguồn gen loài ăn nhiệt đới bảo tồn nguồn gen đu đủ bảo tồn động lạnh cho kết tốt cần phải có kiểm tra di truyền sau bảo tồn dài hạn Một tiến nhà khoa học phát triển số mầm siêu nhỏ cho thí nghiệm nghiên cứu bảo tồn đông lạnh cho nhãn vải Việt Nam Kỹ thuật bảo tồn đông lạnh phát triển nhanh năm gần mở khả bảo tồn lâu dài nguồn gen trồng quý Bắt đầu từ tiếp cận bảo tồn lạnh, nghiên cứu kỹ thuật cho phép đơng lạnh hồn tồn dung dịch tế bào, tái sinh dễ ràng Kỹ thuật bảo tồn đông lạnh ứng dụng cho pham vi rộng mô tế bào, quan, phôi hạt phấn có nhiều thành cơng năm gần Một ước tính 100.000 lồi thực vật, đại diện cho 1/3 loài thực vật trái đất bị đe dọa đối mặt với tuyệt chủng hoang dại (BGCI, 2005), bảo tồn đa dạng sinh học cần thiết cho chương trình tạo giống trồng cung cấp lương thực, dinh dưỡng thuốc men cho người Từ năm 1970 giống trồng địa phương họ hàng hoang dại thu thập bảo tồn ngân hàng gen Ex situ, ước tính triệu mẫu nguồn gen thực vật bảo tồn trung tâm quốc gia, vùng giới Bảo tồn hạt điều kiện nhiệt độ thấp phương pháp phù hợp với có hạt khơng phù hợp với khó khơng kết hạt Ngày nay, công nghệ nuôi cấy mô đem lại lợi ích cho bảo tồn hai hướng bảo tồn Ex situ nguồn gen quý bảo tồn sinh trưởng chậm bảo tồn đông lạnh Bảo tồn đông lạnh hay bảo tồn lạnh bảo tồn nhiệt độ cực thấp -196oC (nhiệt độ ni tơ lỏng), ứng dụng để bảo tồn dài hạn nguồn gen Trong điều kiện toàn q trình sinh lý, sinh hóa trao đổi chất ngừng lại, vật liệu tồn trữ không giới hạn thời gian Mặc dù vậy, sử dụng bảo tồn nguồn tài nguyên di truyền thực vật, bảo tồn đơng lạnh hữu ích bảo tồn dài hạn mô thực vật với đặc điểm đặc thù dòng tế bào tạo alkaloid thuốc, ni cấy chuyển đổi di truyền, dịng chuyển gen hợp pháp Những nghiên cứu gần chứng minh dùng kỹ thuật đơng lạnh để trừ virus chuối nho thành công 4.4.1 Cơ sở lý thuyết bảo tồn đông lạnh Bảo tồn đơng lạnh mơ sinh học thành cơng hình thành đơng kết dạng nước đá tế bào, không gây hại màng tế bào, không phá hoại màng bán thấm tế bào Trong tự nhiên số lồi trồng chịu lạnh 0oC dịch tế bào bị đông kết cách tổng hợp chất đường, proline protein đảm bảo sống tế bào điểm đóng băng, trì độ ẩm tối thiểu cần thiết trì sống Những lồi khơng thể tồn điều kiện cực lạnh bảo quản lạnh Sự hình thành đơng kết dịch tế bào không giảm nước mức, thơng qua đơng lạnh nhanh Đơng lạnh nhanh trình chuyển đổi lý học từ dạng dung dịch sang thể rắn Hai http://www.ebook.edu.vn 150 yêu cầu cho q trình chuyển đổi tỷ lệ đóng băng nhanh đơng đặc dịch tế bào Tỷ lệ đóng băng nhanh (6oC/giây), thực nhúng nhanh vật liệu vào dung dịch ni tơ lỏng Tỷ lệ lạnh nhanh khoảng 60oC/giây sử dụng “ droplet freezing protocol” lớp nhôm mỏng nhúng trực tiếp vào ni tơ lỏng tăng nhiệt độ lạnh lên -130oC/giây (Panis, Piette and Swennen, 2005) Dịch tế bào đậm đặc thông qua làm khô khử nước trước làm đơng kết dịch tế bào, mức nước giảm 20 - 30% Làm giảm nước tế bào: mẫu phơi dịng khí tiệt trùng, phương pháp không điều khiển nhiệt độ độ ẩm, hai yêu tố ảnh hưởng mạnh đến nước, phương pháp làm khơ sử dụng bình thủy tinh kín chứa gel silica hút ẩm điều khiển nhiệt độ ẩm độ Khi tế bào thực vật có chứa tác nhân kết tinh đá, q trình làm lạnh chậm, đơng kết bắt đầu khoảng không tế bào, cân đối nước phân bố dịch tế bào đông lạnh chuyển thành dạng nước đá, lại trở thành đậm đặc, tăng sức trương tế bào Qúa trình trao đổi chất thích nghi với mơi trường thực vật, thực đông kết dịch bào q trình tăng khả sống sót thực vật tác động môi trường bất thuận Trong tự nhiên gây sốc yếu tố môi trường giảm nhiệt độ ánh sáng ngày ngắn Thay đổi áp suất thẩm thấu xử lý ABA có hiệu tương tự Trao đổi chất thích nghi kết tăng protein, đường, glycerol, proline β- glycine, chất đóng góp để tăng giá trị thẩm thấu chất tan tế bào Hầu hết mô hydrat không chống lại giảm hàm lượng nước để đông kết lại (20 - 30%) ảnh hưởng dung dịch giới Mấu chốt bảo tồn đông lạnh thành công chuyển từ chụi lạnh đến chịu khử nước, chống chịu giảm bảo vệ lạnh với chất đường, amino axit, Dimethyl Sulfoxide (DMSO), glycerol Cơ chế hoạt động chất khử nước chưa có nghiên cứu đầy đủ Như lựa chọn, khử nước tạo trao đổi chất thích nghi tương tự quan sát thích nghi lạnh thực vật tự nhiên, thường hướng đến tích lũy protein, đường, polyamine hợp chất đặc thù khác bảo vệ tế bào q trình làm khơ Xử lý đường thay protein (Carpentier cs, 2005) thành phần cấu tạo màng (Ramon cs, 2002) ảnh hưởng đến tính đàn hồi tính thấm màng Ví dụ bảo quản mơ có mạch nhỏ: ngâm môi trường CPTES với 15% DMSO đến cân nước Đông lạnh 1oC/phút tồn trữ -196oC Khi làm tan đông lạnh nhiệt độ tăng lên nhỏ 50oC/phút phạm vi từ -140oC đến -120oC ( nhiệt độ đóng băng kính dung dịch -123oC), băng tan hoàn toàn nhiệt độ 37oC Khơng có kỹ thuật điều khiển làm gãy mạch dẫn mô tế bào gây hỏng vật liệu bảo quản không sử dụng Nhiều loài trồng bảo tồn phương pháp đông lạnh khác giới, Đức thu thập vi quan tế bào, mô phân sinh 519 giống khoai tây cũ bảo tồn phương pháp đông lạnh giọt (Mix-Wagner, Schumacher Cross, 2003), Trung tâm Nghiên cứu Cây có củ quốc tế (CIP) bảo tồn 345 mẫu giống khoai tây đơng lạnh kính Ngân hàng gen chuối trường đại học Katholieke Universiteit Leuven Vương Quốc Bỉ (KUL) bảo tồn lạnh thành công, bảo tồn In vitro 900 mẫu giống chuối nuôi cấy mô 545 giống kho lạnh sâu để bảo tồn dài hạn Bảo tồn dài hạn thay đổi DNA thực vật đơi nhầm lẫn nhãn tên Năm 2003 hỗ trợ nhóm tư vấn nơng nghiệp quốc tế ngân hàng bảo tồn lạnh đưa mẫu bảo tồn nuôi cấy mô nhân đánh giá nhà kính, so sánh với mẫu khơng bảo tồn nuôi cấy mô Kết tốt, hầu hết mẫu bảo tồn khơng bị thay đổi có số http://www.ebook.edu.vn 151 mẫu bị thay đổi, kết nghiên cứu có gía trị để nhà bảo tồn nhà nghiên cứu sử dụng phương pháp 4.4.2 Kỹ thuật bảo tồn đông lạnh Phương pháp bảo tồn đông lạnh sử dụng kỹ thuật nêu phối hợp kỹ thuật, phương pháp áp dụng phổ biến: - Làm khô không khí (làm khơ đèn, làm khơ thường) Phương pháp áp dụng trực tiếp với hạt khô, phôi hạt phấn nhiều lồi nơng nghiệp làm vườn, số lồi hạt khơ chịu làm khơ đến 3% khơng có gây hại không giảm sức sống Làm khô đèn flash (hoặc khơ nhanh) có lợi cho phơi khơng thích hợp cho làm khơ khơng khí - Phương pháp lạnh chậm truyền thống (hoặc đông lạnh chậm) Đây phương pháp phát triển với mô thực vật hydrate (Withers King,1980) Cơ sở phương pháp làm lạnh chậm mẫu bảo tồn (tại mức 0,5 đến 2oC/phút), có mặt dung dịch bảo vệ đơng lạnh Dimethyl Sulfoxide (DMSO) nồng độ trung bình - 15%, trình hạ nhiệt độ, mức hạ nhiệt -40oC đảm bảo yêu cầu, dung dịch tế bào đơng kết dạng kính nhúng ni tơ lỏng Phương pháp ngày sử dụng bảo tồn mô không tổ chức callus dung dịch tế bào huyền phù - Tạo hạt nhân tạo / khử nước Phương phát Fabrre Dereuddre đưa năm 1990, mô thực vật (thường mơ phân sinh phơi) gói hạt alginate (cũng có chứa muối khống chất hữu cơ) tạo thành hạt tổng hợp (hạt nhân tạo hay hạt tổng hợp) Nhưng hạt sau xử lý đường sucrose nồng độ cao Phương pháp giảm độ ẩm xuống 20 - 30% (bằng dịng khơng khí chất hút ẩm gel silica), làm đông lạnh nhanh dung dịch ni tơ lỏng Các chất dinh dưỡng bao quanh mơ kích thích mơ tái sinh sau làm tan đóng băng có lợi cho sử dụng - Đơng lạnh kính (Vitrification) Cơng trình cơng bố sử dụng đơng lạnh kính bảo quản mô thực vật năm 1989 Langis, Uragami cộng Kỹ thuật xử lý dung dịch đông lạnh đậm đặc lên mô thực vật, thời gian biến động từ 15 phút đến giờ, sau nhúng ni tơ lỏng Kết dung dịch đông lạnh dung dịch tế bào đông kết Dung dịch đơng lạnh kính gồm hỗn hợp chất bảo vệ đông lạnh thấm không thấm Chất thông thường gồm hỗn hợp dung dịch đông lạnh thực vật số (Palnt vitrification Solution-PVS2), 30% glycol, 15% DMSO 0,4M sucrose (Sakai, Kobayashi Oiyama,1990) Sau 15 năm công trình cơng bố phương pháp bảo tồn đơng lạnh kính áp dụng rộng rãi nhiều loài thực vật giới Các phương pháp khác đông lạnh giọt (Schafer-Menuhr, Schumacher MixWagner,1997), phương pháp trước nuối cấy ( Panis cộng sự,1996) Phương pháp trước nuôi cấy/khử nước ( Dumet công ,1993) đến kỹ thuật áp dụng với mức độ hạn chế 4.4.3 Ứng dụng bảo tồn đông lạnh với loài thân thảo Các loài thân thảo bảo tồn đơng lạnh có kỹ thuật đặc thù tạo dung dịch huyền phù tế bào, tạo callus, thu thập vật liệu bảo tồn mô phân sinh hay hạt phấn để đưa vào bảo tồn lạnh sâu - Bảo tồn dung dịch huyền phù tế bào callus nuôi cấy mô http://www.ebook.edu.vn 152 Những loại thường bảo tồn phương pháp lạnh chậm truyền thống, để bảo tồn đa dạng di truyền mô không tổ chức, không dài hạn, bảo tồn đặc điểm đặc thù mơ bị q trình trì In vitro thơng thường Các nghiên cứu lặp lại cho tiềm phát triển hình thái dịng callus khơng ảnh hưởng bảo quản lạnh ni tơ lỏng Hơn nữa, nghiên cứu chứng minh không ảnh hưởng đến biểu gen ngoại lai chuyển gen vào tế bào, tạo tế bào trần lúa, tái sinh tế bào ổn định chuyển gen - Đông lạnh hạt phấn Hạt phấn bảo quản hỗ trợ cho chương trình tạo giống, phân phối trao đổi nguồn gen nghiên cứu sinh lý, sinh hóa di truyền Phương pháp ứng dụng hạn chế số trung tâm bảo tồn - Bảo tồn đông lạnh mô phân sinh Mô phân sinh đỉnh phổ biến bảo tồn đông lạnh với loài sinh sản sinh dưỡng ăn quả, lấy rễ lấy củ Trong bảo tồn mơ đỉnh sinh trưởng có số lượng biến dị xô ma, nhỏ so với mô không tổ chức callus dung dịch tế bào huyền phù Những báo cáo gần đánh giá phương pháp ngang với phương pháp hạt nhân tạo/khử nước đơng lạnh kính Những nghiên cứu gần cho đánh giá khắt khe phương pháp khử nước đông lạnh, phương pháp lạnh chậm truyền thống hiệu để trì độ nguyên tế bào, hiệu trì ngun mơ cần thiết cho sống sót mơ phân sinh + Một số chất sử dụng bảo tồn đông lạnh Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Dimethyl Sulfone (DMSO2) Hydroxy-ethyl-starch (HES) Polyvinyl Pyrrolidone (PVP) Polyethylene Oxide (PEO) http://www.ebook.edu.vn 153 Propylene Glycol Ethylene Glycol Glycerol - Bảo tồn đông lạnh hạt thân thảo Hạt vật liệu bảo tồn phổ biến với trồng nông nghiệp làm vườn, hạt lồi chịu đựng q trình làm khơ ngâm ni tơ lỏng( Stanwood,1985) Bảo tồn đông lạnh hạt khơ thay phương pháp bảo tồn hạt khô truyền thống nhiệt độ -20oC Đặc biệt số lồi hạt khơ bảo tồn truyền thống vài năm sử dụng kỹ thuật kéo dài tuổi thọ hạt Hầu hết loài hạt làm khô đến độ ẩm -10% phù hợp cho bảo tồn nhiệt độ cực thấp ví dụ hạt cần tây loại hạt khơ bảo tồn đông lạnh 4.4.4 Bảo tồn đông lạnh với loài thân gỗ Đến hạt loài thân gỗ thường cho bảo tồn dài hạn, số lớn hạt loài thân gỗ sinh sản vơ tính, hạn chế bảo tồn hạt bảo tồn chủ yếu mẫu phân sinh dưỡng Số lượng nguồn gen lớn theo Gass, Tubutt Zanetto, 1996 có khoảng 30.000 mẫu nguồn gen 21 quốc gia có loại nguồn gen Bảo tồn đông lạnh chiến lược quan trọng bảo tồn nguồn gen loài thân gỗ - Bảo tồn đông lạnh mô quan loài thân gỗ Những tiến gần công nghệ nuôi cấy mô thực vật tạo số lượng lớn mô quan tồn trữ ni tơ lỏng, có ba loại mơ thực vật thân gỗ bảo tồn đông lạnh + Đỉnh sinh trưởng: đỉnh sinh trưởng - 2mm tách từ đỉnh cây, đỉnh mầm nách, đỉnh sinh trưởng nuôi In vitro + Hạt phơi phân lập với lồi tạo hạt: lồi hạt không chịu làm khô hay bán chịu làm khô bảo tồn ngân hàng gen hạt truyền thống + Dịng callus sinh phơi: tránh dịng sinh phơi tiềm cho phép tồn trữ vật liệu chuyển gen thử nghiệm đồng ruộng - Đơng lạnh kính bảo tồn lồi gỗ cứng Phương pháp đơng lạnh kính cải tiến năm gần để áp dụng bảo tồn nhiều lồi thân gỗ cứng, gọi đơng lạnh/đóng băng bước (Vitrification/one-step freezing) Khi dung dịch PVS2 giới thiệu sử dụng bảo tồn đông lạnh tế bào họ cam quýt (Sakai, Kobayashi Oiyama,1990), phương pháp áp dụng phổ biến Đến PVS2 sử dụng bảo tồn đông lạnh đỉnh sinh trưởng thành cơng nhiều lồi http://www.ebook.edu.vn 154 thân gỗ cứng lê (Pyrus), táo ( Malus Mill.) Nhiều nghiên cứu ghi nhận, ngâm mô vào PVS2 để bảo tồn lạnh, sau bảo tồn làm tan đông lạnh cho thấy tỷ lệ sống sót ảnh hưởng mạnh thời gian xử lý, thời gian phải đủ dài đủ để khử nước tế bào không gây độc tế bào Dung dịch áp dụng 25oC thời gian 20 - 120 phút Để giảm gây hại độc tố dùng dung dịch 0oC mức nồng độ 50% 30 phút, 100% 50 phút sau bảo quản ni tơ lỏng Nhiệt độ làm tan đông lạnh sau bảo tồn từ 20 - 45oC, phổ biến áp dụng 40oC Ngày bảo tồn đông lạnh cho mắt sinh dưỡng, sở kỹ thuật Sakai,1960 áp dụng bảo tồn 1915 mẫu nguồn gen táo, mắt thu thập mùa đông làm khô nhiệt độ phòng lạnh - 5oC với độ ẩm 30%; hạ nhiệt độ 1oC/giờ đến -30oC 24 sau chuyển vào môi trường ni tơ lỏng - 160oC - Bảo tồn đông lạnh với thân gỗ mềm Bảo tồn đơng lạnh đóng vai trị quan trọng chương trình chọn lọc dịng vơ tính, sở biến dị xô ma, hiệu làm lạnh chậm thành cơng ni cấy phơi nhiều lồi vân sam xanh (Pycea pungens Engelm.) , thông (Pinus) , thông rụng (Larix occidentalis Nutt.) - Bảo tồn đông lạnh trục phôi hạt thân gỗ Bảo tồn dài hạn hạt đông lạnh áp dụng với tồn hạt phơi nhiều mức nhiệt độ khác nhau, loài thân gỗ nhiệt đới Đầu tiên làm khơ đến độ ẩm 20% sau làm lạnh chậm nhúng vào ni tơ lỏng, phương pháp áp dụng phổ biến cho lồi hạt khơ, thành cơng lồi hạt bán khơ không khô Hạt họ cam quýt đa phôi nhiều phương pháp đông lạnh phát triển để bảo tồn hạt chúng 4.4.5 Tính tồn vẹn di truyền thực vật bảo tồn đông lạnh Bảo tồn đông lạnh xuất biến dị xô ma nhiều nghiên cứu phát kết nhân giống điều kiện In vitro Bảo tồn đông lạnh lại liên quan đến In vitro nhiều bước trình bảo tồn, cần thận trọng kỹ thuật để tránh biến dị xô ma xảy trước đưa vào dung dịch ni tơ lỏng Mặt khác, bảo quản tính chất đặc thù bảo tồn đơng lạnh tránh rủi ro di truyền khơng có khả tái sinh Một số rủi ro xảy hình thành rễ tự bị gây hại mức phân tử nhiệt độ cực thấp - 196oC chất bảo tồn đông lạnh nồng độ cao DMSO đến 10%, nhiên chưa có chứng minh đầy đủ biến đổi di truyền bảo tồn đông lạnh sử dụng hóa chất bảo tồn đơng lạnh 4.5 BẢO TỒN IN VITRO 4.5.1 Nguyên lý bảo tồn In vitro Mặc dù bảo tồn ngân hàng gen hạt, ngân hàng gen đồng ruộng bảo tồn Ex-situ áp dụng rộng rãi chúng có hạn chế loại hạt không chịu với q trình làm khơ, lồi sinh sản sinh dưỡng Ngân hàng gen đồng ruộng thuận tiện cho đánh giá, sử dụng thường gặp rủi ro sâu bệnh, thời tiết bất thuận Do bảo tồn In vitro phương pháp bổ sung thay để khắc phục hạn chế Kỹ thuật In vitro có tiến kiểm tra bệnh trước bảo tồn, bảo tồn số lượng lớn Một số kỹ thuật In vitro phát triển để bảo tồn loài sinh sản sinh dưỡng lồi có hạt chịu đựng làm khơ Nhìn chung, In vitro áp dụng hai phương thức http://www.ebook.edu.vn 155 - Phương thức làm chậm sinh trưởng, mẫu nguồn gen giữ dạng mô thực vật vô trùng môi trường dinh dưỡng Sinh trưởng chậm bảo tồn ngắn, trung hạn dài hạn - Đông lạnh, mẫu nuôi cấy giữ ni tơ lỏng, phương thức ứng dụng cho bảo tồn dài hạn Theo Lyndsey A Withers, 1991 mô tả thành phần hệ thống bảo tồn In vitro sau: Hình 4-14: In vitro hệ thống bảo tồn nguồn gen Ex situ (Nguồn : Lyndsey A Withers, 1991) 4.5.2 Phân loại bảo tồn In vitro - Bảo tồn dài hạn: Bảo tồn dài hạn bảo tồn ni tơ lỏng (-196oC), sở nhiệt độ ngừng tất trình trao đổi chất phân chia tế bào Bảo tồn dài hạn đông lạnh Latta sử dụng bảo tồn tế bào cà rốt năm 1971 đến kỹ thuật phát triển với kỹ thuật chủ yếu (1) Kỹ thuật truyền thống sử dụng bước đông lạnh chậm cộng thêm chất đông lạnh; (2) kỹ thuật đông lạnh với đặc điểm đông lạnh nhanh khoảng 1000oC/phút nhúng trực tiếp vào ni tơ lỏng Bảo tồn dài hạn ngân hàng gen In vitro Kỹ thuật chi tiết phương pháp trình bày phần 3.4 Bảng 4-8 : Kỹ thuật bảo tồn đông lạnh ni tơ lỏng -196°C Các bước Các kỹ thuật truyền thống Kỹ thuật Làm khô Đông kết đá + Bọc Xử lý trước đường +/Sucrose Chất đông kết Làm khô Bọc /khử nước + (+ABA) + + ++++ + http://www.ebook.edu.vn + 156 Đông lạnh chậm + 0°C đến -40°C (0.3 đến 1°C/phút) Đông lạnh nhanh -40°C đến -196°C (200°C/phút) +25°C đến - +25°C đến -196°C +25°C đến -196°C 196°C (400 đén (720°C/phút) (720°C/phút) 1100°C/phút) Làm tan đông lạnh 500°C/phút 120°C/phút 120°C/phút 120°C/Phút Nguồn : Uragami (1993), Malaurie et al (1998a) - Bảo tồn trung hạn Các điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn sử dụng bảo tồn trung hạn lồi sinh trưởng chậm Điều kiện mơi trường mơi trường ni cấy giảm sinh trưởng thực vật nuôi cấy mô tế bào Điều kiện môi trường áp dụng chung giảm nhiệt độ đến từ - 5oC giảm ánh sáng, khơng có ánh sáng có tác dụng làm chậm sinh trưởng Cải tiến môi trường nuôi cấy có tác dụng làm chậm sinh trưởng vật liệu bảo tồn Bảo tồn trung hạn coi ngân hàng gen, gọi ngân hàng gen In vitro hoạt động Bảo tồn trung hạn nuôi cấy In vitro điều kiện chậm sinh trưởng số kỹ thuật tác động như: (1) Tác động làm chậm giai đoạn sinh lý; (2) Bổ sung thêm tác nhân chậm sinh trưởng vào môi trường; (3) Nhiệt độ thấp; (4) Nồng độ đường sucrose vi lượng thấp; (5) Áp suất ô xy thấp; (6) Bọc chất gơm(alginate) có cơng thức hóa học (C6H8O6)n - Bảo tồn ngắn hạn Bảo tồn ngắn hạn: ni cấy In vitro điều kiện sinh trưởng bình thường phù hợp với bảo quản ngắn hạn phân phối nguồn gen 4.5.3 Những kỹ thuật bảo tồn In vitro Thu thập In vitro Để bảo tồn In vitro từ khâu thu thập thực kỹ thuật phù hợp trình bày chi tiết chương thu thập nguồn gen (phương pháp thu thập In vitro) Sau thu thập tiến hành chuyển mẫu thu thập sang môi trường nuôi cấy In vitro có thêm chất chậm sinh trưởng Nhiều nghiên cứu cho kết mơi trường MS- sắt 138 có tác dụng chậm sinh trưởng với nhiều loài trồng củ mỡ, cà phê Vật liệu bảo tồn In vitro Bảo tồn In vitro gồm bảo tồn callus, chồi, mầm tạo từ mắt đỉnh sinh trưởng điều kiện tố môi trường, buồng nuôi cấy giá thể (môi trường nuôi cấy), điều kiện vô trùng không ảnh hưởng đến sức sống nguồn gen Phương pháp nuôi cấy In vitro thực theo tiêu chuẩn kỹ thuật môi trường tiêu chuẩn với loài trồng Xử lý bệnh Giai đoạn thu thập giai đoạn kỹ thuật khác phương pháp bảo tồn In vitro, lựa chọn vật liệu, khử trùng bệnh virus kỹ thuật quan trọng đảm bảo bảo tồn thành cơng Ví dụ sơ đồ làm bệnh khoai tây bảo tồn In vitro CIP minh họa hình 4-15 http://www.ebook.edu.vn 157 Hình 4-15: Các bước làm virus bảo tồn nguồn gen khoai tây In vitro Chất làm chậm sinh trưởng Sinh trưởng chậm kỹ thuật cho phép vật liệu vơ tính thực vật sinh trưởng hay phát triển chậm, chất hỗ trợ bảo tồn - 15 năm điều kiện nuôi cấy mô ni cấy định kỳ, tùy theo lồi trồng Một số kỹ thuật làm chậm sinh trưởng khác để trì bảo tồn, hầu hết kỹ thuật nhiệt độ thấp kết hợp với cường độ ánh sáng yếu tối để hạn chế sinh trưởng Nhiệt độ phạm vi từ - 5oC với loài nguồn gen chịu lạnh, loài nhiệt đới nhiệt độ 15 - 20oC Cũng làm chậm sinh trưởng cải tiến môi trường nuôi cấy, chủ yếu giảm hàm lượng đường nguyên tố vi lượng xy phịng bảo tồn, phủ lên khối mô dung dịch dầu vi lượng (Withers Engelmann,1997) Yếu tố vi lượng có tác dụng chậm sinh trưởng nhiều nghiên cứu công bố sắt 138 với nồng độ 100 - 200 mg/lít có hiệu Ví dụ nghiên cứu bảo tồn nguồn gen củ mỡ môi trường dinh dưỡng vi lượng đường sucrose thấp hầu hết mẫu nguồn gen trì năm Sử dụng chất gây bất thuận đưa vào môi trường nuôi cấy làm chậm sinh trưởng manitol, sorbitol, đường sucrose, chất hạn chế sinh trưởng hiệu Một số chất điều tiết sinh trưởng có khả làm chậm sinh trưởng ABA , Phosphon-D, succinic a xít Làm chậm sinh trưởng bảo tồn In vitro sử dụng kỹ thuật riêng rẽ kết hợp tất kỹ thuật Phương pháp làm chậm sinh trưởng ứng dụng rộng với nhiều loài, sử dụng để bảo tồn nguồn gen số loài chuối, khoai tây, khoai lang, sắn, củ mỡ số loài nhiệt đới Theo FAO, 1996 có khoảng 37.600 mẫu nguồn gen bảo tồn In vitro toàn cầu - Đánh giá kiểm tra trình bảo tồn Đánh giá vệ sinh mức độ vô trùng buồng bảo tồn, mức độ ổn định biến dị di truyền vật liệu bảo tồn thực định kỳ, ni cấy In vitro xuất biến dị xô ma Những đặc điểm khác mức độ sinh trưởng chậm, hình thành callus, chiều dài thân, xuất rễ tình trạng bệnh nguồn gen bảo tồn đánh giá Định kỳ đánh giá theo tháng năm Thời gian bảo tồn In vitro phụ thuộc vào loài vật liệu bảo tồn thực thay đổi môi trường - năm thay lần http://www.ebook.edu.vn 158 4.6 BẢO TỒN HẠT PHẤN Bảo tồn hạt phấn phát triển để điều khiển thụ phấn kiểu gen nở hoa khơng đồng bộ, đặc biệt lồi ăn (Alexander Ganeshan,1993) Bảo quản hạt phấn xem công nghệ bảo tồn nguồn gen (Harrington,1970, Roberts, 1975, Withers,1991) Hạt phấn thu thập dễ ràng với số lượng lớn phạm vi nhỏ, vấn đề thay đổi nguồn gen qua hạt phấn nhỏ so với mô, hạt…Những năm gần kỹ thuật bảo tồn lạnh phát triển để bảo tồn hạt phấn cho số loài tăng lên (Towill,1985, Hanna Twill, 1995), ngân hàng đông lạnh bảo quản hạt phấn số loài ăn xây dựng số nước 4.7 NGÂN HÀNG DNA Nguyên lý dự trữ DNA đơn giản, dễ áp dụng phạm vi rộng chi phí thấp Q trình cơng nghệ di truyền phá vỡ tế bào loài chi sử dụng chuyển gen (Council,1993) thực vật, chuyển gen nhờ virus, vi khuẩn, nấm chuột Những cố gắng hướng đến thiết lập ngân hàng DNA, bảo quản tồn thơng tin gen nơm nguồn gen (Mattick cs,1992) Mặc dù chiến lược phương pháp cần hoàn thiện bảo tồn PGR tương lai 4.7.1 Những ngân hàng DNA có giới Thu thập bảo tồn ngân hàng DNA với mục tiêu bảo tồn độc quyền Frozen Zoo bắt đầu 25 năm trước (Benirschke,1984) ngày có gần 7.000 vật liệu di truyền loài động vật hoang dã bị đe dọa Một số Viện nghiên cứu tập hợp tài liệu hóa mẫu DNA nguồn di truyền thực vật (PGR), trì hầu hết mẫu nguồn gen quan trọng Vườn thực vật Hoàng gia Vương quốc Anh lưu trữ 20.000 mẫu DNA đại diện cho tất họ thực vật Vườn thực vật Missouri Hoa Kỳ lưu trữ 20.000 mẫu mô thực vật cung cấp cho nhà nghiên cứu để tách chiết DNA sử dụng nghiên cứu bảo tồn Ngân hàng DNA Australia trường Đại học chữ thập đỏ miền Nam bảo tồn thông tin di truyền cỏ Australia Ngân hàng DNA viện khoa học sinh học nông nghiệp Ibaraki quốc gia Nhật Bản Bảo tồn ngân hàng DNA không phục vụ bảo tồn tài ngun di truyền thực vật mà cịn phục vụ nghiên cứu khác nghiên cứu chức gen, tiến hóa, phân loại dịch tễ học thực vật 4.7.2 Bảo tồn DNA giới Phân tích kết nghiên cứu cho thấy, nhìn chung tồn trữ DNA khơng phổ biến bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật, thực tế có khoảng 20% tổng số nguồn gen tồn trữ DNA 79% Viện không bảo tồn DNA vấn đề ngân sách, thiếu trang thiết bị cán kỹ thuật cho bảo tồn Mặc dù vậy, 57% cho có kinh phí dài hạn đảm bảo tồn trữ DNA ổn định nguồn gen Bảo tồn DNA hạn chế thông tin, 84% Viện nghiên cứu bảo tồn DNA cho biết họ cần nhiều thông tin bảo tồn DNA, 42% viện không bảo tồn DNA với lý quan trọng thiếu thông tin Tính chất pháp lý cho bảo tồn trao đổi DNA vấn đề trở ngại sử dụng phương pháp nguồn tài cung cấp cho bảo tồn Nhu cầu hợp tác tiêu chuẩn hoạt động ngân hàng DNA, tạo sở liệu với thông tin đầy đủ có khả tiếp cận rộng rãi Các nước phát triển cho biết, bảo tồn DNA http://www.ebook.edu.vn 159 vướng mắc pháp lý, trách nhiệm chi phí áp dụng phương pháp bảo tồn DNA Trên 50% Viện nghiên cứu có bảo tồn DNA Viện nghiên cứu Quốc gia, kể Viện nước phát triển nước phát triển thiếu trang thiết bị nguồn cung cấp khác Tại Hoa Kỳ hầu hết Viện nghiên cứu cam kết bảo tồn DNA ngân hàng gen tài nguyên di truyền thực vật (8 viện), sau Vương quốc Anh viện, Colombia, Đức, Nhật Bản nước viện, Austalia, Canada, Cộng hòa Czech, Ấn Độ Israel nước viện Những Viện cung cấp DNA cung cấp thông tin mẫu DNA In vitro có địa trình bày sau: USDA Oregon, USA: http://www.ars-grin.gov/cor; NISA, Japan : http://www.dna.affrc.go.jp; có địa tại: DNA Bank; National Institute of Agrobiological Sciences;2-1-2 Kannondai, Tsukuba, Ibaraki 305-8602, Japan Chủ yếu ngân hàng DNA lúa lợn Australian DNA bank: http://www.dnabank.com.au 4.7.3 Kỹ thuật chủ yếu tách tồn trữ DNA - Tách chiết DNA Hầu hết Viện nghiên cứu (98%) tự tách chiết DNA để tồn trữ, sử dụng phương pháp tài liệu hướng dẫn có cải tiến, 1/3 dùng Kit thương mại để tách chiết DNA, 4% sử dụng Kit thương mại quyền Các nước phát triển chủ yếu sử dụng Kit thương mại, 100% Viện nghiên cứu Châu Phi Trung Đông phụ thuộc vào tài liệu hướng dẫn tách chiết Mặt khác Bắc Mỹ Tây Âu nửa số Viện tiếp cận Kit 15 – 20% sử dụng Kit quyền Nhìn chung, bảo tồn DNA phương thức : (1) Trung hạn (6 tháng đến năm nhiệt độ -20oC -70oC), (2) Bảo tồn dài hạn năm nhiệt độ -70oC (3) có 1/3 tồn trữ ngắn hạn tháng Một nửa (45%) tồn trữ DNA để cung cấp cho đơn vị khoa học khác, 69% Viện đồng ý cung cấp DNA nên bao gồm chi phí vật liệu chi phí vận chuyển, nguồn cung cấp ngồi số liệu ban đầu cần cung cấp bổ sung thêm thơng tin cần thiết khác Chất lượng DNA (khối lượng phân tử tính xác thực chuỗi DNA) định giá trị khảo sát genome Cán quản lý ngân hàng DNA bảo tồn vật liệu cần gắn với bảo tồn liệu liên quan đến vật liệu bảo tồn tính trạng gốc, tài liệu thơng tin khác Các sách, thể chế phải thiết lập để chuẩn hóa bước: thu thập mẫu DNA, tách chết, mơ tả đặc điểm, phân phối, tồn trữ Những bước chuẩn hóa cho phép đánh giá chất lượng DNA hiệu tồn trữ chúng qua thời gian Chất lượng tách chiết DNA từ mẫu thực vật phụ thuộc vào điều kiện mẫu trước tồn trữ, môi trường tồn trữ thời gian tồn trữ Cần tuân thủ hướng dẫn thu thập, tồn trữ, vận chuyển mẫu từ thực địa phịng thí nghiệm nghiên cứu bảo tồn - Thông tin cần thiết bảo tồn DNA Số lượng chất lượng DNA, kỹ thuật tách chiết marker phân tử sử dụng, chuỗi thông tin, tài liệu tham khảo xuất liên quan đến DNA loài, mẫu gốc, liên kết với ngân hàng gen Một danh sách chuỗi DNA “Mã hóa DNA” sử dụng đăng ký bảo tồn đa dạng đăng ký mẫu nguồn gen thông thường khác Nếu sử dụng đăng ký việc tiếp cận thông tin bảo tồn ngân hàng DNA thuận tiện http://www.ebook.edu.vn 160 Một lợi ích của kỹ thuật genome nhanh, đáng tin cậy, đặc điểm hóa xác so sánh qua giai đoạn sống qua loài Ngân hàng DNA trở thành thư viện tham khao chuỗi sử dụng đánh giá đa dạng di truyền thay đổi mối quan hệ quần thể nhận biết mẫu kiểu hình bị hư hỏng Thách thức tồn trữ DNA ngày cung cấp sản phẩm phải chịu trách nhiệm với dự báo sử dụng tương lai, phải cân đối nhu cầu sử dụng với khả Viện để cung cấp vật liệu hiệu từ nguồn gen bảo tồn Ex situ Cũng bảo tồn vật chất sống khác (hạt, mô, phận sinh dưỡng), mục tiêu bảo tồn sử dụng, việc mã hóa giúp cho người sử dụng tiếp cận nhanh chóng thuận lợi mẫu nguồn gen phương thức bảo tồn DNA Để mơ tả mã hóa người ta sử dụng phương pháp mã vạch DNA (DNAbar-coding), dựa thông thường marker tiêu chuẩn để nhanh chóng nhận biết tất lồi (Hebert cộng sự, 2003) 4.7.4 Ngân hàng DNA bảo tồn bổ sung Ehsan Dulloo, Yoshaiki Nagamura Oliver Ryder, 2006, đề xuất chiến lược bảo tồn bổ sung: DNA hình thức chi phí có hiệu cho bảo tồn nguồn gen phụ thuộc vào mục tiêu bảo tồn hình thức sử dụng Nhiều lồi trồng khó bảo tồn phương thức truyền thống (hạt phận sinh dưỡng) loài hoang dại bị đe dọa tuyệt chủng Tồn trữ DNA cung cấp cho hướng sử dụng để bảo tồn đa dạng loài quần thể chúng ngắn hạn, đến phương pháp hiệu phát triển Khảo sát tồn trữ sử dụng DNA IPGRI năm 2004 cho thấy: + Tồn trữ DNA không kỹ thuật phổ biến + Các Viện bảo tồn DNA để bảo tồn lồi mục tiêu Nó lâu dài để ghi nhận rằng: khơng có kỹ thuật bảo tồn đơn lẻ bảo tồn đa dạng loài mục tiêu vốn gen mục tiêu Có hai cách tiếp cận bảo tồn gọi In situ Ex situ, hai quan trọng để thực bảo tồn sử dụng đa dạng di truyền, khơng có cách cách Khái niệm tiếp cận “bảo tồn bổ sung” (complementary conservation) nêu Các nhà khoa học sử dụng thuật ngữ khác để mô tả phương pháp tiếp cận này, nhà bảo tồn thiên nhiên gọi “bảo tồn tổng hợp” ( Falk,1987,1990), nhà bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật gọi “ chiến lược bảo tồn bổ sung”, nhiên hai cách gọi nguyên lý khái niệm Chiến lược bảo tồn bổ sung định nghĩa “ phối hợp hoạt động bảo tồn khác nhau”, hoạt động hướng đến sử dụng bền vững, tối ưu đa dang di truyền có vốn gen mục tiêu, cho tương lai (Dulloo cs, 2005) Khái niệm xác định bảo tồn đa dạng di truyền khơng lợi ích cho bảo tồn mà cho cho sử dụng 4.7.5 Luật pháp quốc tế ngân hàng DNA Gần nửa (43%) vụ kiện cung cấp DNA cung cấp DNA tình trạng khác liên quan đến việc khơng có thỏa quyền sở hữu vận chuyển quốc tế mẫu DNA : Công ước đa dạng sinh học (Convention on biological diversity) [CBD], Thỏa ước quốc tế nguồn tài nguyên di truyền thực vật (International Treaty on plant genetic resource for food and agriculture [IT], Quyền sở hữu trí tuệ quốc tế (International Property Rights) [IPR] Chỉ chế thứ ( 25%) xây dựng sách thống Hầu hết hình thức thỏa thuận trao đổi vật liệu (Material transfer agreements)[MTA] Các MTA tương ứng với quy định quốc tế, quốc gia yêu cầu ký kết trước trao đổi nguồn gen, để hỗ trợ trao đổi nguồn gen PGR bảo vệ từ IPR http://www.ebook.edu.vn 161 Nghiên cứu mơ hình ngân hàng DNA để nâng cao quản lý, phân phối sử dụng bảo tồn Ex situ nguồn tài ngyên di truyền thực vật Ứng dụng công nghệ sinh học tiến nhanh, tăng nhanh số lượng nguồn DNA thông tin liên quan Chiến lược xây dựng tiêu chuẩn phương pháp trì DNA phát triển mẫu hạt, mô thực vật thu thập nguồn gen trường Tuy nhiên vấn đề cần nghiên cứu bảo tồn DNA nào? số lượng DNA bảo tồn, tiêu chí tiêu chuẩn tối thiểu chất lượng DNA trì qua thời gian Tài liệu hóa mẫu DNA trao đổi chúng vấn đề cần nghiên cứu 4.8 VƯỜN THỰC VẬT Có khoảng 1.500 vườn thực vật giới (WWF-IYCN-BGCS,1989), mục đích gồm (i) trì sinh thái cần thiết cho hệ thống hỗ trợ sống; (ii) bảo tồn đa dạng di truyền; (iii) đảm bảo sử dụng bền vững loài hệ sinh thái Mặc dù vườn thực vật có số hạn chế phạm vi bảo tồn nhân giống, khả lớn Câu hỏi ơn tập chương Khái niệm bảo tồn ngoại vi, phương pháp bảo tồn ngoại vi chủ yếu, ưu nhược điểm phương pháp Các loại ngân hàng gen hạt, sơ đồ hoạt động ứng dụng Phương pháp thu mẫu đăng ký mẫu cho bảo tồn ngân hàng gen hạt Độ phương pháp làm mẫu nguồn gen cho bảo tồn ngân hàng hạt Độ ẩm phương pháp xác định độ ẩm mẫu hạt bảo tồn ngân hàng hạt Phương pháp kiểm tra chất lượng nguồn gen trước bảo tồn Đóng bao quản lý nguồn gen kho bảo tồn Nguyên lý bảo tồn ngân hàng gen đồng ruộng Chọn điểm thu mẫu cho bảo tồn ngân hàng gen đồng ruộng 10 Bố trí xắp xếp quản lý ngân hàng gen đồng ruộng 11 Đánh giá đặc điểm ngân hàng gen đồng ruộng 12 Bảo tồn đơng lạnh, có sở lý thuyết bảo tồn đơng lạnh 13 Kỹ thuật bảo tồn đông lạnh 14 Ứng dụng bảo tồn đông lạnh với thân thảo, thân gỗ 15 Phương pháp bảo tồn In vitro 16 Bảo tồn ngân hàng DNA http://www.ebook.edu.vn 162 ... Dưa chuột(Cucumis) Bí(Cucurbita) Đậu ( Phaselus) Rau diếp (Lactuca) Cao lương ( Sorghum) Cà rốt (Daucus) Ngô (Zea) Cà chua ( Lycopersicon) Đậu mỏ ( Cicer) Lúa ( Oryza) Dưa hấu (Citrullus) Làm khô... ích cho bảo tồn hai hướng bảo tồn Ex situ nguồn gen quý bảo tồn sinh trưởng chậm bảo tồn đông lạnh Bảo tồn đông lạnh hay bảo tồn lạnh bảo tồn nhiệt độ cực thấp -1 96oC (nhiệt độ ni tơ lỏng), ứng... nhiệt độ độ ẩm kho bảo tồn trình bày bảng 4- 5 Bảng 4- 5 : Nhiệt độ độ ẩm kho bảo tồn Nhiệt độ (oC) 25 20 15 10 Các đặc điểm kho Nghèo ( hành) Tốt ( lúa mạch) Độ ẩm ( % độ ẩm bản) 3,0 7,0 3,5 7,5