CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM, NUÔI CẤY, PHÂN LẬP, CHẨN ĐOÁN NẤM – PHẦN 1 4.1. Kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm: Trong la bo xét nghiệm chẩn đoán nấm thì công việc lấy mẫu rất quan trọng, phục vụ cho việc xét nghiệm trực tiếp hoặc cho nuôi cấy phân lập. Kết quả xét nghiệm phụ thuộc vào cách lấy mẫu từ bệnh nhân. + Những điều cần lưu ý: - Khi sử dụng những dụng cụ lấy mẫu cần phải tiệt trùng để tránh nhiễm khuẩn hoặc nấm mốc từ môi trường xung quanh, nếu không sẽ gây khó khăn cho việc xét nghiệm cũng như nuôi cấy. - Khoảng 10 ngày trước khi lấy mẫu bệnh nhân không được sử dụng thuốc chống nấm. - Khi soi phải quan sát ít nhất 30 vi trường trước khi kết luận. + Kỹ thuật lấy bệnh phẩm ở các vị trí khác nhau: - Bệnh phẩm ở da: cạo lấy phần da cạnh chỗ bị nhiễm, trên bờ viền thường cho kết quả tốt. Ngoài ra có thể sử dụng một loại băng dính đặt vào chỗ da nhiễm nấm (như lang ben) rồi kéo ra soi hoặc cho vào môi trường nuôi cấy, kết quả thường cao hơn phương pháp cạo vẩy khoảng 10%. - Bệnh phẩm ở ngón chân: có thể dùng kéo, kẹp hoặc đầu mũi dao tù cạo lấy mẫu từ chỗ da ngón chân bị nhiễm. Trong trường hợp da ngón chân không bị nứt nẻ thì cần lấy những phần vẩy da đang bong để xét nghiệm. - Bệnh phẩm ở móng tay: cần cạo móc lấy những mảnh vụn tơi ở dưới móng bằng một dụng cụ có đầu tù để tránh bị đau. - Bệnh phẩm ở tóc, ở da đầu: cắt lấy một ít tóc, nhổ chân tóc hoặc cạo ít vẩy da ở chỗ bị nhiễm nấm xét nghiệm. 4.2. Phương pháp soi bệnh phẩm trực tiếp trong dung dịch KOH 20-30%: + Các bệnh phẩm là sợi tóc, mẩu vụn móng tay, vẩy da được đặt lên lam kính có 1 - 2 giọt dung dịch KOH 20%, hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn, dưới tác dụng của kiềm và nhiệt những đám tế bào da sẽ tách rời nhau. + Trường hợp bệnh phẩm có nấm thì sẽ dễ dàng quan sát thấy những sợi nấm, những bào tử đốt (arthrospora) sẽ tản ra dễ phân biệt với những tế bào của động vật. Tuy nhiên cần phải chú ý phân biệt những hạt dạng sợi, hạt mỡ, những tế bào sừng với tế bào nấm để tránh nhầm lẫn trong khi xét nghiệm. Kết quả soi trực tiếp xem hình 4.1. Hình 4.1: Những sợi nấm trong bệnh phẩm xét nghiệm trực tiếp. 1. Ở vẩy da; 2. Ở móng. 4.3. Phương pháp nuôi cấy, định loại nấm da: + Môi trường cơ bản Sabouraud nuôi cấy chẩn đoán nấm da: Bằng phương pháp xét nghiệm trực tiếp soi bệnh phẩm dưới kính hiển vi chỉ cho biết có nấm hay không nhưng không thể biết đó là loài nấm gì, vì vậy cần phải tiếp tục nuôi cấy để phân lập nấm và định danh. Môi trường hay dùng nhất là môi trường Sabouraud, thường nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, sau 1-2 tuần quan sát sự phát triển của nấm có thể xác định loài. Trên thực tế tỉ lệ giữa triệu chứng lâm sàng, kết quả soi trực tiếp và nuôi cấy là 3 : 2 : 1 (3 trường hợp có triệu chứng lâm sàng soi trực tiếp dương tính 2 và nuôi cấy dương tính 1). Thành phần môi trường: Pepton 10 gam. Glucoza 40 gam. Thạch (oxoid) 10 gam. Nước cất vừa đủ 1000 ml. + Môi trường Sabouraud có kháng sinh: Khi phân lập nấm da thường có các vi khuẩn và nấm hoại sinh phát triển do vậy thường sử dụng môi trường Sabouraud có chứa kháng sinh thích hợp ức chế sự phát triển của vi khuẩn và các nấm mốc khác, chỉ cho nấm da phát triển. Để ngăn cản vi khuẩn có trong bệnh phẩm người ta thường cho vào môi trường Sabouraud kháng sinh. - Môi trường Sabouraud có penicilin, streptomycin và actidion: tiệt trùng môi trường trong nồi hấp ở nhiệt độ 120 0 C trong 10-15 phút, để nguội khi nhiệt độ còn khoảng 50 0 C cho 250.000 đơn vị penicilin, 250 mg streptomycin và 500 mg actidion vào quấy đều, đóng vào ống nghiệm hoặc hộp lồng. Môi trường này được dùng để cấy những mẫu bệnh phẩm vào để phân lập xác định nấm da. - Môi trường Sabouraud có cloramphenicol và desertomycin: thành phần môi trường Sabouraud như trên. Sau khi hấp tiệt trùng xong cho 50 mg cloramphenicol và 500 mg desertomycin vào quấy đều rồi cho vào ống nghiệm hoặc hộp lồng. Có thể cho vào trước khi tiệt trùng trong nồi hấp cũng được vì hai chất này chịu nhiệt. Sử dụng môi trường này cũng giống như môi trường trên. - Môi trường Mycosel: . Thành phần: Pepton 10 gam. Glucoza 10 gam. Thạch 15 gam. Cycloheximid 0,4 gam. Cloramphenicol 0,05 gam. Nước cất vừa đủ 1000 ml. . pH của môi trường sau khi tiệt trùng là 6,9. Cloramphenicol bền vững với nhiệt nên được cho vào trong môi trường rồi tiệt trùng 121 0 C trong 15 phút. Sau khi môi trường nguội khoảng 45-50 0 C thì cho actidion vào. Actidion được hoà tan trong etanol hoặc aceton, lọc qua phễu lọc cản trùng rồi đưa vào môi trường trên, lắc đều và cho vào ống nghiệm để nghiêng hoặc vào hộp lồng. Môi trường bảo quản trong tủ lạnh dùng dần. + Nutritional test: Nhiều loại nấm da cần một số chất như thiamine, inositol, histidine hoặc axit nicotinic để phát triển. Người ta đã ứng dụng tính chất này vào định loại nấm bằng cách cho vào môi trường cơ sở (thạch casamino axit, ammonium nitrate) những vitamine hoặc những amino axit trên, môi trường cơ sở được dùng làm chứng. Khi nuôi cấy, nấm da sẽ phát triển khi có chất thích hợp (bảng 9). Bảng 9: Sự phát triển của nấm trên nutritional test medium. Môi trường casamino acid Môi trường ammonium nitrate Loài * 1 2 3 4 * 5 T. verrucosume 84% 0  4+ 0 0 T. verrucosume 16% 0 0 4+ 4+ 0 T.schoenleinii 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ T.concentricum 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ T.violaceum   4+ 4+  T.tonsurans   4+ 4+  T.rubrum 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ T.mentagrophytes 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ T.equinum 0 0 0 0 4+ T.equinum Chủng New Zealand 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ T.soudanense 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 0 0 T.megninii 2+ 0 4+ T.gallinae 3+ 4+ 4+ *. Base medium: môi trường cơ sở. 1. Thêm inositol. 2. Thêm inositol thiamine. 3. Thêm thiamine. 4. Thêm nicotinic acid. 5. Thêm histidine. + Môi trường DTM (Dermatophyte Test Medium): dùng để xét nghiệm một mẫu bệnh phẩm nghi ngờ có nấm da hay không. Khi nuôi cấy nấm da trong môi trường này ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần, nếu môi trường chuyển màu từ đỏ sang vàng là nấm da. - Thành phần môi trường: Phytone 10 gam. Glucose 10 gam. Thạch 20 gam. Dung dịch đỏ phenol 40 ml. HCl 0,8 N 6 ml. Cycloheximid 0,5 gam. Gentamycin sulfat 0,1 gam. Chlortetracycline HCl 0,1 gam. Nước 1000 ml. - Cho phenol, glucose, thạch vào nước, đun sôi để hòa tan thạch. Cho 40 ml dung dịch đỏ phenol vào trong khi đang lắc (0,5 gam đỏ phenol hòa tan trong 15 ml NaOH 0,1N, bổ sung thêm nước vừa đủ 100 ml). Cho 6 ml axit HCl, hòa tan 0,5 gam cycloheximid trong 2 ml acetone và cho vào môi trường đang nóng trong khi lắc. Hòa tan vừa đủ gentamycin bột trong 2 ml nước để tạo thành nồng độ trong môi trường là 100 g/100 ml. Tiệt khuẩn môi trường trong 10 phút ở nhiệt độ 121 0 C và để nguội đến 47 0 C. Hòa tan 0,1 gam chlortetracycline HCl trong 25ml nước tiệt trùng, tiệt khuẩn, bổ sung vào môi trường, lắc kỹ để thuốc hòa đều trong môi trường. Rót ra hộp lồng, nếu chưa dùng ngay cần để vào trong tủ lạnh. 4.4. Phương pháp phân lập nấm da từ đất: Vanbreuseghem đã đưa ra phương pháp phân lập nấm da từ đất bằng cách dùng tóc người hoặc lông của động vật (như bờm ngựa) để “bẫy nấm”. Phương pháp này được coi là hoàn thiện nhất và được nhiều nhà nghiên cứu nấm da ứng dụng. Từ khi phương pháp này ra đời ngừơi ta đã tìm thấy thêm một số loài nấm da mới như T.georgiae, T.longifusum, T.vanbreuseghemii, T.gloriae và số dạng sinh sản hữu tính của nấm da cũng được phát hiện ngày càng nhiều. Cách thực hiện: + Chuẩn bị tóc: lấy một ít tóc trẻ em rửa mỡ (bằng ether, acetone hay cồn), cắt nhỏ thành những đoạn 1 cm, để tóc vào hộp lồng đậy nắp và tiệt trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 120 0 C/ 10-15 phút. Tóc đã xử lý như vậy có thể để hàng năm. + Cách lấy mẫu: đất để phân lập có thể là đất cày bừa, đất hoang, đất đồi, đất vườn…. Gạt lớp đất ở phía trên và lấy ở lớp đất phía dưới sâu khoảng 3 cm đựng vào dụng cụ vô trùng. + Nuôi cấy: đất cho vào hộp lồng mỗi hộp khoảng 20-30 gam đất. Trường hợp đất khô cần làm ẩm bằng một ít nước cất vô trùng (2-4 ml). Đặt vào phía trên mặt đất một lớp tóc người đã cắt nhỏ. Sau đậy nắp hộp lồng, đặt vào chỗ tối và để ở nhiệt độ phòng khoảng 20-25 0 C, hàng tuần kiểm tra xem nấm mọc chưa. + Kết quả: thường sau 3-4 tuần nấm phát triển tốt trên các sợi tóc, màu hơi trắng hoặc hơi vàng nâu tùy thuộc từng loài nấm (hình 4.2). Trong một số trường hợp dạng sinh sản hữu tính cũng được hình thành trên những sợi tóc. Khi có nấm mọc thì ta dùng kẹp lấy một vài sợi tóc có nấm mọc đặt lên lam kính có một giọt nước hay lactophenol, đậy lamen rồi soi dưới kính hiển vi, dựa vào hình dạng của nấm có thể định danh được loài nấm da. Tuy nhiên ta cần nuôi cấy nấm trên vào môi trường Sabouraud có chứa kháng sinh để tiếp tục định danh nấm. [...].. .1 2 Hình 4.2: Nấm da phân lập từ đất, theo phương pháp bẫy tóc 1 M.gypseum, phát triển sau 5 tuần 2 T.ajelloi, phát triển sau 5 tuần 4.5 Phương pháp nuôi cấy vi thể trên lam kính (microculture): Ballagi đã đưa ra phương pháp nuôi cấy nấm trên lam kính để nghiên cứu các cơ quan khác nhau của nấm như các cơ quan sinh sản vô tính và các cơ quan khác Do đó, người ta đã nghiên cứu nấm một cách rõ... được 4 .11 Chẩn đoán nấm da bằng phản ứng miễn dịch: Phản ứng miễn dịch thường được ứng dụng để chẩn đoán, phát hiện, phân loại một số nấm gây bệnh hệ thống như Candida albicans, Aspergillus, Histoplasma capsulatum… Với nấm da việc ứng dụng các phản ứng miễn dịch để chẩn đoán còn hạn chế do tính đặc hiệu thấp Theo một số tác giả, bằng thực nghiệm trên động vật thấy kháng nguyên của các loài nấm da ít... Cho đến nay ứng dụng phương pháp này trong chẩn đoán còn hạn chế vì phản ứng không đặc hiệu nhưng có thể ứng dụng phân biệt các chi nấm da với nhau * Phương pháp miễn dịch điện di trên thạch: phương pháp này có độ nhậy cao hơn + Cách chuẩn bị lam kính thạch giống như phương pháp trên + Tiến hành: - Sau khi có phiến kính thạch ta dùng một dụng cụ đục lỗ thành hai hàng, mỗi lỗ cách nhau 4 mm chạy dọc... chỉ có tính đặc hiệu chi Phương pháp thường được sử dụng là phương pháp khuếch tán miễn dịch và điện di miễn dịch * Chuẩn bị kháng nguyên và kháng thể: + Điều chế kháng nguyên (antigen) của nấm da: - Thành phần môi trường nuôi cấy: Glucoza Pepton Nước cất vừa đủ 20 gam 10 gam 10 00 ml Tiệt trùng bằng nhiệt độ 12 00C trong 10 phút, để nguội - Dùng que cấy cấy nấm muốn kiểm tra vào các bình nón có chứa môi... áo quan sát rất rõ 4.7.7 Phương pháp PAS nhuộm nấm ở tổ chức: Khi nhuộm tổ chức theo phương pháp hematoxylin thường không thấy rõ nấm, muốn phân biệt nấm với các tổ chức khác của cơ thể người hoặc động vật người ta thường nhuộm tiêu bản với thuốc nhuộm Schiff (còn gọi là PAS) + Các bước chuẩn bị thuốc nhuộm: - Dung dịch axit Periodic (HJO4) 1% : (HJO4) 1% Nước cất vừa đủ 10 0 ml Dung dịch cần bảo quản... nhuộm Schiff + Kết quả: nấm có màu đỏ còn các tế bào của tổ chức da sẽ có màu xanh Trên cơ sở gây nhiễm thực nghiệm người ta sẽ biết khả năng gây bệnh của các loài nấm da và kết quả hỗ trợ cho việc phân biệt các loài với nhau 4 .10 Phân biệt nấm da dưới kính hiển vi điện tử: Trong những năm gần đây người ta đã sử dụng kính hiển vi điện tử để quan sát hình dạng hoặc siêu cấu trúc của nấm da Trên cơ sở sự... dịch amindo 10 -15 phút - Đặt các lam kính vào dung môi metanol-axit acetic-nước theo tỉ lệ 5:4 :1 trong thời gian 10 phút, để khô và đọc kết quả + Kết quả: nếu phản ứng dương tính thì sẽ có vết hình cung màu xanh đen xuất hiện, nếu âm tính thì không có những vết dạng hình cung Từ đó có thể kết luận về khả năng gây miễn dịch của nấm da + Trong lâm sàng có thể chẩn đoán nấm khi có kháng nguyên nấm chuẩn... xilon trong 1 phút - Cuối cùng nhỏ 1 giọt gôm Canada lên lam kính rồi đặt lamen nhỏ, mỏng lên trên, tiêu bản có thể giữ hàng năm + Kết quả: khi soi nấm bắt màu đỏ, tế bào của tổ chức bắt màu xanh 4.8 Phương pháp phân biệt bào tử lớn với các cơ quan khác của nấm: + Thuốc nhuộm: Dung dịch axit Fuchin trong lactophenol Dung dịch Lichgrun 1% + Cách nhuộm: - Cố định chất nấm trên lam kính bằng cồn methylic... bản, để yên 1- 2 giờ - Tráng tiêu bản vào dung dịch axit sulfuric 1- 2 phút - Nhúng tiêu bản vào dung dịch Lichgrun trong 5 phút - Dùng giấy thấm đặt lên tiêu bản loại dung dịch Lichgrun thừa - Gắn tiêu bản bằng nhựa gôm Canada rồi soi kính + Kết quả: bào tử lớn của nấm da bắt màu đỏ còn các sợi nấm và bào tử nhỏ bắt màu xanh phân biệt rất rõ rệt trên tiêu bản 4.9 Phương pháp gây nhiễm nấm trên động... Cấy một ít nấm vào dung dịch, đậy nắp, ghi nhãn và để ở nhiệt độ phòng Sau 2-4 tuần kiểm tra 4.7 Những phương pháp kiểm tra hình dạng vi thể của nấm: 4.7 .1 Kiểm tra hình dạng nấm in situ: Trong một số trường hợp có thể kiểm tra trực tiếp hình dạng của nấm ngay trên khuẩn lạc trong hộp lồng hoặc ngay trong ống nghiệm Với độ phóng đại và ánh sáng thích hợp có thể quan sát thấy các cơ quan của nấm và có . CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM, NUÔI CẤY, PHÂN LẬP, CHẨN ĐOÁN NẤM – PHẦN 1 4 .1. Kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm: Trong la bo xét nghiệm chẩn đoán nấm thì công việc lấy mẫu. 4.4. Phương pháp phân lập nấm da từ đất: Vanbreuseghem đã đưa ra phương pháp phân lập nấm da từ đất bằng cách dùng tóc người hoặc lông của động vật (như bờm ngựa) để “bẫy nấm . Phương pháp. Phương pháp nuôi cấy, định loại nấm da: + Môi trường cơ bản Sabouraud nuôi cấy chẩn đoán nấm da: Bằng phương pháp xét nghiệm trực tiếp soi bệnh phẩm dưới kính hiển vi chỉ cho biết có nấm hay không