Câu 1: Nêu khái niệm về nuôi cấy mô, tế bào thực vật? Các kỹ thuật nuôi cấy chính và ứng dụng? Khái niệm: nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro Nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm hoang loạt các kỹ thuật khác nhau và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực. Các kỹ thuật nuôi cấy chính và ứng dụng của nó: Nuôi cấy hạt giống: tăng khả năng nảy mầm của các hạt khó nảy mầm trong điều kiện bình thường. Thúc đẩy quá trình này mầm bằng cách bổ sung các chất điều tiêt sinh trưởng. Tạo ra cây con dùng cho nuôi cấy merisrem hoặc các bộ phận khác Hoa cái: thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa. Tạo đơn bội và tạo đa phôi Hoa đực: tạo mô sẹo và cây đơn bội. Tạo đột biến ở mức đơn bội. Tạo dòng đồng hợp tử Phôi hợp tử: nuôi cấy cứu phôi khi lai xa. Nhân các dòng lai xa. Phá ngủ nghỉ của hạt. Mô sẹo: tạo phôi vô tính. Nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trần. Tạo cây có biến dị soma Tế bào: tạo đột biến ở mức độ tế bào. Tạo tế bào trần để lai vô tính. Biến nạp gen. Nuôi cấy tế bào đơn Đỉnh chồi: tạo nhân nhanh dòng đồng nhất về di truyền. Làm sạch virus. Nguyên cứu -sinh lý phát triển Phân hóa phôi vô tính: là đường hướng tái sinh chủ yếu. ứng dụng: nhân nhanh, sản xuất hạt nhân tạo. Cung cấp vật liệu để tạo các protoplast có khả năng sinh phôi. Cho phép cơ khí hóa quá trình nuôi cấy và sử dụng bioreactor Đột biến soma: phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tưởng song còn thiếu một số tính trạng mong muốn. Phân lập các biến dị có tích để sản xuất các hợp chất chống chịu stress tốt hơn. Tạo các biến dị di truyền không qua lại hữu tính ở những dòng ưu tú Câu 2: Nêu những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật so với các phương pháp truyền thống khác?  Thứ nhất: vi nhân giống (micropropagation) - Thực hiện trong phòng thí nghiệm, không chịu ảnh hưởng của thời tiết, mùa vụ. Chủ động sản xuất cây giống. - Sinh sản vô tính tạo ra một lượng lớn cây giống giữ nguyên bản chất di truyền như cây mẹ. - Hệ số nhân cao, tốc độ tăng trưởng nhanh và rút ngắn thời gian ra hoa quả với những cây lâu năm. - Sản xuất hạt nhân tạo.  Thứ hai, chọn và tạo giống in vitro - Chọn các dòng kháng vi rút, chịu lạnh, chịu hạn, 1 - Tạo dòng thuần nhanh bằng cách nuôi cấy bao phấn rồi đa bội hoá nhờ hoá chất. - Tạo cây trồng biến đổi gen mang nhiều tính trạng quý. - Dung hơp tế bào trần  Thứ ba, sản xuất các hoá chất có hoạt tính sinh học - Sản xuất chủ động và liên tục trong phòng thí nghiệm không phụ thuộc vào tự nhiên và mua vụ. - Nhiều hợp chất sinh học phức tạp nhân được từ tế bào nuôi cấy. - Chọn các dòng tế bào sản xuất các chất với năng suất cao hơn cây ngoài tự nhiên - Thu nhân nhiều chất quý hiếm mà tổng hợp hoá học rất đắt. Bản thân cây đó tăng trưởng chậm, sinh sản khó khăn thì nuôi cấy mô và khống chế tạo mô (mô rễ) sản sinh ra nhiều chất đó - Câu 3: Trình bày cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào? *Cấu trúc chung của tế bào thực vật -Học thuyết tế bào:Schleiden và Schwann (1839) đã độc lập đưa ra kết luận: - Cơ thể thực vật vầ động vật đều do các tế bào hợp thành và tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của tất cả mọi cơ thể sống - Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của cơ thể thực vật bởi tế bào rất đa dạng nhưng tổ chức theo nguyên tác cấu trúc thống nhất và có tất cả các đặc tính của thệ thống sống: - Trao đổi chất và năng lượng - Sinh trưởng, phát triển và sinh sản - Di truyền cho thế hệ sau đặc tính của mình - Có khả năng tồn tại độc lập và phân chia trên môi trường dinh dưỡng. Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp tế bào có thể tái sinh và phát triển thành cơ thể nguyên vẹn. * Tính toàn năng của tế bào (totipotency): Haberlandt (1902), lần đầu tiên quan niệm răng: Mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. - Theo quan niệm của sinh học hiện đại: Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. - Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sơ lý luận của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào. *Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy in vitro: • Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấy phân hóa thành cây hoàn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính toàn năng của tế bào thực vật. 2 Kh nng biu hin tớnh ton nng ca cỏc t bo, mụ ca c th l khỏc nhau. Tớnh ton nng ca t bo nuụi cy in vitro biu hin tri qua 3 giai on: + T bo phn bit húa vi s phỏt sinh t bo kh bin + nh hng phõn húa t bo + Phỏt sinh hỡnh thỏi, phỏt sinh c quan *S phõn húa, phn phõn húa t bo v s hỡnh thnh t bo kh bin: S phõn húa t bo : T bo phụi sinh t bo mụ chuyờn húa, m bo chc nng chuyờn bit. Vd: mụ du, mụ bỡ, mụ mm, mụ dn S phn phõn húa: - S phn phõn húa l quỏ trỡnh t bo ó phõn húa (chuyờn húa) trong mt iu kin nht nh, khụi phc kh nng phõn chia chuyn thnh t bo phõn sinh v hỡnh thnh mụ so. Trong ú cú mt b phn t bo hỡnh thnh t bo cm ng phỏt sinh hỡnh thỏi, tc l t bo cú th cm th tớn hiu kớch thớch phõn t, t ú xỏc nh ng hng mi ca s sinh trng v phỏt trin t bo iu khin s phõn húa v phn phõn húa t bo thc vt dn n s phỏt sinh hỡnh thỏi trong nuụi cy mụ t bo thc vt. Nuụi cy mụ t bo thc vt chớnh l iu khin s phỏt sinh hỡnh thỏi ca t bo, mụ nuụi cy Cõu 4. Nờu cỏc thnh phn chớnh ca mụi trng dinh dng nuụi cy mụ t bo thc vt in vitro Môi trờng nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan trong nuôi cấy. Có nhiều loại môi trờng nuôi cấy cho các loại thực vật khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau. Môi trờng thờng bao gồm các thành phần chính sau đây: Nguyên tố đa lợng Nguyên tố vi lợng Nguồn các bon hữu cơ Các vitamin Chất điều tiết sinh trởng thực vật Các hỗn hợp chất tự nhiên Chất làm đông môi trờng Các nguyên tố đa lợng: Các nguyên tố khoáng chất mà thực vật cần thiết khi nồng độ lớn hơn 0,5 mM/l gọi là nguyên tố đại lợng Các nguyên tố: N, P, K, S, Mg, Ca, là cần thiết vàthay đổi tùy theo đối tợng nuôi cấy. Nói chung, nồng độ mỗi nguyên tố nói trên trong môi trờng > 30ppm. Chúng là nguyên liệu để tế bào xây dựng nên thành phần cấu trúc của mình. Các nguyên tố vi lợng: Các nguyên tố khoáng m thực vật cần thiết có nồng độ nhỏ hơn 0,5 mM/l gọi l nguyên tố vi l ợng.Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Bo, I, Co l các nguyên tố vi l ợng thờng đợc dùng trong môi trờng nuôi cấy in vitro. Các nguyên tố ny đóng vai trò quan 3 trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng đợc dùng với nồng độ mỗi nguyên tố <30ppm v tuỳ thuộc v o loại môi tr ờng m h m l ợng v tỷ lệ của chúng sẽ thayđổi Trong môi trờng nuôi cấy, Fe thờng đợc dùng dới dạng muối phức (chelat): Fe-EDTA, Fe-citrate Nguồn các bon hữu cơ: Khi nuôi cấy in vitro tế b o, mô thực vật sống chủ yếu theo ph ơng thức dị dỡng. Vì vậy, cần nguồn cac bon hữu cơ v th ờng dùng l đ ờng saccaroza v với liều l ợng 20 -30g/lít. Trong một số trờng hợp đặc biệt, có thể sử dụng nguồn đờng khác nh glucoza, maltoza , galactoza v lactoza Các vitamin. Mô, tế b o nuôi cấy in vitro có thể tự tổng hợp vitamin nh ng không đủ cho hoạt động sống của chúng nên cần bổ sung thêm vitamin v o môi tr ờng nuôi cấy Đáng chú ý l các vitamin: thiamin, axit nicotinic, pyridoxin v riboflavin. Nồng độ th ờng dùng khoảng 1mg/lít. Các vitamin n y đóng vai trò quan trọng trong tế b o vì chúng l các co-enzym. Myo-inositol cần đợc bổ xung vo một lợng khá lớn 50 - 100mg/lít, chất n y tỏ ra có tác dụng khá rõ đến sự phân chia của tế bo. Các chất điều tiết sinh truởng. Các chất điều tiết sinh trởng l yếu tố quan trọng nhất trong môi tr ờng quyết định kết quả nuôi cấy auxin v xytokinin đ ợc sử dụng nhiều hơn cả trong nuôi cấy invitro. *Auxin kích thích sự hình th nh mô sẹo v tạo rễ bất định, kích thích sự d_n của tế b o. Các auxin thờng sử dụng l : 2,4 - Dicloro phenoxy axetic axit (2,4D), -naphtylaxetic axit ( - NAA), Indolaxetic axit (IAA). Nồng độ sử dụng:10-5-10-7 M/l *Xytokinin kích thích sự phân chia tế b o v quyết định sự phân hóa chồi. Các xytokinin th ờng đợc sử dụng l Benzyladenin (BA), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) v Zeatin (một chất tự nhiên). Nồng độ sử dụng: 10-5 - 10-7 M *Tỷ lệ Auxin/Xytokinin quyết định sự phân hóa của mẫu cấy theo hớng tạo rễ, chồi hay mô sẹo. Các hỗn hợp chất tự nhiên L th nh phần th ờng đựoc sủ dụng nhng không phải l th nh phần bắt buộc. Chúng l m gia tăng th nh phần dinh d ỡng v chất có hoạt tính sinh lý cho môi tr ờng nên kích thích sự sinh trởng v phân hoá của mẫu cây.Th ờng bao gồm: * Nớc dừa: thờng chứa các axit amin, axit hữu cơ, đờng, ARN, AND. Đặc biệt trong nớc dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy invitro đó l : myoinositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucosit của xytokinin. * Dịch nghiền của 1 số rau, quả tơi (khoai tây, c rốt, chuối, táo ): Th nh phần hóa học có: đờng, axit nucleic, axit amin, vitamin, khoáng * Dịch thủy phân casein (casein hydrolysat) hay pepton : chủ yếu đợc sử dụng l m nguồn bổ xung axit amin. Chất l m đông cứng môi tr ờng - Agar. Agar l một loại polysaccarit của tảo. ở 80 0C thạch ngậm nớc chuyển sang trạng thái sol còn ở 40 0C thì trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nớc của thạch khá cao: 6 - 12 gam/lít nớc. Thạch ở dạng gel nhng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dung v có độ thoáng khí cao. Nồng độ trung bình 6 - 8g/lít 4 Câu 5 Có mấy nhóm chất điều hòa sinh trưởng? Nêu vai trò của chúng trong điều khiển sự phát sinh hình thái của mô, tế bào thực vật nuôi cấy in vitro? Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây: A. Nhóm auxin Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: 1H- indole-3-acetic acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA) Vai trò: - Kích thích phân chia và kéo dài tế bào - Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. Ưu thế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách. Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫn đến sự phát chồi nách. Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một lớp chất keo có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng. Cơ chế ức chế của chồi đỉnh liên quan đến một chất điều hoà sinh trưởng khác là ethylene. Auxin (IAA) kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh. - IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn (xylem and phloem). - Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô. - Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường. - Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus) - Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tạo phôi soma (2,4-D) B. Nhóm các cytokinin Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H- purine-6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau: 1- Kích thích phân chia tế bào 5 2- Tạo và nhân callus 3- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô 4- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh 5- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào 6- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài 7- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Ức chế sự hình thành rễ - Ức chế sự kéo dài chồi 8 - Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục C. Gibberellin có các chức năng cơ bản sau: 1- Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non, hạt chưa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic axit. 2- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài thân và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân. Các cây lùn thường bị thiếu gibberellin. 3- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch. 4- Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi. Năm đầu thân mầm nằm in, sau mùa đông mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hoá hoa 5- Ức chế sự hình thành rễ bất định 6- Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu hoá các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây 7- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ) 8- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn 9- Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt 10 - Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi D. Abscisic axít (ABA) - Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả - ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước và nhiệt độ thấp đóng băng - Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt - Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành - Gây ra sự đóng khí khổng 6 E. Ethylene - Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả 1 - Làm chín quả 1 - Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh 2- Điều khiển sự chín của một số loại quả 3- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa, một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene. 4 - Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá 5 Câu 6: Nêu khái niệm về nhân giống vô tính in vitro? Nêu các bước chính trong quy trình nhân giống vô tính in vitro a. Nhân giống vô tính in vitro Khái niệm chung: Nhân giống vô tính in vitro là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh, từ các bộ phận, cơ quan như: chồi, mắt ngủ, vảycủ, đoạn thân, lá, của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Nhân nhanh in vitro được ứng dụng vào:  Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống.  Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt.  Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác.  Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.  Bảo quản nguồn gen in vitro b. Các bước chính: Bước 1 . Chọn lọc và chuẩn bị cấy mẹ  Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy).  Các cây này cần phải sạch bênh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh.  Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro. Bước 2. Nuôi cấy khởi động  Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.  Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít chuyên hoá (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ )  Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp:th-ờng dùng các chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl, Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br  7 Bước 3. Nhân nhanh  Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.  Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoaị cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất.  Theo nguyên tắc chung môi trường có hàm lượng cytokinin> auxin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là: 25-270C, 16 giờ chiếu sáng/ ngày, cường độ ánh sáng 2000- 4000 lux. Bước 4 Tạo cây in vitro hoàn chỉnh  Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng.  Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng độ thấp của cytokinin để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh Bước 5. Huấn luyện và đưa cây ra trồng ở vườn ươm  Để đ-a cây từ ống nghiệm ra v-ờn -ơm với tỷ lệ sống cao, cây sinh tr-ởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:  Cây trong ống nghiệm đ_ đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây).  Có giá thể tiếp nhận cây invitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát n-ớc.  Phải chủ động điều chỉnh đ-ợc ẩm độ, sự chiếu sáng của v-ờn ươm cũng nh- có chế độ dinh d-ỡng phù hợp. Câu7: Nêu nguyên lí làm sạch virus và các kỹ thuật làm sạch virus trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật in vitro? Nguyên lý làm sạch virus qua nuôi cấy meristem Virus tồn tại ở mọi tế bào sống. Tuy nhiên, những nghiên cứu của White (1934), Limasset và Cornuet (1950), Morel và Martin (1952) cho thấy:  Nồng độ virus trong tế bào các cây bị bệnh phụ thuộc và tốc độ phân chia tế bào và khả năng sinh trưởng của tế bào. Tế bào càng phân chia mạnh thì nồng độ virus càng thấp, nghĩa là những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn.  Từ đây các ông đã đề xuất kỹ thuật: nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã bị nhiễm bệnh.  White (1934) đã sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo để nghiên cứu sự phân bố virus trong rễ cây cà chua bị bệnh virus Aucuba gây khảm lá. Kết quả cho thấy 2 cm ở đầu rễ hầu như không phát hiện ra virus. 8  Limasset và Cornuet (1950) đã dùng phương pháp huyết thanh định lượng, chứng minh được sự tồn tại một gradient nồng độ virus từ các mô non đến các mô già ở cây thuốc lá bị bệnh. Nồng độ virus bằng không ở mô đỉnh và lá bao thứ nhất sau đó tăng dần, đạt cực đại ở lá thứ năm rồi giảm dần ở các lá già phía dưới. Các kỹ thuật làm sạch virus trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật in vitro Nuôi cấy meristem Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt Nuôi cấy meristem kết hợp với bổ sung hóa chất Vi gép trong ống nghiệm Câu 8: Trình bày các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus ở thực vật? Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus 1. Chuẩn đoán bằng mắt :Đây là phương pháp chuẩn đoán dựa trên các triệu chứng bệnh của cây.  Phải có kinh nghiệm, dễ lẫn với triệu chứng khác.  Rất khó phát hiện khi cây bị nhiễm tổ hợp nhiều loài virus.  Phụ thuộc vào ngoại cảnh, tuổi cây, đặc điểm giống.  2. Chuẩn đoán bằng cây chỉ thị : Cây chỉ thị là cây khi bị nhiễm virus sẽ xuất hiện các triệu chứng đặc trưng. Phương pháp này đã được tiến hành từ 1940. Ưu điểm: - Nhạy, chính xác. - Có thể phát hiện ở nồng độ virus thấp. Hạn chế: - Thời gian chuẩn đoán dài, cần quá trình ủ bệnh. - Phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm - Phương pháp lây nhiễm phức tạp - Tốn công chăm sóc cây chỉ thị, môi giới truyền bệnh. - Một số bệnh virus không tiến hành được (bệnh cuốn lá). 3. Phương pháp huyết thanh Ưu điểm: - Nhạy, đặc hiệu (kết quả thu được trong 48 giờ), chi phí thấp. - Không cần có nhà cách ly nuôi cây chỉ thị Hạn chế: - Có thể lẫn với một số dạng kết tủa khác. - Phản ứng khó xảy ra ở nồng độ virus trong dịch cây bệnh thấp. 4. Phương pháp kính hiển vi điện tử Ưu điểm  Thao tác đơn giản, nhanh  Khá chính xác 9 Hn ch: Ch phỏt hin c cỏc loi hỡnh a, hỡnh si Nhiu loi virus cú cựng hỡnh dng, kớch thc. 5. Phng phỏp ELISA Da vo phn ng khỏng nguyờn khỏng th nhng õy khỏng th c liờn kt vi mt enzyme (enzyme linked). Phc khỏng nguyờn khỏng th enzyme d dng nhn bit qua phn ng to mu do chớnh enzyme ú xỳc tỏc. 6. Phng phỏp lai AND Xỏc nh trc tip s cú mt ca ARN lừi ca virus. Chớnh xỏc, t tin. S nguyờn lý: ARN virus lai vi mu dũ >>> Phn ng lai nhn bit khi mu dũ gn ng v phúng x hoc cht phỏt hunh quang. Cõu 9. Trỡnh by k thut bo qun ngun gen thc vt in vitro? Đây là giải pháp công nghệ có triển vọng trong việc bảo quản nguồn gen thực vật nhất là với các cây nhân giốngvô tínhvà có hạt mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp (recalcitrant). Trong vòng 20 năm gần đây công nghệ này đã đợc phát triển rộng và áp dụng với hơn 1000 loài th c vật khác nhau (F. Engelmann,1997) Quá trình chuẩn bị mẫu bo qun: - Thu thập nguồn gen trong tự nhiên hoặc thông qua quá trình trao đổi giống - Chẩn đoán bệnh, khử bệnh. - Nuôi cấy in vitro v nhân nhanh cho đủ số l ợng mẫu để bảo quản. Sau đó tuỳ thuộc v o đối t ợng vi mc đích m lựa chọn cách bảo quản in vitro thích hợp. Có 2 cách bảo quản nguồn gen thực vật in vitro : 1. Bảo quản sinh truởng chậm Đặc điểm của phuơng pháp n y l kéo d i thời gian giữa 2 lần cấy chuyển nhờ ức chế sự sinh truởng của mẫu cấy nhằm giảm đến mức tối thiểu chi phi trong quá trình bảo quản. Trong thời gian bảo quản mô v tế b o thực vật vẫn tiếp tục sinh tr ởng nhng với tốc độ rất chậm (thờng giảm từ 15 - 20 lần so với bình thờng). Thời gian bảo quản sinh trởng chậm có thể kéo d i một v i năm. Ph ơng pháp n y th ờng áp d ng để bảo quản cây non ho n chỉnh, chồi mầm, phôi để ít gây các biến dị sinh d ng v các đặc tính di truyền không bị mất hay thay đổi trong thời gian bảo quản. Các nhân tố ức chế sinh trởng(trong bảo quản sinh trởng chậm) - Nhiệt độ thấp: giảm nhiệt độ của phòng nuôi cây Chất ức chế sinh trởng: bổ sung v o môi trờng nuôi cấy axit abcisic(ABA), Clo cholin clorit (CCC)Các chất gây áp suất thẩm thấu: bổ sung v o môi tr ờng nuôi cấy manitol, sorbitol, saccarose - Thay đổi điều kiện nuôi cấy nh: giảm cuờng độ chiếu sáng, giảm nồng độ oxy Chú ý: Khi kết thúc một giai đoạn bảo quản các mẫu bảo quản đợc chuyển sang môi trờng tơi v đặt một thời gian gắn trong điều kiện tối thích để kích thích sự tái sinh trởng trớc khi băt đầu một chu kỳ bảo quản mới. Xác định thời gian tối đa an ton cho từng loại cây trồng trong quá trình bảo quản sinh trởng chậm. 10 [...]... chuyển nhiều bản sao được chuyển vào tế bào gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen - Hiệu quả chuyển gen thấp - Đòi hỏi thiết bị đắt tiền như súng bắn gen, đạn vàng, tungten, xung điện Phương pháp chuyển gen bằng xung điện: - Thường được sử dụng cho việc chuyển gen vào tế bào trần Tế bào trần (protoplast) là tế bào được loại bỏ thành tế bào bằng việc xử lý tế bào với enzyme xenlulaza, pectinaza... ADN trực tiếp vào nhân của tế bào trần, tế bào tiền phơi của hợp tử hay hạt phấn + Ưu điểm: - Lượng ADN được biến nạp tuỳ ý và xác định 16 - ADN được đưa đúng vị trí mong muốn, thậm chí nhân tế bào - Có thể áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như tế bào hạt phấn, phơi non mà các kỹ thuật khác khơng thực hiện được + Nhược điểm: - Mỗi lần biến nạp chỉ đưa vào một tế bào duy nhất Do vậy, đây... các chất ức chế trong túi phấn Tạo huyền phù hạt phấn với mật độ 104 – 105 tế bào/ ml Mét sè chó ý khi nu«i cÊy h¹t phÊn Các hạt phấn nuôi cấy tách rời thường phát sinh phôi trực tiếp Để kích thích sự phát sinh phôi thường sử dụng phương pháp nuôi “trợ dưỡng”: nuôi kèm với bao phấn hay loại mô khác của cây mẹ Môi trường nuôi cấy hạt phấn ca àn bổ sung các axit amin (glutamin, serin…) với nồng độ cao... vector chuyển gen đi với tốc độ 1300 ms Với tốc độ bắn này, viên đạn có thể xun quan các lớp tế bào bên ngồi của mơ và xâm nhập vào các tế bào bên trong gặp nhân và gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào Chọn lọc tế bào mang gen và tái sinh thành cây chuyển gen Ưu điểm: - Có thể áp dụng với hầu hết các loại mơ, tế bào - Q trình chuyển gen nhanh, đơn giản về mặt kỹ thuật - Có thể xử lý một lượng mẫu lớn trong... ) Câu 12 Trình bày khái niệm về ni cấy dịch huyền phù tế bào và ứng dụng của ni cấy dịch huyền phù tế bào thực vật? 1.1.Kh¸i niƯm chung Caplin và Steward (1949) là nh÷ng ngưêi ®Çu tiªn c«ng bè sù thành c«ng cđa viƯc nu«i cÊy c¸c tÕ bào thùc vËt trong m«i trưêng láng l¾c C¸c nhà nghiªn cøu (Tulecke and Nickell, 1959) ®ã dù kiÕn tr ưíc sù s¶n xt sinh khèi lín cđa tÕ bào thùc vËt b»ng nu«i cÊy chóng trong... hiệu điện thế cao phát xung trong thời gian cực ngắn khoảng 5-6/1000 giây để tạo ra trên bề mặt tế bào trần tạm thời các lỗ có đường kính 30 ηm, mà qua đó các ADN biến nạp có thể xâm nhập vào tế bào + Ưu điểm: Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định, đặc biệt đối với các gen đơn + Nhược điểm: Hệ thống tái sinh tế bào trần của nhiều lồi thực vật còn khó khăn vi tiêm Chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm (micoinjection):... Khơng đòi hỏi thiết bị đắt tiền + Nhược điểm: - Q trình biến nạp khó điều khiển Số bản sao của gen trong tế bào biến nạp có thể lớn - Tần số biến nạp thành cơng biên động giữa các thí nghiệm - Dễ dẫn đến hiện tượng dung hợp tế bào trần, gây khó khăn việc phân tích biểu hiện gen - Hệ thống tái sinh tế bào trần của nhiều lồi thực vật Câu 17 Trình bày cơ chế chuyển gen gây khối U ở thực vật do vi khuẩn Agrobacterium... c¸c dßng tÕ bào mong mn qua c¸c test thanh läc Sau ®ã t¸i sinh c¸c tÕ bào ®· chän läc ®ưỵc thành c©y hồn chØnh ®Ĩ cã thĨ nhËn ®ưỵc c¸c vËt liệu khëi ®Çu quan träng trong c«ng t¸c gièng Dïng ®Ĩ t¸ch protoplast hc là ngn ®Ĩ s¶n xt c¸c ph«i v« tÝnh Câu 13 Trình bày phương pháp tách, ni cấy tế bào trần và ứng dụng? Phư¬ng ph¸p t¸ch tÕ bào trÇn b»ng enzym 1 Nguyªn t¾c: - Sư dơng hçn hỵp enzym: xellulolaza,... g©y biÕn dÞ dßng soma 1.Sù ®a d¹ng di trun tù nhiªn cđa c¸c tÕ bào nu«i cÊy C¸c mÉu cÊy trªn thùc tÕ bao gåm nhiỊu lo¹i tÕ bào kh¸c nhau nh ư là phloem, xylem, nhu m«, m« vá… Nh÷ng tÕ bào này cã thĨ cã møc ®é béi thĨ kh¸c nhau Nãi c¸ch kh¸c, cã sù ®a d¹ng tÕ bào gi÷a c¸c lo¹i tÕ bào trong cïng mét mÉu cÊy Sù ®a d¹ng tÕ b ào nh ư vËy thưêng gäi là "polysomatic" (®a béi v« tÝnh) C¸c lồi như lóa mú, thc... phï tÕ bào ®ưỵc khëi ®Çu b»ng viƯc chun nh÷ng mÈu m« sĐo (callus) xèp vào m«i trưêng láng trong nh÷ng b×nh nu«i cã dung tÝch phï hỵp (c¸c b×nh Erlenmeyer dung tÝch 30S 60 ml) và l¾c nhĐ nhàng C¸c tÕ bào ®ưỵc t¸ch rêi ra khái m« sĐo và ph©n t¸n trong m«i tr ưêng láng ë ®ã chóng sinh trưëng, ph©n chia và cã thĨ h×nh thành nh÷ng cơm tÕ bào kÕt tËp Dung dÞch nu«i cÊy tÕ b ào chun thành hun phï tÕ bào øng . khái niệm về nuôi cấy mô, tế bào thực vật? Các kỹ thuật nuôi cấy chính và ứng dụng? Khái niệm: nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu. nuôi cấy mô và khống chế tạo mô (mô rễ) sản sinh ra nhiều chất đó - Câu 3: Trình bày cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào? *Cấu trúc chung của tế bào thực vật -Học thuyết tế bào: Schleiden. sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro Nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm hoang