Các thể vùi virus bảo vệ virion chống lại tác động môi trờng Đây điều kiện để virus vùi tồn lâu nhiều năm tự nhiên Thí dụ, thể vùi NPV gây bệnh tằm nghệ không hoà tan cồn, axeton dung môi hữu khác, không thối thời gian bảo quản lâu dài Thể vùi đa diện cuả virus gây bệnh cho ong xẻ hại vân o sam Picea bảo tồn sức sống xác chết khô vật chủ điều kiện 4-5 C 10 năm Có thể vùi tồn lớp đất canh tác khoảng năm, số trờng hợp tới 25 năm Một số chế phẩm virus trừ sâu Quy trình sản xuất Quy trình sản xuất chế phẩm virus phòng trừ sâu hại đợc tóm tắt sơ đồ hình Nuôi sâu giống Nuôi sâu hàng loạt Chế biến thức ăn nhân tạo Nhiễm bệnh virus cho s©u - Thu s©u chÕt VR - NghiỊn läc - Ly tâm loại bỏ cặn bà Trộn phụ gia (chất mang, chất bám dính, chất chống thối ) Làm khô Kiểm tra chất lợng, lợng PIB/ml, thử sinh học Đóng gói chế phẩm Hình Quy trình sản xuất chế phẩm NPV dạng bột Chế phẩm virus trừ sâu Việt Nam đợc nghiên cứu sản xuất nhóm virus đa điện nhân (NPV) Để sản xuất đợc virus đòi phải có lợng lớn sâu hại vật chủ chúng Do công nghệ sản xuÊt chÕ phÈm virus trõ s©u bao gåm kh©u quan trọng là: công nghệ sản xuất hàng loạt sâu vật chủ trình tạo sinh khối virus Để sản xuất số lợng lớn sâu vật chủ ngời ta đà tiến hành nghiên cứu chế tạo thức ăn cho sâu vật chủ Trên sở nghiên cứu môi trờng thức ăn nuôi sâu bán tổng hợp nhà khoa học Việt Nam đà xây dựng thành công quy trình công nghệ sản xuất hàng loạt sâu vật chủ tạo chế phẩm virus phòng trừ số sâu hại nh sâu xanh, sâu khoang, sâu keo da láng Virus đợc nhiễm vào thể sâu vật chủ phát triển đến đạt sinh khối lớn ngời ta tiến hành giết sâu vật chủ xử lý sinh khối virus Sản phẩm tạo chế phẩm dạng nớc dạng bột khô 3.2 Các tiêu chất lợng chế phẩm NPV dạng bột Chế phẩm NPV cần bảo đảm yêu cầu kỹ thuật thể bảng 12 Bảng 12: Yêu cầu chất lợng NPV TT Các tiêu Đơn vị tính Kích thớc hạt 78àm Độ thuỷ phần 7% Độ bám dính đồng Độ pH Lợng PIB/mg chế phẩm 85 - 90% 1,5 × 107 2.3 Mét sè chÕ phẩm NPV + Chế phẩm Virus NPV sâu xanh sản xuất theo quy trình công nghệ đợc thử nghiệm áp dụng đồng ruộng trừ sâu xanh thuốc Sơn La, Hà Nội, Đồng Nai, Sông Bé, Ninh Thuận, v.v cho kết phòng trừ tốt bảo vệ đợc suất trồng Chế phẩm virus sâu xanh với OMĐ tác nhân sinh học quan trọng hệ thống phòng trừ tổng hợp (PTTH) sâu hại Chế phẩm có giá thành cao ngời nông dân cha quen sử dụng nên phạm vi áp dụng hạn chế + Chế phẩm Virus NPV sâu đo xanh đay: Cho đến cha tìm đợc môi trờng thức ăn nhân tạo nuôi sâu Do để có sâu vật chủ nhân virus phải nuôi thức ăn tự nhiên Vì vậy, chế phẩm virus sâu đo đay đợc sản xuất phơng pháp thủ công nh sau: dùng nguồn NPV sâu đo đay phun lên đồng đay nơi có nhiều sâu, thu gom sâu chết bệnh lại để nghiền lọc lấy dịch virus Sau lại đem phun lên đồng đay Cứ nh tạo chế phẩm virus chỗ để trừ sâu đo đay Việc sản xuất sử dụng chế phẩm virus sâu đo đay chỗ biện pháp có triển vọng rẻ tiền, có hiệu kinh tế nên ngời nông dân vùng trồng đay chấp nhận đợc + Chế phẩm virus NPV sâu róm thông: Chế phẩm virus phòng trừ sâu róm thông phơng pháp thủ công nh sản xuất chế phẩm virus sâu đo xanh đay Hiệu diệt sâu róm thông chế phẩm virus đạt 55,2 - 83,3% Chế phẩm đợc áp dụng thành công trừ sâu róm thông Thanh Hoá Sử dụng chế phẩm virus sâu róm thông đà hạn chế sử dụng thuốc hoá học tû lƯ ký sinh tù nhiªn cđa mét sè ong ký sinh sâu róm thông tăng lên Ngoài chế phẩm kể có chế phẩm virus NPV sâu keo da láng đợc sản xuất theo phơng pháp thủ công Chế phẩm đợc sử dụng rộng rÃi Ninh Thuận, Lâm Đồng mang lại hiệu kinh tÕ x· héi cao II Vi khn g©y bƯnh cho côn trùng chuột Khái quát chung vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng chuột Vi khuẩn có khắp nơi trái đất, xâm nhập vào tất phần thể sinh vật nói chung côn trùng nói riêng Chóng cã thĨ ë khoang miƯng, rt, hƯ thèng h« hÊp, c¬ quan sinh dơc, Vi khn cã quan hệ với côn trùng đa dạng đợc chia thành nhóm vi khuẩn hình thành bào tử không hình thành bào tử Vi khuẩn hình thành bào tử bao gồm tất vi khuẩn gây bệnh bắt buộc phần lớn loài gây bệnh không bắt buộc Phần lớn loài gây bệnh không bắt buộc có (hoặc tạo thành) tinh thể độc Vi khuẩn không hình thành bào tử bao gồm loài gây bệnh hoàn toàn không bắt buộc tất loài vi khuẩn có tiềm gây bệnh cho côn trùng Những vi khuẩn gây bệnh bắt buộc vi khuẩn liên quan với loại bệnh định côn trùng Trong tự nhiên, vi khuẩn gây bệnh bắt buộc th−êng chØ thÝch nghi víi mét phỉ ký chđ hĐp Vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc làm tổn hại xâm nhiễm vào mô thể côn trùng mẫn cảm với chúng, nhng xếp chúng vào nhóm vi khuẩn gây bệnh bắt buộc Trớc xâm nhập vào xoang máu vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc thờng sinh sản ruột côn trùng Vi khuẩn có tiềm gây bệnh, bình thờng không sinh sản ruột côn trùng, nhng chúng xâm nhập vào xoang máu Những vi khuẩn phát triển đợc môi trờng thức ăn nhân tạo, không chuyên tính với nhóm côn trùng riêng biệt Vi khuẩn sử dụng BPSH trừ dịch hại thuộc Eubacteriales, đặc biệt thuộc họ Enterobacteriaceae, Microccaceae, Bacillaceae vµ mét sè gièng thuéc hä Pseudomonadeceae (bé Pseudomonadales) Họ Pseudomonadeceae gồm loại vi khuẩn hình que, gram âm, không hình thành bào tử Các loài Pseudomonas aeruginosa, P chlororaphis, P fluorescens, vi khuẩn có tiềm gây bệnh cho côn trùng Họ Enterobacteriaceae gồm loài vi khuẩn sống ruột côn trùng Chúng có dạng hình que, gram âm, không hình thành bào tử Phát triển tốt môi trờng dinh dỡng bình th−êng Vi khuÈn thuéc hä nµy cã loµi lµ ký sinh bắt buộc, không bắt buộc hoại sinh Họ Bacillaceae gồm vi khuẩn hình thành bào tử, gram dơng, hình que Có ý nghĩa BPSH loài thuộc giống Bacillus, Clostridium Một số vi khuẩn đợc nghiên cứu ứng dụng phòng chống côn trùng chuột hại 2.1 Vi khuẩn Coccobacillus acridiorum Đây vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng đợc D' Herelle nghiên cứu mô tả vào năm 1911 Mexico Vi khuẩn có dạng hình que nhỏ, gram âm đợc gọi tên ban đầu C acridiorum gây bệnh nhiễm trùng máu cho châu chấu, phát triển môi trờng nhân tạo Sản phẩm từ vi khuẩn Coccobacillus acridiorum đợc áp dụng tơng đối thành công Mexico, Colombia, Argentia Theo hệ thống phân loại đại vi khuẩn loài Enterobacter cloacae var acridiorum 2.2 Vi khuẩn gây bệnh sữa cho ấu trùng bọ Bệnh sữa đợc phát Êu trïng bä ë NhËt B¶n Popillia japonica tõ năm 1921 gồm dạng dạng A B Vi khuẩn gây nên dạng bệnh đợc mô tả với tên Bacillus popolliae (dạng bệnh A) B lentimormus (dạng bệnh B) Trong loài vi khuẩn loài B popolliae phổ biến chiếm 88% trờng hợp đợc ý nghiên cứu Loài B popolliae vi khuẩn ký sinh bắt buộc, gram dơng; bào tử có tính kháng cao với điều kiện bất lợi môi trờng, lây nhiễm bệnh cho bọ qua đờng tiêu hoá Sau xâm nhập vào vật chủ 3-4 ngày vi khuẩn bắt đầu sinh bào tử, tới ngày thứ 13-16 bào tử vi khuẩn đạt tới mức tối đa Trên môi trờng thức ăn nhân tạo vi khuẩn không hình thành bào tử, phải nuôi nhân vi khuẩn ấu trùng bọ Nhật Bản Sau 20 ngày ủ bệnh, ấu trùng bọ Nhật Bản tích luỹ tới 20 tỷ bào tử Từ sâu bị bệnh gom vi khuẩn sản xuất thành chế phẩm dạng bột chứa 100 triệu bào tử gam chÕ phÈm 2.3 Vi khuÈn Bacillus cereus Là vi khuẩn phổ biến tự nhiên, gram dơng, hình thành bào tử nhng không tạo thành tinh thể độc Tính gây bệnh cho côn trùng vi khuẩn khác Ngời ta cho tính gây bệnh B.cereus chủ yếu liên quan tới tạo thành men photpholipaza loại ngoại độc tố nh− cña Bacillus thuringiensis 2.4 Vi khuÈn Bacillus thuringiensis Đây vi khuẩn gây bệnh côn trùng quan trọng đợc nghiên cứu sử dụng rộng rÃi để trừ nhiều sâu hại giới Vi khuẩn B thuringiensis hình que, gram dơng, hình thành bào tử tinh thể độc tố Tính độc hay tính diệt sâu vi khuẩn B thuringiensis phụ thuộc vào độc tố vi khuẩn sinh trình sinh trởng phát triển chúng Theo Kreig, Langenbrusch (1981) có gần 525 loài thuộc 13 côn trùng đà ghi nhận bị nhiễm vi khuẩn B thuringiensis, nhiều cánh vảy (có 318 loài), sau hai cánh (59 loài), cánh màng (57 loài), cánh cứng (34 loài); khác có từ 1-12 loài bị nhiễm vi khuẩn B thuringiensis sinh loại độc tố, là: Ngoại ®éc tè α (α-exotoxin), ngo¹i ®éc tè β (βexotoxin), ngo¹i ®éc tè γ (γ-exotoxin), néi ®éc tè δ (δ - endotoxin) Trong loại độc tố này, ngời ta ý nhiều đến nội độc tố định hoạt tính diệt côn trùng vi khuẩn + Ngoại độc tố alpha ( - exotoxin) (phospholipaza C) Năm 1953, lần Toumanoff phát thấy vi khuẩn B.t var elesti sản sinh enzyme lexithinaza Tác động độc enzyme liên quan đến phân huỷ mang tính cảm ứng Phospholipit mô côn trùng, làm côn trùng bị chết Enzyme liên kết với tế bào ruột côn trùng, sau tách đợc hoạt hoá chất không bền nhiệt Chất có trọng lợng phân tử thấp, lipit Độc tố đặc biệt có tác động với loài ong xẻ (Tenthre dimidae) có pH đờng ruột phù hợp với tác động enzyme đà phát chất xác định men Lexithinaza C (Còn gọi phospholipaza C) Nhiều nghiên cứu đà chứng minh liên quan men với hoạt tính trừ sâu đà cho biết men tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào thể côn trùng Ngoại độc tố alpha hoà tan nớc, không bền vững nhiệt độ cao, gọi ngoại độc tố không chịu nhiệt + Ngoại độc tố beta ( - exotoxin): Độc tố đợc Halt Arkawwa (1959) tìm nuôi ấu trùng ruồi nhà thức ăn có chứa B thuringiensis Độc tố tách đợc từ môi trờng nuôi cấy B thuringiensis Thành phần ngoại độc tố beta gồm adenin, riboza phospho với tỷ lệ 1:1:1 Ngoại độc tố beta hoà tan nớc, bền vững nhiệt độ cao, chịu ®−ỵc ë nhiƯt ®é 120-121oC 10 - 15 phót, gọi ngoại độc tố chịu nhiệt Ngoại độc tố beta gọi Thuringiensis Không phải tất chủng tạo thành ngoại độc tố beta Một số B.t không sinh tinh thể độc nhng sinh ngoại độc tố Hoạt tính ngoại độc tố bắt đầu xuất giai đoạn vi khuẩn phát triển mạnh, trớc hình thành bào tử Ngoại độc tố Nucleotit có trọng lợng phân tử thấp (707-850), có adenin, riboza, phospho với tỷ lệ Tác động độc kìm hÃm nucleotidaza ARN- polymeraza phụ thuộc ADN, enzyme gắn với ATP dẫn tới việc ngừng tổng hợp ARNt Ngoại độc tố có tác dụng cộng hởng với nội độc tố , sau nội độc tố có tác dụng gây giập vỡ, phá huỷ hoàn toàn biểu mô ruột côn trùng mẫn cảm, ngoại độc tố nhanh chóng xâm nhập vào huyết tơng máu, tới quan gây thay đổi sinh lý dẫn tới chết nhanh ấu trùng Ngoại độc tố có hiệu việc chống sâu non côn trùng mẫn cảm Nó gây trì trệ việc chuyển hoá lột xác có tác động trởng thành phát triển từ ấu trùng đà ăn phải độc tố dới ngỡng gây chết + Nội độc tố( - endotoxin): Nội độc tố dạng tinh thĨ chøa vi khn cïng víi bµo tư cđa vi khuẩn Mỗi tế bào vi khuẩn hình thành bào tử đầu tinh thể nội độc tố đầu Sau thành tế bào vi khuẩn tiêu huỷ tinh thể độc tố bào tử đợc tự môi trờng nuôi cấy lắng đọng với Trong trình hình thành bào tử tinh thể nội độc tố đợc hình thành Sự hình thành tinh thể nội độc tố liên quan với hình thành bào tử giai đoạn đầu trình sinh bào tử Sau việc hình thành bào tử tinh thể nội ®éc tè x¶y ®éc lËp víi (Nishimura, Nichiisutsuji - Uwo, 1980) Những kết nghiên cứu gần cđa Rn Gaixin, Feng Xichang vµ Feng Weixiong (1983) cho thấy tinh thể nội độc tố khác hình dạng theo hình dạng chia chúng thành loại sau: dạng nhị tháp, dạng hình cầu, dạng hình vuông, dạng không ổn định dạng hình lõm Còn Tôan thông báo vi khuẩn B.thuringiensis var Kurstaki tạo thành dạng tinh thể dạng nhị tháp dạng hình lập phơng (Kandybin, 1989) Tinh thể nội độc tố delta không khác hình dạng khác phân tử lợng Theo phân tử lợng, tinh thể chia thành nhóm: nhóm có phân tử lợng 140.000 160.000; 60.000 - 130.000 40.000 - 50.000 * Cơ chế tác động vi khuẩn B thuringiensis lên côn trùng: Tác động diệt sâu vi khuẩn B thuringiensis tổng hợp Theo đặc điểm cách xâm nhiễm gây tổn thơng cho côn trùng xếp B thuringiensis thuộc nhóm vi sinh vật có tác động đờng ruột Đờng nhiễm trùng quan tiêu hoá Chỗ phá huỷ vi khuẩn ruột côn trùng Yếu tố gây chết sâu có chế phẩm B thuringiensis tinh thể nội độc tố delta Các tinh thể nội độc tố đợc côn trùng ăn với thức ăn Trong ruột côn trùng, dới tác động hệ men tinh thể nội độc tố đợc phân giải sinh độc tố Thành phần độc tố đợc tạo thành ruột côn trùng phụ thuộc vào men dịch ruột côn trùng Bộ men không giống loài côn trùng khác Do đó, có khác tính mẫn cảm loài côn trùng víi cïng mét dßng vi khn B thuringiensis Víi sù phân huỷ tinh thể nội độc tố tạo thành độc tố độc tố tác động lên màng bao chất dinh dỡng biểu mô ruột trình bệnh lý bắt đầu Các tế bào biểu mô bắt đầu trơng trở nên mủn Đầu tiên tế bào hình trụ bị tổn thơng Những thay đổi màng tế bào ghi nhận đợc 15 phút sau côn trùng ¨n ph¶i thøc ¨n cã vi khuÈn B thuringiensis Sau 2-3 tế bào hình trụ, hình chén đà tạo thành vết nứt, tế bào bị nhăn nheo vỡ Sự phá vỡ trao đổi chất tế bào biểu mô ruột dẫn đến ion lọt từ khoang ruột sang dịch máu Chứng liệt chết xảy không cân ion dịch máu Đồng thời bào tử vi khuẩn từ ruột xâm nhiễm vào dịch máu sinh sản nhanh gây nhiễm trùng máu Đối với côn trïng cã tÝnh mÉn c¶m cao víi B thuringiensis nh− tằm (Bombyx mori) bào tử đóng vai trò nhỏ bé vai trò tác động B thuringiensis lên côn trùng Bởi trờng hợp không đủ thời gian để bào tử mọc mầm xâm nhiễm côn trùng đà chết néi ®éc tè (Sundara Babu, 1985) 2.5 Vi khuÈn Serratia marcescens Đây vi khuẩn hình que, gram âm, không hình thành bào tử, ký sinh không bắt buộc côn trùng Tính gây bệnh cho côn trùng vi khuẩn đợc ghi nhận tài liệu từ năm 1886 (Masera, 1936) Vi khuẩn S marcescens đà gây dịch cho bọ Melolontha melolontha, tằm đợc sử dụng thành công trừ sâu đục thân ngô Vi khuẩn cã tÝnh g©y bƯnh cao cho ch©u chÊu Melanoplus bivittatus, số rệp sáp Pseudococcus, sâu non Pieris brassicae, Lymantria dispar, Euproctis chrysorrhoea, Agrotis segertum, bä xÝt Eurygaster 2.6 Vi khuẩn Salmonella enteridis Đây vi khuẩn gây bệnh thơng hàn chuột số loài gặm nhấm khác Vi khuẩn S enteridis ký sinh bắt buộc, gram âm, không hình thành bào tử Vi khuẩn S enteridis phân lập đợc từ xác chết chuột trận dịch từ năm 1893 đến 1897 Nga năm 1893 Pháp Năm 1950, Prokhorov đà phân lập đợc chủng gây bệnh cho chuột, ký hiƯu lµ No5170 Vi khn nµy cã tÝnh chän läc rÊt cao thĨ hiƯn víi tõng loµi gËm nhÊm, chúng không nguy hiểm cho ngời động vật nuôi nhà (ngựa, trâu bò, lợn, gà, vịt, ngỗng, chó, mÌo ) TÝnh ®éc cđa vi khn S enteridis thay đổi liên tục cấy truyền môi trờng thức ăn nhân tạo nh bảo quản dài hạn môi trờng Đặc biệt tính độc giảm nhanh môi trờng bị acid hoá Một số chế phẩm vi khuẩn phòng trừ sâu bệnh 3.1 Chế phẩm B.t Sản xuất Bt đợc thực hai phơng pháp lên men chìm lên men xốp Trong công nghệ lên men xốp thờng dùng hạt chất rắn, khả hấp thụ chất dinh dỡng bề mặt Các hạt chất rắn đóng vai trò nguồn chất dinh dỡng, ví dụ: cám lúa mỳ, bột ngô, bánh hạt loại dầu đơn giản đóng vai trò nh chất mang vô Sản xuất Bt quy mô lớn phơng pháp lên men xốp thờng gặp nhiều khó khăn nh cung cấp khí cho môi trờng, ngăn chặn tạp nhiễm, điều chỉnh lên men thu hoạch Phơng pháp lên men xốp thờng có sản lợng thấp so với lên men chìm phơng pháp thực tế để sản xuất chế phẩm thơng mại Trong phơng pháp lên men chìm, việc nghiên cứu tìm môi trờng dinh dỡng tối u cần thiết Việc sản sinh nội độc tố vi khuẩn thay đổi theo serotyp mà phụ thuộc vào môi trờng nuôi cấy Có chủng phù hợp với loại môi trờng này, cho hoạt tính cao, nhng chủng khác nuôi cấy môi trờng lại cho hoạt tính thấp Vì việc tìm kiếm môi trờng dinh dỡng tối u chất tăng cờng trình trao đổi chất ngời ta phải quan tâm tới thông số trình lên men: nhiệt độ, pH, độ oxy hoà tan, tốc độ thông khí để xác định thời gian thu hoạch tối u Một số nghiên cứu cho biết vi khuẩn Bt bị thực khuẩn thể (Bacteriophage) xâm nhiễm làm hỏng mẻ cấy, phá huỷ tế bào sinh trởng mạnh Hậu chế phẩm diệt côn trùng có hiệu suất thấp Sinh khối (bào tử tinh thể độc) tạo trình lên men đợc tách nhờ ly tâm, đợc làm khô phơng pháp lạnh đông ly tâm vắt Cuối cùng, sản phẩm đợc đóng thành gói sau đà trộn với chất phụ gia khác Đối với chế phẩm dạng bột khô (tiện lợi phổ biến nhất) dùng chất ®én nh− tinh bét, lactoza, ho¹t th¹ch, cao lanh Để tăng thêm độ dính chế phẩm, ngời ta dïng mét sè chÊt nh− bét mú, dextrin, cazein Chế phẩm Bt dạng sữa nh thuốc sữa Thuricide 90 TS ổn định bền lâu Trong trình sản xuất tách bào tử tinh thể (ly tâm sinh khối) không cần sấy khô mà đa vào nhũ tơng (nớc chứa dầu) Ngoài phơng pháp ly tâm, ngời ta dùng phơng pháp acid hoá dịch nuôi đến pH 6,0 6,2, sau chuyển sang giai đoạn tách Sau tách nhận đợc dạng bột nhÃo độ ẩm 85% với hiệu suất 100kg/m3 dịch nuôi với lợng bào tử 20.103/g Dịch nuôi cấy đà tách vi khuẩn sử dụng lại lần nữa, nhng không lặp lại nhiều lần nã tÝch luü nhiÒu chÊt øc chÕ sinh tr−ëng, nhiên dùng làm nguyên liệu sản xuất nấm men chăn nuôi Điều đảm bảo việc rút gọn khối lợng trình công nghiệp, giảm lợng nớc thải, tăng giá trị kinh tế trình Giai đoạn cuối tách để giải phóng bào tử tinh thể khỏi màng tế bào, ngời ta đa vào thiết bị đặc biệt, chuyên dùng, trộn với bột nhÃo 30 phút để trộn cho bào tử tinh thể đồng Sau đa bột nhÃo vào sản xuất chế phẩm, thành phẩm dạng bột nhÃo dạng khô Để sản xuất loại nhÃo ngời ta trộn sinh khối bào tử tinh thể độc víi CMC (Cacboxymetyl celulose), ph©n tư CMC hÊp thơ tinh thể bào tử Sản phẩm dạng dung dịch nhớt, không làm cho bào tử chết Sản xuất dạng có tính u việt nh giảm lợng thời gian để tiến hành sấy Dạng khô đợc sấy máy sấy phun đều, độ ẩm 10% trén víi cao lanh Tỉng sè bµo tư vµ tinh thể độc liên quan đến hoạt tính diệt côn trùng Do phơng pháp tiến hành đếm số lợng bào tử sống chế phẩm Bt., so sánh số lợng bào tử với hoạt tÝnh diƯt c«n trïng b»ng thư nghiƯm sinh häc Sè lợng nội độc tố đợc xác định biểu thị đơn vị quốc tế (IU) dựa tiêu chuẩn quốc tế E-61 Nghiên cứu thuốc trừ sâu vi sinh vật Bt đợc bắt đầu gần nớc phát triển, nơi mà việc sư dơng Bt cßn rÊt Ýt so víi thc trõ sâu hoá học Mặc dù việc sử dụng Bt hầu hết nớc phát triển phụ thuộc vào việc nhập khẩu, nhiên số nớc đà nghiên cứu sản xuất Bt họ: Trung Quốc Ai Cập hai nớc tiên phong việc Ai Cập ngời ta đà tiến hành ghép gen sinh độc tố vào vi khuẩn cố định đạm sản phẩm tạo vừa có khả diệt trừ Spodoptera littoralis vừa có khả cố định nitơ Sản xuất Bt Ai Cập đợc tổ chức quy mô pilot nồi lên men với dung tích 5m3 đặt nhà máy đờng rợu Hwandia, Giza Trung Quốc sản xuất quy mô lớn đợc thực hai phơng pháp lên men chìm thùng lên men xốp Cám lúa mì, bột ngô, đậu tơng, bánh hạt loại dầu, cám lạc thành phần môi trờng sử dụng sản xuất Bt Trong nhà máy nhỏ Hồ Bắc, sản lợng Bt tăng từ 26 năm 1983 đến 90 năm 1984, 160 năm 1985, 260 năm 1986, 360 năm 1987, 472 năm 1988, 732 năm 1989 đến 900 năm 1990 Bt ngày ®−ỵc sư dơng réng r·i ë 30 tØnh ®Ĩ diƯt trừ côn trùng gây dịch khác cho nông nghiệp công nghiệp, diệt trừ nhân tố gây bệnh cho ngời Tổng sản lợng Bt ớc tính năm 1990 1.500 tấn, phần sản phẩm Bt địa phơng đợc xuất sang Thái Lan Đông Nam Trung Quốc, Bt đợc sản xuất hàng loạt với phơng pháp đơn giản thích hợp cho nông dân số công nghệ đà trở nên phổ biến Hơn triệu hecta đà canh tác đợc bảo vệ thuốc trừ sâu vi sinh Bt Việc sử dụng Bt nớc phát triển bị hạn chế lý kinh tế, ngời ta muốn sản xuất Bt địa phơng với giá thành thấp, nhng hoạt tính diệt sâu cao Các môi trờng lên men khác gồm sản phẩm phụ công nghiệp nông nghiệp đà đợc sử dụng để sản xuất Bt số nớc phát triển nh Mehicô, Hàn Quốc, Nigeria, Brazin ấn Độ Bảng 14: Thành phần môi trờng lên men đợc sử dụng để sản xuất Bacillus thuringiensis số nớc phát triển (Salama, 1993) Tên nớc Thành phần môi trờng Tác giả Mêhicô Rỉ đờng, bột đậu tơng, bột ngô, CaCO3 + H2O Roldan Cs, 1998 Hàn Quốc Bột cá, đậu tơng, cám đỏ, bà vừng, gạo, cám Yoon Cs, 1987 Trung Quốc Cám lúa mỳ, trấu, bột chanh, bánh đậu tơng loại dầu bánh hạt loại dầu, cám lúa mỳ bét ng« Hussey, 1981 - Wang Tao, 1998 Nigieria Bét sắn lên men, ngô, đậu đũa Ejiofar & Okager,1989 Brazil Phụ phẩm công nghiệp giấy gỗ thêm tinh bột tan Moscardi,1988 ấn Độ Bột chanh bột đậu tơng thêm tinh bột tan rỉ đờng Mummgatti Raghunathan, 1990 Từ năm 1970 Việt Nam bắt đầu nghiên cứu sản xuất Bt Viện Công nghiệp thực phẩm, Viện bảo vệ thực vật, Đại học khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, Trung tâm vi sinh, Tổng công ty hoá chất sản xuất loại chế phẩm quy mô công nghiệp với chủng Bacillus thuringiensis var Kurstaki Bớc đầu chế phẩm Bt đà đợc đa vào sử dụng trừ số sâu hại nh sâu tơ, sâu xanh bớm trắng, v.v 3.2 Chế phẩm vi sinh vËt phßng trõ chuét ChÕ phÈm vi sinh vật diệt chuột Liên Xô (cũ) Bacterodensid sản phẩm đợc sản xuất từ vi khuẩn Salmonella enteriditis Isatchenko có tác dụng gây bệnh làm chết loại chuột nhà, chuột đồng, chuột cống, chuột đen Chế phẩm đà đợc sử dụng rộng rÃi Liên Xô (cũ), Mông Cổ Cu Ba, mang lại hiệu phòng trừ chuột cao Tại Việt Nam chế phẩm vi sinh vật phòng trừ chuột mang tên BIORAT (công ty BIOFARM - Cu Ba), MIROCA (ViÖn Khoa häc kü thuËt nông nghiệp Việt Nam), Bả diệt chuột sinh học (Viện Bảo vệ thực vật) đà đợc thử nghiệm đối tợng chuột Việt Nam Kết cho thấy chế phẩm có tác dụng tốt việc gây ốm làm chết loại chuột, lại không gây ảnh hởng xấu đến gia súc, gia cầm Sản phẩm vi sinh vật phòng trừ chuột đà đợc đăng ký vào danh mục thuốc bảo vệ thực vật đợc phép sử dụng Việt Nam đợc ứng dụng rộng rÃi nhiều địa phơng nớc Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật phòng trừ chuột đợc tóm tắt hình 10 Chủng VSV Kiểm tra Chất mang Xử lý Nhân giống sản xuất Kiểm tra Nhân giống cấp I Đóng gói Sinh khối VSV Tiệt trùng Tiêm dịch vào chất nhiễm ủ sinh khối Kiểm tra chất lợng Bảo quản sử dụng Hình 10 Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật phòng trừ chuột Các công đoạn việc sản xuất chế phÈm vi sinh vËt phßng trõ chuét bao gåm: + Tuyển chọn bảo quản chủng giống vi khuẩn: Từ mẫu bệnh tích chuột ăn chế phẩm vi khuẩn đợc phân lập theo theo sơ đồ hình 11 Mẫu bệnh tích (Máu, ruột non, ruột già, gan, tuỵ) Làm giàu môi trờng Rapoport cải tiến Nuôi cấy môi trờng thị Nuôi cấy môi trờng dinh dỡng Kiểm tra đặc điểm huyết Kiển tra đặc điểm sinh hoá Đánh giá hoạt tính chuột sống Bảo quản lu giữ Hình 11 Sơ đồ phân lËp tun chän vi khn g©y bƯnh cho cht Vi khuẩn sau phân lập bảo quản thạch nghiêng dới điều kiện lạnh thời gian 3-4 tuần, bảo quản môi trờng lòng trứng trắng điều kiện lạnh thời gian 6-12 tháng bảo quản điều kiện đông khô thời gian 3-5 năm Để trì hoạt tính vi khuẩn cần thiết phải thờng xuyên đa vi khuẩn vào thể chuột tái phân lập từ mẫu bệnh tích + Nhân sinh khối vi khuẩn Điều kiện nhân sinh khối S enteriditis Isatchenko đợc xác định : Môi trờng nuôi cÊy: n−íc chiÕt ®Ëu 20% + 3g pepton NhiƯt ®é nhân sinh khối: 30- 32oC pH môi trờng: 7,0 Thời gian nhân sinh khối: 36 - 48h Mức độ cấp khí: lít/phút/bình 20 lít môi trờng Sau thời gian lên men 36 mật độ vi khuẩn đạt 109 ữ 1010 vi khuẩn/ml + Lựa chọn tạo chất mang phù hợp Chất mang cho chế phẩm phải bảo đảm cho vi khuẩn tồn tốt, không gây ảnh hởng xấu đến môi trờng sử dụng phải nguồn thức ăn mà chuột a thích Tại Liên Xô (cũ) chất mang đợc lựa chọn hạt mạch cho chế phẩm dạng hạt bột xơng cho chế phẩm dạng bột Tại Việt Nam, qua trình nghiên cứu: thóc đồ đợc lựa chọn nguyên liệu làm chất mang cho chế phẩm Thóc đồ có u điểm: sẵn có, dễ chế biến, có sức hấp dẫn chuột cao, bảo đảm cho vi khuẩn sinh trởng phát triển tốt tồn thời gian dài Sản phẩm tạo từ thóc đồ bảo đảm mật độ 109 CFU/g sau tháng sản xuất III nấm gây bệnh côn trùng Khái quát chung nấm gây bệnh cho côn trùng Cũng nh− vi khn, nhiỊu lo¹i nÊm cã quan hƯ céng sinh hoại sinh với côn trùng, có nhiều loài nấm thực ký sinh, gây tợng bệnh lý dẫn đến huỷ diệt côn trùng Nấm gây bệnh cho côn trùng có ý nghĩa lớn gây chết thờng xuyên với tỷ lệ chết cao cho nhiều loài côn trùng hại tác nhân điều hoà tự nhiên hiệu Côn trùng chết nấm dễ nhận biết mắt thờng, sợi nấm mọc qua vỏ thể bao phủ toàn bề mặt thể côn trùng Cơ thể côn trùng bị chết nấm không bị tan rÃ, mà thờng giữ nguyên hình dạng ban đầu, toàn bên thể chứa đầy sợi nấm Hầu hết các loại nấm gây bệnh cho côn trùng xâm nhập vào thể vật chủ không qua đờng miệng, mà qua lớp vỏ thể, nghĩa phải có tiếp xúc nguồn nấm với bề mặt thể vật chủ Bào tử nấm bám vào bề mặt thể vật chủ, điều kiện đủ độ ẩm bào tử mọc mầm xâm nhiễm vào bên thể côn trùng qua lớp chitin nhờ áp lực giới hoạt động men nấm Nấm tiết loại men làm mềm lớp vỏ chitin tạo thành lỗ thủng nơi bào tử mọc mầm, qua lỗ thủng mầm bào tử xâm nhập vào bên thể côn trùng Do khả xâm nhập vào bên thể côn trùng qua lớp vỏ thể nên nấm ký sinh đợc côn trùng chích hút pha phát triển côn trùng nh trứng, nhộng mà vi sinh vật khác không ký sinh đợc Nấm xâm nhập vào bên thể côn trùng qua đờng miệng Từ miệng, bào tử tới ruột qua thành ruột xâm nhiễm vào tế bào nội quan để gây bệnh Xâm nhập kiểu chủ yếu bào tử loài nấm nớc Dới tác động độc tố bào tử nấm tiết dẫn tới tợng ngừng nhu động ruột vật chủ Thí dụ, trờng hợp bào tử nấm Aspergillus ruột ong mật Bào tử nấm xâm nhập qua lỗ thở quan sinh dục để vào bên thể côn trùng, nhng Sự xâm nhiễm phát triển nấm thể côn trùng trình phức tạp, gồm ba giai đoạn sau đây: + Giai đoạn xâm nhập: từ bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào xoang thể côn trùng + Giai đoạn phát triển nấm thể côn trùng đến côn trùng chết: giai đoạn sống ký sinh nấm Trong giai đoạn nấm thờng tạo nhiều sợi nấm ngắn Những sợi nấm ngắn đợc phân tán khắp thể theo dịch máu Về phía vật chủ có phản ứng tự vệ nh thực bào, xuất tế bào bạch huyết Phản ứng tự vệ thời gian ngắn kìm hÃm xâm nhập nấm vào nội quan Khi sợi nấm xâm nhập vào tất phận chúng đồng thời gây chết vật chủ + Giai đoạn sinh trởng phát triển nấm sau vật chủ chết: giai đoạn hoại sinh nấm ký sinh côn trùng Trong giai đoạn nấm hình thành bào tử conidi, nấm mọc thành sợi bên bề mặt thể vật chủ Sau bào tử đợc tạo thành lớp sợi nấm bề mặt thể vật chủ Các nấm gây bệnh cho côn trùng sinh trởng phát triển để hoàn thành chu kỳ sống chúng: từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử Nấm gây bệnh côn trùng có tính chuyên tÝnh hĐp, chØ ký sinh mét vËt chđ hc mét giai đoạn định vật chủ, nhiều trờng hợp chúng ký sinh có tính chuyên hoá thức ăn rộng, ký sinh nhiều loài côn trùng thuộc giống, họ, khác Nấm gây bệnh cho côn trùng thuộc nhiều nhóm nấm khác nhau: từ nhóm nấm nguyên thuỷ sống dới nớc đến nhóm nấm bậc cao sống cạn Nấm gây bệnh cho côn trùng có mặt lớp nấm: Nấm bậc thấp Phycomycetes, nấm túi Ascomycetes, nấm đảm Basidiomycetes nấm bÊt toµn Deuteromycetes - Líp nÊm bËc thÊp Phycomycetes: Trong lớp nấm này, loài ký sinh côn trùng tập trung ba bộ: Chytridiales, Blastocladiales Entomophthorales Đặc biệt có họ nấm gồm tất loài ký sinh côn trùng nh Entomophthoraceae Coelomomycetaceae Những giống nấm ký sinh côn trùng quan trọng cđa líp nÊm bËc thÊp lµ: Coelosporidum, Chytridiopsis (bé Chytridiales), Coelomonyces (bé Blastocladiales) vµ Entomophthora (bé Entomoph thorales) - Líp nÊm tói Ascomycetes: Trong líp nÊm tói cã bé Laboulbiniales nấm ngoại ký sinh côn trùng có chuyên tính cao, loài nấm túi khác nội ký sinh côn trùng Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho côn trùng là: Cordyceps, Aschersonia (bộ Hypocreales) - Lớp nấm đảm Basidiomycetes: Trong lớp nấm đảm giống có loài gây bệnh côn trùng Đó giống Septobasidium Uredinella - Lớp nấm bất toàn Deuteromycetes: Phần lớn loài nấm bất toàn ký sinh côn trùng thuộc Moniliales Những giống Beauveria, Paecilomyces, Spicaria, Metarhizium, Cephalosporium Sorosporella chứa loài xâm nhiễm vào côn trùng đà tạo thành độc tố gây chết vật chủ khoảng thời gian định Một số nấm gây bệnh côn trùng 2.1 Nấm xanh Metarhizium anisopliae Nấm đợc Metschinikov phát vào năm 1878 bọ hại lúa mì bị bệnh Nấm xanh thờng gây bệnh cho côn trùng sống đất, thuộc hệ vi sinh vật đất tự nhiên Conidi nấm xanh sau 24 tiếp xúc với bề mặt thể côn trùng bắt đầu mọc mầm xâm nhập vào bên Trong thể côn trùng sợi nấm phát triển xâm nhập vào phận nội quan Sau vật chủ chết, sợi nấm mọc thể côn trùng tạo thành lớp nấm màu trắng hồng nhạt Trên tạo thành conidi màu xanh xám Quá trình phát triển bệnh thể côn trùng 4-6 ngày tuỳ thuộc loài tuổi vật chủ nh nguồn bệnh ban đầu Vào giai đoạn cuối trình phát triển bệnh lý côn trùng chết Nấm M anisopliae có dạng: M anisopliae var major có bào tử dài M anisopliae var anisopliae có bào tử ngắn Nấm xanh sinh độc tố destruxin A B Nấm xanh ký sinh 200 loài côn trùng, thuộc bé: Orthoptera (11 loµi), Dermaptera (1 loµi), Hemiptera (21 loµi), Lepidoptera (27 loµi), Diptera (4 loµi), Hymenoptera (6 loµi) vµ Coloptera (134 loài) Nấm xanh nuôi cấy môi trờng thức ăn nhân tạo Nhiều loài chi Metarhizium có khả diệt côn trùng thuộc Elaleridae Curculionidae (Coleoptera), ấu trùng muỗi Aedes aegypti Anopheles stephensi Clex pipiens thuộc Diptera, côn trùng hại lúa Scotinophara coarctata thuéc hä Heminoptera, ch©u chÊu Schistocera gragaria thuéc hä Testigolidae, loµi mèi Nasutitermes exitiosus (Hill) thuéc hä Termitidae  ... trõ cht cao T¹i Vi? ?t Nam chÕ phÈm vi sinh vật phòng trừ chuột mang tên BIORAT (công ty BIOFARM - Cu Ba), MIROCA (Vi? ?n Khoa häc kü tht n«ng nghiƯp Vi? ?t Nam), B¶ diƯt cht sinh häc (Vi? ?n B¶o vệ thực... loại dầu, cám lạc thành phần môi trờng sử dụng sản xuất Bt Trong nhà máy nhỏ Hồ Bắc, sản lợng Bt tăng từ 26 năm 1983 đến 90 năm 1984, 160 năm 1985, 260 năm 19 86, 360 năm 1987, 472 năm 1988, 732... Raghunathan, 1990 Từ năm 1970 Vi? ??t Nam bắt đầu nghiên cứu sản xuất Bt Vi? ??n Công nghiệp thực phẩm, Vi? ??n bảo vệ thực vật, Đại học khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, Trung tâm vi sinh, Tổng công ty hoá chất sản