Insulin và công ngh ệ sản xuất insulin trên thế giới [10/10/ ời ta đã nhận thấy rằng bệnh tiểu đường là một trong những c ăn b ọa nghiêm trọng tới sức khoẻ của con ngư ời.Trên thế giới, con số ững ng ười mắc bệnh tiểu đường ước tính khoảng từ 151 triệu đ ến 171 ệu (n ăm 2000), và dự kiến con số này sẽ là 221 triệu (n ăm 2010), năm 2030 s ẽ lên đến 366 triệu người. Và đương nhiên, việc gia tăng con s ố ững ng ười mắc bệnh tiểu đường sẽ kéo theo sự gia tăng các bi ến chứng ăn b ệnh này như thần kinh, xơ vữa động mạch… Theo ư ớc tính, số ời tử vong trên thế giới do bệnh tiểu đường trong n ăm 2000 là 2,9 tri và con s ố này sẽ còn tiếp tục gia tăng. Trong đó, tiểu đư ờng type 2 chiếm ảng h ơn 90% tổng số ca bệnh. Điều đó đòi hỏi phải tìm ra những ớng tiệp cận mới cho việc ng ăn ngừa và điều trị căn bệnh này. ệnh tiểu đường là một căn bệnh chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Tiểu đư a do tác đ ộng phức tạp giữa gene và các yếu tố môi trường, từ đó d ẫn tới ự bất bình th ường trong quá trình điều hoà lượng glucose trong cơ th ể liên quan t ới những vấn đề về hormone insulin. Insulin là một hormone được tiết ra bởi tế bào beta trong đảo Langerhans củ n tụy khi động vật tiêu ăn thức ăn, đây là hormone quan trọng nhấ t cho nh lưu tr ữ, sử dụng đường, acid amin và acid béo và duy trì lượng đườ ng má u. Hàm lượng đường trong máu (hay còn gọi là hàm lượ ng glucose má u) là nguồn năng lượng thiết yếu cho cơ thể. Nếu lượng đườ ng trong u không duy trì ở mức bình thường có thể gây ra những căn bệ nh nguy hi m l ượng đường trong máu tăng có thể gây ra sự bài tiết đường qua n ướ k ết quả là bị mất glucose, hiện tượng này còn gọi là bệnh tiểu đường . trạ ng này tiếp diễn trong thời gian dài, sẽ gây ra những biến chứ ng nguy m trong mô , các cơ quan của cơ thể. Mặt khác, hàm lượng đườ ng trong m d ẫn đến năng lượng cung cấp cho cơ thể bị thiếu hụt gây nguy hiể m cho duy trì cơ thể sống. m l ượng đường trong máu được duy trì ở mức bình thường là do sự cân b cá c yếu tố làm tăng lượng đường trong máu (như glucagon, hormone cortisol , catecholamine) với các yếu tố làm giảm lượng đường trong máu. Insulin hormone duy nh ất có thể làm giảm lượng đường trong máu. Do đó, khi khả năng ti ết hormone này giảm đi (do một số nguyên nhân) thì insulin không cung ủ cho cơ thể gây ra bệnh tiểu đường phụ thuộc insulin (Insulin- Dependent Diabetes Mellitus - IDDM), còn gọi là tiểu đường type I. Với những bệ nh nhân c ti ểu đường type I thì insulin là phương thuốc điều trị duy nhất. Insulin ng ười là một polypeptide bao gồm một chuỗi A với 21 acid amin và m i B v ới 30 acid amin, có một cầu nối disulfur trong chuỗi A và 2 cầu nố i disufur n ối giữa hai chuỗi A và B. Insulin ban đầu được tổng hợp ở dạng “preproinsulin” (tiền insulin) trên ribosome trong tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tụy. Preproinsulin là một phân tử dạng thẳng bao g ồ t peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptide C với 31 acid amin và chuỗi A nối với nhau theo thứ tự SP-B-C-A. Khi vận chuyển qua lướ peptide tín hiệu bị phân cắt tạo ra proinsulin (B-C-A). Proinsulin hình thà ố i disulfur trong lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba. Proinsulin bị ở i enzyme PC1/3 tại liên kết giữa chuỗi B và peptide C và sau đó bị phân ở i enzyme PC2 ngay vị trí liên kết giữa chuỗi A và peptide C. Hai acid amin u N của peptide nối với đầu C của chuỗi B khi bị phân cắt bởi PC1/3 sẽ đ phân c ắt ra khỏi chuỗi B bởi enzyme carboxypeptidase H. Kết quả cuối cù ng quá trì nh phân cắt tạo thành insulin. Hình 1. C ấu trúc của phân tử insulin Trong năm 2005, nhu c ầu insulin dùng trong trị bệnh tiểu đường ư ớc tính khoảng 4.000 đ ến 5.000 kg và dự kiến năm 2010 là 16.000 kg. Nhu c ầu về insulin của ế giới v ượt qua con số vài tấn/năm và vì th ế nguồn cung cấp insulin cho trị ệnh tiểu đường đang thiếu hụt. Từ những thập niên 1920 cho đ ến những n ầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách cô lập từ tuyến tụy củ ng v ật như heo và bò. Tuy nhiên, insulin người có sự khác biệt trong thà nh n acid amin so v ới insulin bò (hai vị trí trong chuỗi A và một vị trí trong chu và insulin heo (một vị trí trong chuỗi B). Do đó gây ra những tác dụ ng không mong mu ốn (như dị ứng) khi sử dụng insulin có nguồn gốc từ heo hay bò. Ngoài quá trình s ản xuất và tinh sạch insulin từ đ ộng vật còn gặp nhiều khó kh Sau đó , các phương pháp bán tổng hợp insulin người từ insulin heo và bò c phát triển bằng các sử dụng phản ứng chuyển peptide ( transpeptidation ng trypsin . Tuy nhiên, insulin tái tổ hợp được sản xuất bằ ng công ngh p di t ruyền hiện đang được sử dụng chủ yếu do chi phí sản xuất thấ p quả sả n xuất cao. Insulin người đư ợc sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ạiCông ty Genetech (Hoa Kỳ) và sản phẩm này được đưa ra thị trư ờng vào năm 1982. Trong l ịch sử, đây cũng là lần đ ầu tiên các nhà nghiên cứu ứng dụng công ngh ệ sinh học vào dược phẩm thành công. ề sau , nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp đã được phát triển. Ví dụ phương pháp sản xuất của Tập đoàn Eli Lilly: phương pháp sản xuất nà y bi n chu ỗi A và chuỗi B riêng biệt bằng cách sử dụng Escherichia coli, sau đ thu chu ỗi A và chuỗi B, trộn với nhau in vitro tạo cầu nối disulfur. Phương phá có hiệu quả sản xuất thấp. Do đó, Eli Lilly phát triển một phương phá p n hơn , phương pháp này biểu hiện proinsulin thay vì biểu hiện chuỗi A và riêng bi ệt như phương pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau đó phân c ắ peptide C khỏi hai chuỗi A và B bằng trypsin và carboxypeptidase, tạo thà nh insulin. Hình 2. S ản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng biệt t phương pháp khác được phát triển bởi tập đoàn Novo Nordisk, phương nà y biểu hiện miniproinsulin bao gồm chuỗi B và chuỗi A nối vớ i nhau b acid amin , được biểu hiện trong nấm men, sau đó xử lý miniproinsulin in vitro ng trypsin tạo thành insulin. Phương pháp này có nhiều thuận lợi như c ầ disulfur đ ược hình thành trong quá trình biểu hiện và quá trình tiế t miniproinsulin miniproinsulin này được tách chiết và tinh sạch dễ dàng do được tiết th ẳ ườ ng nuôi cấy. tạ i, người ta vẫn tiếp tục phát triển những phương pháp sản xuấ t insulin p . Công ty Hoechst đã đưa ra một phuơng pháp sản xuấ t insulin bao g u hi ện một dạng dẫn xuất mới của insulin hoặc biểu hiện preproinsulin E. coli ; tạo các cầu nối disulfur invitro; sau đó, xử lý bằng lysylendopeptidase ho ặc clostripain/carboxypeptidase B; cuối cùng tạ o ra insulin i đây nh ất, Công ty Bio-Technology General đã đưa ra một phương phá Trong phương pháp này, một dạng protein dung hợp (fusion protein) bao g ồ superoxide dismutase (SOD) gắn với proinsulin được biểu hiện trong tế bà o B ằng cách này, hiệu suất của quá trình biểu hiện protein và hiệu quả củ quá trì nh hình thành các cầu nốii. Sau đó, proinsulin được chuyển thà nh insulin ử lý với trypsin và carboxypeptidase B. Bằng những cách tương tự như ng ười ta đã đưa ra ngày càng nhiều các phuơng pháp sản xuấ t insulin và cả i tiến nhièu hơn để nâng cao hiệu quả của các quá trình biểu hiệ n protein , hình thành cầu nối disulfur, chuyển proinsulin thành insulin. Hình 3. S ản xuất insulin tái tổ hợp trên vi khuẩn ện nay, hầu hết những ph ương pháp sản xuất insulin thương mại đ ều dựa trên các ch ủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae) hoặc vi khuẩn (E. coli) k ết hợp ới các kỹ thuật gene để sản xuất insulin người tổng hợp. Ngư ời ta nuôi cấy các ủng này trên quy mô lớn , trong những bồn lên men bằng thép đặt tiền, sau đó insulin đư ợc ly trích ra, tinh sạch để được sản phẩm cuối cùng. ề cá c hệ thống tế bào dùng để biểu hiện insulin tái tổ hợp, người ta s ử dụ t đa dạng từ vi sinh vật tới tế bào động vật và cả thực vật. Trong số đó, t ế bà vi sinh v ật được sử dụng nhiều nhất do chúng dễ thao tác, dễ đưa vào áp dụ quy mô s ản xuất công nghiệp, nhiều nhất là E. coli và nấm men. Gần đây, ng ta đưa ra m ột hệ thống biểu hiện khác cho các loại protein tái tổ hợp – đó Bacillus brevis . c đ ích của những nghiên cứu, phát minh hiện tại là muốn phát triển mộ t h ng bi ểu hiện và 1 phương pháp sản xuất insulin có năng suất cao và hi ệ n xu ất phải ngang bằng hay vuợt trội hơn so với những hệ thống sản xu ấ insulin đ ã từ trước tới nay. Hay nói cách khác, các nghiên cứu trong giai đ oạ y nh ằm cải tiến phương pháp cổ điển chuyển các tiền chất của insulin thà insulin ; nghiên cứu tìm ra môi trường tối ưu cho việc hình thành các cầu n ố t cho vi ệc biểu hiện hoạt tính của insulin; tìm ra một hệ thống biểu hiệ n insulin cho năng su ất, sản luợng cao. . Insulin và công ngh ệ sản xuất insulin trên thế giới [10/10/ ời ta đã nhận thấy rằng bệnh tiểu đường là một trong những c ăn b ọa nghiêm trọng tới sức khoẻ của con ngư ời .Trên thế giới, . trypsin . Tuy nhiên, insulin tái tổ hợp được sản xuất bằ ng công ngh p di t ruyền hiện đang được sử dụng chủ yếu do chi phí sản xuất thấ p quả sả n xuất cao. Insulin người đư ợc sản xuất bằng kỹ thuật. vào dược phẩm thành công. ề sau , nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp đã được phát triển. Ví dụ phương pháp sản xuất của Tập đoàn Eli Lilly: phương pháp sản xuất nà y bi n chu ỗi