Đang tải... (xem toàn văn)
Đề tài được thực hiện trên nấm Rhizoctonia solani. Đây là nấm có thể gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau., ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của cây trồng.
PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Rhizoctonia solani Kuhn lồi nấm phổ biến đất, có địa bàn phân bố rộng khắp giới Nấm gây hại giai đoạn phát triển từ tiền nảy mầm đến trổ bông, tạo tán tất phận từ rễ đến trái Nấm nguyên nhân gây bệnh đốm vằn lúa Ngồi ra, nấm cịn ngun nhân gây thối hạt giống làm thối thân, thối rễ, thối trái gây bệnh cháy nhiều trồng thuộc họ thực vật khác Ở nước ta, điều kiện khí hậu tập quán canh tác thích hợp cho nấm Rhizoctonia solani tồn lưu, phát triển gây bệnh Bệnh đốm vằn hại lúa nấm gây đánh giá bệnh nguy hiểm, làm giảm suất lúa cách nghiêm trọng tỉnh phía Nam Nấm xem tác nhân quan trọng gây bệnh chết cho vải thuốc nhiều loại rau đậu Hiểu biết lịch sử đời sống nấm gây bệnh quan trọng việc phát triển chiến lược thích hợp để quản lí bệnh chúng gây Nghiên cứu giới công bố đa dạng di truyền mối quan hệ quần thể nấm R solani từ nhiều trồng nhiều vùng địa lí khác Tuy nhiên nghiên cứu vấn đề nước ta cịn Khả sử dụng kỹ thuật phân tử để phân tích đa dạng di truyền dòng phân lập nấm R solani chứng minh (Kuninaga ctv, 1997; Matsumoto ctv, 1996; Liu Sinclair, 1992; O’Brien, 1994; Boysen ctv, 1996) Các kỹ thuật lai DNA/DNA, RFLP, RAPD, Southern blot phân chia dịng phân lập R solani thành nhóm riêng biệt mặt di truyền Trong có kỹ thuật đọc trình tự DNA dường cung cấp số liệu tốt cho việc nhận biết biến động di truyền quần thể R solani Từ nhận định trên, phân công Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, tiến hành đề tài :”Bƣớc đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS nấm Rhizoctonia solani Kuhn” 1.2 Mục đích Bổ sung thêm thông tin quần thể nấm R solani nước ta làm sở cho việc phát triển chương trình lai tạo thích hợp cho vùng sinh thái riêng biệt 1.3 Yêu cầu Thu thập mẫu thực vật bệnh nhiều tỉnh phân lập nấm R solani Ni cấy sinh khối dịng nấm phân lập Li trích DNA dịng nấm Tiến hành phản ứng PCR với DNA vừa li trích vùng ITS rDNA sử dụng hai mồi (primer) ITS4 ITS5 Đọc trình tự vùng rDNA – ITS với hai primer ITS1 ITS4 1.4 Giới hạn đề tài Việc đọc trình tự vùng rDNA – ITS nấm R solani thực dòng nấm đại diện PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu nấm Rhizoctonia solani 2.1.1 Vị trí phân loại Nấm Rhizoctonia solani thuộc nấm trơ Mycelia Sterilia, lớp nấm bất toàn Fungi Imperfecti, giai đoạn sinh sản hữu tính gọi Thanatephorus cucumeris, thuộc lớp nấm Basidomycetes Đây nhóm nấm lớn, phân bố rộng, kí sinh khơng chun tính có phổ kí chủ rộng (Carling ctv, 1992) Hiện nay, chưa thấy cơng bố giai đoạn hữu tính nấm Việt Nam Nấm gây bệnh chủ yếu dạng vơ tính Rhizoctonia solani 2.1.2 Đặc điểm hình thái nấm Rhizoctonia solani Nấm R solani có dạng sợi dài, tạo hạch không sinh bào tử Sợi nấm mơ tế bào cịn non khơng có màu, trưởng thành có màu nâu vàng nhạt Sợi nấm đa bào, phân nhánh tương đối thẳng góc với sợi nấm Chỗ phân nhánh thắt nhỏ lại Sợi nấm trưởng thành có đường kính từ – 12µm (Nguyễn Việt Long, 2001) Nấm tạo hạch kí chủ, hạch khơng đều, có hình trịn dẹt phía dưới, cịn non có màu trắng, già có màu nâu đậm Bề mặt hạch thơ có nhiều lổ nhỏ li ti Hạch nấm hay nhiều, nhỏ hay lớn tùy thuộc vào dòng nấm khác Bào tử hậu nấm gặp, phát sinh có độ ẩm cao Sinh sản hữu tính tạo đảm đơn bào tử Ở nước ta, nấm R solani sinh trưởng phát triển chủ yếu dạng sợi hạch nấm, chưa thấy dạng sinh sản hữu tính (Nguyễn Việt Long, 2001) 2.1.3 Đặc điểm sinh lí Nấm R solani phát triển thích hợp nhiệt độ từ 27 – 300C có khoảng pH thích hợp 2,5 – 7,8 nấm hoạt động mạnh khoảng pH từ 5,4 – 6,7 Ở nhiệt độ 28 – 300C hạch nấm hình thành nhiều Dịng nấm có hạch lớn có độc tính cao Trên đồng ruộng, hạch nấm tồn lâu đất, nguồn gây bệnh chủ yếu Hạch nấm nảy mầm 16 – 30 0C, khuẩn ty phát triển nhiệt độ 21 – 380C ẩm độ cao 95 – 96% Nấm R solani sống tốt loại đất: thịt pha cát, đất thịt mùn đất sét pha cát Hạch nấm chịu ngập 96 mà không giảm sức sống giữ khô từ 24 – 168 sau ngập Tuy nhiên, thời gian ngập kéo dài 168 làm khả sống sót ngập nước làm giảm tiềm lây bệnh từ hạch nấm nằm nước (Nguyễn Việt Long, 2001) Nấm R solani lây lan chủ yếu hạch nấm qua cỏ dại, qua rơm rạ hạch rơi rụng từ vụ trước Các hạch nấm gặp điều kiện thuận lợi phát triển thành sợi nấm gây bệnh trở lại Ngồi ra, nấm lưu tồn thân, xác bã thực vật đất Nấm lan truyền bệnh sợi nấm tồn gốc rạ bị bệnh sau thu hoạch Sự lan truyền hạch nấm dịng nước đi, mưa dòng nước đồng ruộng Các hạch nấm gặp kí chủ thích hợp bám vào phát triển (Papavizas ctv, 1957) Trong phịng thí nghiệm, nấm R solanni mọc tốt nhiều loại mơi trường khác PDA, PGA, PGB, khơng địi hỏi mơi trường chuyên biệt Nhưng nấm phát triển tốt môi trường PGA Nấm phát triển nhanh, khoảng – ngày đầy đĩa petri hạch nấm bắt đầu hình thành Sợi nấm lúc đầu màu trắng khoảng – ngày sau sợi nấm chuyển thành màu nâu Ban đầu, hạch nấm nhỏ li ti có màu trắng Hạch thường mọc rải rác khắp đĩa, số dịng nấm hạch mọc rời có dịng, hạch mọc thành mảng liên kết Sau – ngày, hạch nấm lớn dần chuyển thành màu nâu đậm Trên môi trường ni cấy, hạch nấm có kích thước lớn hạch nấm điều kiện tự nhiên Nấm R solani lưu giữ nhiệt độ phịng từ – 12 tháng ống nghiệm chứa môi trường PGA 2.1.4 Phổ kí chủ nấm Rhizoctonia solani Nấm R solani nấm đa thực bán kí sinh điển hình, có phổ kí chủ rộng Nấm xâm nhiễm gây bệnh nhiều loại trồng khác Có khoảng 200 lồi thực vật bao gồm lương thực, hoa màu, công nghiệp loại cỏ khác bị nấm gây hại Nấm R solani xuất khắp nơi giới gây thiệt hại nhiều loại trồng khác Nấm R solani có khả gây bệnh nhiều loại khác nhau, gây bệnh bao gồm nhiều loại như: lúa, ngô (bắp), họ đậu, lục bình, rau muống,…Theo Gangopadyay Chaksabarti (1982) nấm Rhizoctonia solani loại đa kí chủ gây hại hầu hết trồng thuộc 32 họ 20 loại cỏ thuộc 11 họ thực vật khác Nấm gây bệnh chết rạp lở cổ rễ tr0ên cà phê, trà, thối cổ rễ chuối, đậu phọng, gây cháy dưa chuột bầu bí, gây lở cổ rễ vải, héo vàng khoai tây (Nguyễn Việt Long, 2001) 2.1.5 Sự xâm nhiễm khả gây bệnh R solani xâm nhập vào kí chủ gây bệnh mạnh điều kiện nhiệt độ tương đối cao 25 – 30 0C, ẩm độ khoảng 95% Nấm xâm nhập vào mơ qua khí khổng xun trực tiếp qua lớp cutin, qua vết thương giới trực tiếp qua biểu bì Nấm thường hình thành tản lây nhiễm trước xâm nhập vào mô để hấp thu chất dinh dưỡng làm chết 2.2 Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 2.2.1 Giới thiệu kĩ thuật PCR Kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction), Kary Mullis cộng phát minh năm 1985, công cụ quan trọng nghiên cứu sinh học phân tử Việc phát minh máy thermocycler (máy chu trình nhiệt tự động) sử dụng enzyme Taq DNA polymerase phản ứng PCR bước phát triển quan trọng thí nghiệm sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) Trong phản ứng PCR, mạch đơn tổng hợp lại làm khn cho q trình tổng hợp mạch chu kì Sự tổng hợp mạch đơn DNA cần tham gia primer tạo 3’ -OH tự Các nucleotide gắn vào vị trí nhóm -OH kéo dài tạo thành mạch (Khuất Hữu Thanh, 2003) 2.2.2 Qui trình Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kì nối tiếp Mỗi chu kì gồm bước thường xảy khoảng 25 – 45 chu kì với giai đoạn sau: giai đoạn biến tính, giai đoạn lai, giai đoạn kéo dài 2.2.2.1 Biến tính (denature) Phân tử DNA làm biến tính (denaturation) nhiệt độ cao khoảng 940C – 96 C thời gian 30 giây đến phút Ở giai đoạn phân tử DNA mạch kép tách thành mạch đơn Chính mạch đóng vai trị mạch khn cho tổng hợp mạch bổ sung 2.2.2.2 Giai đoạn lai (annealing) Nhiệt độ đựơc hạ thấp cho phép mồi (primer) bắt cặp với khuôn, thực nghiệm nhiệt độ phụ thuộc vào nhiệt nóng chảy mồi (primer) Thời gian giai đoạn 30 giây đến phút 2.2.2.3 Kéo dài (extension) Nhiệt độ tăng đến 720C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt Thời gian giai đoạn phụ thuộc vào độ dài trình tự DNA, thường từ 30 giây đến vài phút tùy thuộc vào kích thước trình tự DNA cần khuếch đại Sau vài chục chu kì số lượng DNA khuếch đại tăng theo hàm số mũ sau: M = m.2n Trong đó: M: số lượng DNA cần tổng hợp m: số lượng DNA ban đầu n: số chu kì phản ứng Trong trình PCR chu kì cuối nhiệt độ cần tăng lên – 20C Do sau, lượng primer giảm lượng khuôn tăng lên, mặt khác enzyme taq polymerase hoạt động yếu dần tác động nhiệt độ Vì vậy, nhiệt độ tăng chu kì cuối nhằm làm tăng hiệu tổng hợp DNA 2.2.3 Các thành phần ảnh hƣởng đến phản ứng PCR Để thực phản ứng PCR, dung dịch phản ứng phải có thành phần cần thiết cho chép DNA, bao gồm : iTaq DNA polymerase buffer DNA khuôn (template) Enzyme iTaq DNA polimerase mồi (primer) dNTP’s 2.2.3.1 DNA khuôn (template) DNA khn sau li trích tinh dùng cho phản ứng PCR Khi dùng để khuếch đại vùng mục tiêu từ DNA, số lượng DNA tính sở mol hay nanogram (ng) Phép tính giúp xác định lượng DNA cần phải có, số chu kì để tổng hợp DNA với số lượng mong nuốn Thông thường người ta sử dụng lượng DNA từ 10 – 100ng cho phản ứng PCR tích từ 25µl – 50µl Phản ứng PCR tối ưu với đoạn DNA khn hồn tồn tinh Khi đoạn khn cịn lẫn protein, hiệu PCR giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh DNA khuôn (Khuất Hữu Thanh, 2003) 2.2.3.2 Enzyme Trong phản ứng PCR, người ta sử dụng enzyme Taq DNA polymerase Đây enzyme chịu nhiệt Enzyme phân lập từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus (Taq) Taq polymerase có đặc điểm như: hồi phục sau chịu tác động nhiệt, enzyme hoạt động tốt nhiệt độ cao có tính ổn định nhiệt cao Nhiệt độ tối hảo enzyme Taq phản ứng sinh tổng hợp DNA khoảng 70 – 720C Enzyme cho phép tổng hợp dây DNA có tính lấp lấp lại nhiều lần Nồng độ enzyme DNA polymerase đóng vai trị định phản ứng PCR Thông thường, nồng độ enzyme khuyến cáo sử dụng từ – 2,5U cho phản ứng từ 25µl – 50µl Nếu nồng độ Taq q cao sản phẩm khơng chun tính xuất làm sai lệch kết Nếu lượng Taq q thấp khơng đủ số lượng để xúc tác tạo sản phẩm theo mong muốn 2.2.3.3 Mồi (primer) Trong PCR chuẩn cần có cặp primer Sự khuếch đại chuyên biệt đoạn DNA cần nghiên cứu, phải tùy thuộc vào primer tương ứng Có hai loại primer phản ứng PCR chuẩn, primer xi (forward primer) primer ngược (reserve primer) Primer xuôi bắt cặp gắn vào đầu 3’ mạch khuôn 5’ – 3’, primer ngược bắt cặp bổ sung gắn đầu 3’ mạch khuôn 3’ – 5’ Đối với primer hai yếu tố ảnh hưởng tới nhiệt độ q trình tác động đầu dây đơn chiều dài primer thành phần G, C cấu tạo primer Nhiệt độ tác động đầu dây đơn tính sau: Tm = 2x(A+T)+4x(G+C) Trong cấu trúc primer thông thường có khoảng 15 – 30 nucleotide Primer có nhiều G C số lượng nucleotide cịn khoảng 18 – 20 nucleotide (Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 1999) Khi chọn primer nhiệt độ nóng chảy (Tm) hai primer chênh lệch khơng lớn Trình tự DNA cần khuếch đại, trình tự nằm hai primer không nên lớn, thường không kilobase (kb) (dẫn theo Khuất Hữu Thanh, 2003) Trong hầu hết ứng dụng PCR có nồng độ hai primer Người ta khuyến khích sử dụng nồng độ primer khoảng từ – 25pmol cho phản ứng từ 25µl – 50µl (dẫn theo Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 1999) 2.2.3.4 Ion magnesium (Mg2+) Một nhân tố ảnh hưởng lớn tới phản ứng PCR dung dịch đệm ion Mg2+ Kết phản ứng tốt ta cho vào dung dịch phản ứng nồng dộ Mg2+ tối hảo Nống độ Mg2+ có ảnh hưởng đến q trình như: Q trình annealing primer Ảnh hưởng đến hoạt động enzyme Taq DNA polymerase Mg2+ tác nhân kích họat enzyme Taq hoạt động Mặt khác, Taq polymerase nhạy cảm với với ion Mg2+ Môi trường cho phản ứng PCR có tính chất ion nên dung dịch đệm trở nên động Do đó, nồng độ ion Mg2+ dung dịch đệm cao hay thấp ảnh hưởng khác phản ứng PCR Nồng độ Mg2+ cao làm cho dây đôi DNA ổn định hơn, làm biến tính tách DNA từ sợi đôi thành sợi đơn giảm, kết sản phẩm PCR Lượng dư Mg2+ làm cho tượng annealing khơng chun tính xảy ra, q trình bắt cặp vị trí khơng xảy cho sản phẩm không mong muốn với số lượng lớn, độ chuyên tính thấp Ngược lại, nồng độ Mg2+ thấp, làm xấu trình extension (kéo dài chuỗi mã đối lập với dây gốc) Do đó, người ta cần phải xác định nồng độ tối ưu ion Mg2+ nhằm đảm bảo kết số lượng sản phẩm chuyên tính sản phẩm PCR 2.2.4 Ứng dụng kĩ thuật PCR PCR có ứng dụng rộng cơng nghệ sinh học đại Theo nguyên tắc , có nhiều bổ sung để đưa PCR phục vụ nhiều mục tiêu khác nhau, nhiều lĩnh vực khác Ứng dụng di truyền PCR dùng để nhân vơ tính DNA với số lượng lớn PCR công cụ đắc lực cho việc lập đồ gen sinh vật Phương pháp gọi phân tích DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (Random amplified polymorphism DNA, RAPD) Trong phương pháp RAPD, PCR thực với primer ngẫu nhiên (random primer) Kết tạo số đoạn DNA có chiều dài khác nhau, đặc trưng cho lồi, chí cá thể So sánh điện di sản phẩm PCR nhiều dịng có đặc tính khác lồi với nhiều primer khác giúp xác định đồ gen sinh vật (Nguyễn Văn Uyển,1995) Ứng dụng nhận dạng mức phân tử Do RAPD cho kết đặc trưng cho cá thể, sử dụng kết RAPD để nhận dạng, giống lấy dấu vân tay nhận dạng người Ngoài ứng dụng hình sự, PCR dùng để phân loại thực vật, xác định mối quan hệ chúng cách xác (Nguyễn Văn Uyển,1995) Ứng dụng chẩn đốn bệnh PCR có ưu điểm nhạy, với hay nhiều cặp primer ta xác định sinh vật gây bệnh thông qua đặc trưng gen chúng (Nguyễn Văn Uyển,1995) 2.3 Đọc trình tự (sequencing) 2.3.1 Nguyên tắc kĩ thuật sequencing Kỹ thuật sequencing kỹ thuật xác định tất hợp phần nucleotide hình thành nên phân tử DNA chun tính Những kỹ thuật sequencing hoàn thiện năm gần Các cơng trình công bố Maxam va Gilbert (1977), Sanger cộng tác viên (1977) Do phương pháp sequencing có tên phương pháp Maxam Gilbert, Sanger Nhưng 20 năm qua, kỹ thuật cải tiến nhiều với trợ giúp máy vi tính, kỹ thuật huỳnh quang, tiến PCR, kỹ thuật điện di Vì vậy, kỹ thuật sequencing trở thành cơng cụ mạnh hiệu làm tảng phân tích genome (Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 1999) 2.3.2 Các phƣơng pháp sequencing 2.3.2.1 Phƣơng pháp Maxam Gilbert (phƣơng pháp hóa học) Phương pháp hóa học dựa sở phân cắt hóa học vị trí đặc biệt base tạo phân tử DNA có đầu đánh dấu, hình thành loạt phân tử đánh dấu tận base Trình tự DNA đọc từ kết ladder (thang chuẩn) gọi sequence ladder Phương pháp gọi phương pháp kết thúc theo chuỗi, xác định base điểm cuối chuỗi mã, làm cho base cịn lại Phương pháp thực gồm bước Bước 1: chuỗi DNA cần đọc trình tự đánh dấu phóng xạ đầu 5’-P P32 Một dây đơn oligonucleotide có đánh dấu phóng xạ chia thành phản ứng Trong phản ứng, oligonucleotide có đầu cố định đầu có phân tử A, T, G C Sản phảm phản ứng điện di gel polyacrylamide có độ phân giải cao Chụp gel ảnh DNA theo phương pháp phóng xạ tự ghi Các mạch đơn đánh dấu phóng xạ xử lí theo nhóm phản ứng sau: Nhóm thứ xử lí mạch đơn DNA dimethylsulphate pH=8 làm đứt mạch đơn G Nhóm thứ hai xử lí mạch đơn DNA acid có pH=2 gây đứt mạch đơn A G Nhóm phản ứng thứ ba xử lí mạch đơn DNA hydrazin gây đứt mạch đơn C T Nhóm phản ứng thứ tư xử lí mạch đơn DNA hidrazin với nồng độ muối NaCl 1,5M làm cho mạch đơn bị đứt C 10 Sản phẩm PCR làm tinh đọc trình tự với primer ITS1 ITS4 (White ctv, 1991) máy đọc trình tự DNA ABI 3100 hãng Applied Biosystem theo qui trình mơ tả mục 3.2.6 Kết cho thấy với dịng BV-62-03 SR-650, trình tự thu phần lớnchỉ xuất chữ N nên khơng thể xác định trình tự (hình 10,11) Với kết này, cho sản phẩm PCR tinh khơng thích hợp cho việc đọc trình tự Do qui trình tinh li tâm nên chưa loại bỏ hồn tồn chất loading dye trình điện di ethidium bromide q trình nhuộm Hai loại hóa chất ngăn cản tổng hợp chuỗi đơn DNA trình chạy chu kì Mặt khác, ethidium bromide phát sáng định nên làm nhiễu sóng q trình phân tích trình tự Như vậy, kit tinh Bio-rad mà sử dụng để tinh DNA khơng phù hợp cho trình đọc trình tự Vì vậy, thử sử dụng kit khác để làm tinh mẫu Chúng sử dụng kit “GFX PCR DNA and Gel Band Purication” công ty Amersham để tinh Qui trình tinh gồm bước sau: Cắt band DNA từ gel sau điện di, băm gel thành lát nhỏ Cho gel vào eppendorf Thêm 10μl capture buffer vào cho 10mg gel Ủ nhiệt độ 600C 15 phút gel tan hết Sau gel tan hết li tâm lạnh thu mẫu Chuyển mẫu thu vào cột GFX , ủ nhiệt độ phòng phút Li tâm 10000 vòng 30giây Bỏ nước eppendorf, đặt cột GFX vào eppendorf khác Thêm 500μl wash buffer li tâm 30 giây Chuyển cột GFX vào tip khác Thêm 50 μl elution buffer, nhỏ từ từ cột Ủ mẫu nhiệt độ phòng phút Li tâm 10000 vòng phút thu mẫu DNA tinh 27 Hình 10 Trình tự peak vùng rDNA-ITS dịng BV-62-03 28 Hình 11 Trình tự peak vùng rDNA-ITS dòng SR-650 29 Với sản phẩm PCR làm tinh theoqui trình trên, chng1 tơi tiến hành đọc trình tự trực tiếp vùng rDDNA-ITS dòng SR-650 BV-62-03 sử dụng primer ITS1 ITS4 4.4.1 Đọc trình tự vùng rDNA-ITS dòng BV-63-02 Với primer ITS1, vùng rDNA-ITS dòng BV-62-03 đọc 361bp Trình tự sau: gggaatttaa ttgaatttta ttaatagagg agtagaacgt tgtagctgcg ccatttttct ggcaatgtgc ataatctctc tttcatacac acacccctgt gcacctgtga gacatctaca aggtcatttt agagaaattt gggcaagtgt ggagcttcat tgcaaaactt ttccctcctt ctcttggctt ttgctgtcta ttccactcac atacaaactc tattaaatat aaaacgaatg taattgatgt aacgcatcta atactaagtt tcaacaacgg atctcttggc tctcgcatcg atgaaaacgc acgaactgca agagtaatga aaatgaaatt catgaatcat tttttcttta a Với primer ITS4, vùng rDNA-ITS dịng BV-62-03 đọc 312bp Trình tự sau: gtttcgccgg ggtagtccta cctgatttga gatcagatca taaggatgta ttttgtccaa gtcaaatcga ctattagaag cggttcgtct tgcatttacc ttggccacct ttttacagtg tcctcagcga tagataactt atcacgccga gtggaaccaa gcataacact tagagatcca gctaataaac atatacgcgc agggtgtgaa actgcaaagt actccaaaac caaagtaaga gaccagttga attaacatta ggtttacttt gagacacccc ctgaactcaa aaggtatgtt ccaggaaagg ag Do chuỗi DNA đọc ngắn nên không xác định trình tự vùng rDNA-ITS dịng BV-62-03 4.4.2 Đọc trình tự vùng rDNA-ITS dịng SR-650 Với primer ITS1, vùng rDNA-ITS dòng SR-650 đọc 602bp Trình tự sau: ggggaattat tgtatttatt accgaggagt agagttgtag ctggccattt ttctggcaat gtgcacattc ttctctttca tccacacacc cctgtgcacc tgtgagacag tcacaaggtc attttggagt ttgggcaagt gtggagcttc attgcaaaac ttttccctcc ttctcttggc ttttgctgtc tactcaatta acatacaaac tctattaaat ttaaaacgaa tgtaattgat gtaacgcatc taatactaag tttcaacaac ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcggaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcaccttg cgctccttgg tattccttgg agcatgcctg tttgagtatc ctgaaatctt caaagtaaac cttttgttaa ttcaatcggt ctcttacttt ggttttggag gtctttgcag tttcacaccc tgctcctctt tgtttattag ctggatctct aagtgttatg cttggttcca 30 ctcggcgtga taagttatct atcgctgaga cactgtaaaa aggtggccat tgtatatgca ag Với primer ITS4, vùng rDNA-ITS dòng SR-650 đọc 566bp Trình tự sau: gtttttcacg ggggagatcc tacctgattt gagatcagat cataaaaatg tattttgtc caagtcaagt cgactattag aagcggttcg tcttgcattt accttggcca cctttttac agtgtcctca gcgatagata acttatcacg ccgagtggaa ccaagcataa cacttagag atccagctaa taaacaaaga ggcgcagggt gtgaaactgc aaagacctcc aaaaccaaa gtaagagacc gattgaatta acaaaaggtt tactttgaag atttcatgat actcaaaca ggcatgctcc aaggaatacc aaggagcgca aggtgcgttc aaagattcga tgattcact Gaattctgca attcacatta cttatcgcat ttcgctgcgt tcttcatcga tgcgagagt caagagatcc gttgttgaaa cttagtatta gatgcgttac atcaattaca ttcgtttta aatttaatag agtttgtatg ttaattgagt agacagcaaa agccaagaaa ggaggattt atttttttta atgaaactcc cccttg Sau chúng tơi so trình tự chuỗi DNA đọc thu trình tự vùng rDNA-ITS 468bp Trình tự sau: caagtgtgga gcttcattgc aaaacttttc cctccttctc ttggcttttg ctgtctactc aattaacata caaactctat taaatttaaa acgaatgtaa ttgatgtaac gcatctaata ctaagtttca acaacggatc tcttggctct cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca ccttgcgctc cttggtattc cttggagcat gcctgtttga gtatcatgaa atcttcaaag taaacctttt gttaattcaa tcggtctctt actttggttt tggaggtctt tgcagtttca caccctgctc ctctttgttt attagctgga tctctaagtg ttatgcttgg ttccactcgg cgtgataagt tatctatcgc tgaggacact gtaaaaaggt ggccaaggta aatgcaag Trên website (http://www.ebi.ac.uk/) chúng tơi so sánh trình tự vùng rDNA-ITS dịng SR-650 với trình tự vùng rDNA-ITS dịng nấm R solani có mã số sau: AB122134 AG-IA 670 bp AB122126 AG1-ID 694 bp AB122124 AG2-1 669 bp AB122143 AG -4 672 bp AB122142 AG1-IC 651 bp Qua nhiều kết chúng tơi nhận thấy vùng rDNA-ITS dịng nấm mang số hiệu AB122126 thuộc nhóm tiếp hợp AG1-ID phù hợp với trình tự 31 vùng rDNA-ITS đọc dịng SR-650 Tỉ lệ tương đồng trình tự đoạn rDNAITS đọc 468bp dòng SR650 AB122126 100% Trình tự đoạn rDNA-ITS dịng nấm mang mã số AB1221126 là: aaggatcatt attgaattta ttaatgagga gtagagttgt agctggccat ttttctggca 61 atgtgcacac tcttctcttt catccacaca cccctgtgca cctgtgagac agttacaagg {caa gtgtggagct tcattgcaaa acttttccct ccttctcttg 121 tcattttgga gtttggg 181 gcttttgctg tctactcaat taacatacaa actctattaa atttaaaacg aatgtaattg 241 atgtaacgca tctaatacta agtttcaaca acggatctct tggctctcgc atcgatgaag 301 aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 361 gaacgcacct tgcgctcctt ggtattcctt ggagcatgcc tgtttgagta tcatgaaatc 421 ttcaaagtaa accttttgtt aattcaatcg gtctcttact ttggttttgg aggtctttgc 481 agtttcacac cctgctcctc tttgtttatt agctggatct ctaagtgtta tgcttggttc 541 cactcggcgt gataagttat ctatcgctga ggacactgta aaaaggtggc caaggtaaat 601 gcaag 661 tctcaaatca ggtaggacta cccgctgaac ttaa Trong dấu }acgaa ccgcttctaa tagtccattg acttggacaa aatacatttt tatgatctga {}là đoạn DNA tương đồng kết đọc dòng SR-650 với dòng nấm mang mã số AB122126 Đoạn tương đồng từ vị trí nucleotide 137 đến vị trí 605 dối với dịng nấm có mã số AB122126 Đoạn có 468 nucleotide CLUSTAL X (1.83) multiple sequence alignment SR650 AB122126 AAGGATCATTATTGAATTTATTAATGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA SR650 AB122126 ATGTGCACACTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAGG SR650 -CAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTG AB122126 TCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTG ******************************************* SR650 GCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTG AB122126 GCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTG 32 ************************************************************ SR650 ATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAG AB122126 ATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAG ************************************************************ SR650 AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT AB122126 AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT ************************************************************ SR650 GAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATC AB122126 GAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATC ************************************************************ SR650 TTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTGC AB122126 TTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTGC ************************************************************ SR650 AGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTTC AB122126 AGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTTC ************************************************************ SR650 CACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAAT AB122126 CACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAAT ************************************************************ SR650 GCAAG - AB122126 GCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCCATTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCTGA ***** SR650 AB122126 TCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAA Dấu * biểu thị trình tự dịng SR-650 với trình tự AB122126 khớp với Như vậy, kết đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR làm tinh kit “GFX PCR DNA and Gel Band Purication” công ty Amersham cho kết tốt so với sử dụng kit Quantum Prep Freeze “N Squeeze DNA gel Extraction Spin Column” BioRad Tuy nhiên, với kit làm tinh (của Amersham) qui trình đọc trình tự, vùng rDNA-ITS dòng BV-62-03 chi đọc đoạn ngắn điều cho thấy qui trình đọc trình tự với máy đọc trình tự DNA ABI 3100 hãng Applied Biosystem chưa hồn thiện nên kết khơng ổn định 33 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.Kết luận Cải thiện qui trình li trích DNA nấm R solani cách thêm khâu khử protein DNA tổng số thu sử dụng cho phản ứng PCR mà khơng cần xử lí RNase Chọn thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thành công vùng rDNA-ITS nấm R solani Bước đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS nấm R solani 5.2.Đề nghị Hoàn thiện qui trình đọc trình tự để có kết đọc trình tự tốt Đọc trình tự vùng rDNA-ITS nhiều dịng nấm để đánh giá đa dạng di truyền quần thể nấm 34 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng Nhà xuất Nơng Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Huệ, 2003 Khảo sát số đặc tính đánh giá đa dạng số mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ số kí chủ khác Luận văn tốt nghiệp kĩ sư Nông Học đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đình Hun, 1999 Những điều kĩ thuật di truyền Nhà xuất Nơng Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Việt Long, 2001 Hiệu phòng trừ bệnh đốm vằn lúa hai chủng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani ruộng lúa Đồng Tháp Luận văn thạc sĩ ngành Nông Học đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh Khuất Hữu Thanh, 2003 Cơ sở di truyền phân tử kĩ thuật gen Nhà xuất Khoa Học Kĩ Thuật, Hà Nội Nguyễn Văn Uyển, 1995 Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật Nhà xuất Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh Banniza S., Sy A A., Bridbe P D., Simons S A and Holderness M., 1999 Characterization of populations of Rhizoctonia solani in Paddy Rice Fields in Cote d’Ivoire Phytopathology 89: 414 – 420 35 Boysen M., Borjia M., Moral C., Salazar O., and Rubio V., 1996 Identification at strain level of Rhizoctonia solani AG4 isolates by direct sequence or asymmetric PCR products of the ITS region Curr Genet 29: 174 – 1811 Butler, E E., and Bracker, C E, 1970 Morphology and cytology of Rhizoctonia solani Pages 32 – 51 in J R Pameter, Jr.,ed Rhizotonia solani, Biology and Pathology University of California Press, Berkeley 255pp 10 Carling D E and Sumner D R., 1992 Rhizoctonia Pages 157 – 165 in: Method for reseach on soilborne phytopathogenic fungi L L Songton, J D Mihail and Rush (eds) APS, St Paul, Minnesota 11 Hsiang T., and Dean J D., 2001 DNA sequencing for anastomosis grouping of Rhizotonia solani isolates from Poa annua International turgrass society research journal 9: 674 – 678 12 Kuninaga S., Natsuaki T., Takeuchi T., and Yokosawa R., 1997 Sequence variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizotonia solani Curr Genet 32: 237 – 243 13 Lee S B., and Taylor J W., 1990 Isolation of DNA from fungal mycelia and single spore In: Weising K., Nybom H., Wolff K., and Meyer W., 1995, DNA fingerfrinting in plants and fungi CRC Rress, Coca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo, pages 70-71 14 Liu Z L., and Sinclair, J B, 1992 Genetic diversity of Rhizotonia solani anastomosis group Phytopathology 82: 778 – 787 15 Matsumoto M., Furuya N., Takanami Y and Matsuyama N., (1996) RFLP analysis of PCR – amplified 28S rDNA in Rhizoctonia solani Mycoscience 37: 351 – 326 16 O’brain P A., 1998 Molecular markers in Australian isolates of Rhizoctonia solani Mycol Res 98: 665 – 671 17 Papavizas, G C., 1957 Colonization and Growth of Rhizoctonia solani in Soil Crops Research Divesion Pages 108 – 122 36 18 Schneider J H M, Ssalazar O., Rubio V and Keijer J., 1997 Identification of Rhizoctonia solani associated with field-grown tulips using ITS r DNA polymorphism and pectic Zymograms European Journal of Plant Pathology 103: 607 – 622 19 Sneh B., Burpee L., Ogoshi A Identification of Rhizoctonia solani Species The American Phytopathological society Pages 67 – 75 20 Vilgalys, S and Gonzales, D., 1989 Ribosomal DNA restriction Fragment length polymorphisms in Rhizoctonia solani Phyopathology 80; 151 – 158 21 Weising K., Nybom H., Wolff K., and Meyer W, DNA Fingerprinting in Plants and Fungi Methology Pages 192 – 200 22 White, T J., Burns T., Lee S., and Taylor L., 1991 Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetic Pages 315 – 322 in M A Innis, D H Gelfand, J J Sninsky and T J White (ed.) PCR Protocol A guide to method and appliffiaction Academic Press, New York Internet 23 http://www.cals.ncsu.edu/course/pp728/Rhizoctonia/Ident01.JPG 24 http://www.uoguelph.ca/~thsiang/pubs/pdf/04daylilyrust.pdf 25 http://www.ipm.ucdavis.edu/PMG/r52100311.html#SYMPTOMS 26 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 27 http://www.ebi.ac.uk 37 PHẦN VII PHỤ LỤC Phụ lục.1 Đọc trình tự vùng rDNA-ITS dịng SR-650 với ITS4 38 Phụ lục.2 Đọc trình tựvùng rDNA-ITScủa dịng SR-650 với ITS1 39 Phụ lục.3 Đọc trình tự vùng rDNA-ITS dịng BV-62-03 với ITS1 40 Phụ lục.4 Đọc trình tự vùng rDNA-ITS dòng BV-62-03 với ITS4 41 ... thành công vùng rDNA-ITS nấm R solani Bước đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS nấm R solani 5.2.Đề nghị Hồn thiện qui trình đọc trình tự để có kết đọc trình tự tốt Đọc trình tự vùng rDNA-ITS. .. lục.1 Đọc trình tự vùng rDNA-ITS dịng SR-650 với ITS4 38 Phụ lục.2 Đọc trình t? ?vùng rDNA-ITScủa dịng SR-650 với ITS1 39 Phụ lục.3 Đọc trình tự vùng rDNA-ITS dòng BV-62-03 với ITS1 40 Phụ lục.4 Đọc. .. chuỗi DNA đọc ngắn nên chúng tơi khơng xác định trình tự vùng rDNA-ITS dịng BV-62-03 4.4.2 Đọc trình tự vùng rDNA-ITS dòng SR-650 Với primer ITS1, vùng rDNA-ITS dòng SR-650 đọc 602bp Trình tự sau: