XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI SÁN LÁ THƯỜNG GẶP Ở VIỆT NAM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ TÓM TẮT Sán lá ký sinh ở người thường gặp ở Việt Nam bao gồm sán lá gan nhỏ lưu hành ở ít nhất 24 tỉnh, sán lá gan lớn ít nhất ở 43 tỉnh, sán lá ruột lớn ít nhất 16 tỉnh, sán lá ruột bé ở ít nhất 15 tỉnh, sán lá phổi ở ít nhất 10 tỉnh. Mục tiêu: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định thành phần loài sán lá ký sinh ở người thường gặp ở Việt Nam. Phương pháp: sử dụng hệ gen ty thể (cob, cox, nad1) và/hoặc phần giao gen (ITS-2) và 18S ribosome của hệ gen nhân, so sánh với các chủng đã biết của Việt Nam và trên thế giới. Kết quả: Các mẫu sán lá, sán dây và ấu trùng của chúng được thu thập từ 22 tỉnh ở cả 3 miền trong cả nước đã được giải trình tự v# so sánh với các chuỗi chuẩn. Kết luận: loài sán lá phổi được xác định là Paragonimus heterotremus; loài sán lá gan lớn là Fasciola gigantica (có lai với F. hepatica); loài sán lá gan nhỏ ở miền Bắc là Clonorchis sinensis; loài sán lá gan nhỏ ở miền Nam là Opisthorchis viverrini; loài sán lá ruột lớn trên người là Fasciolopsis buski; loài sán lá ruột nhỏ trên người là Haplorchis taichui và H. pumilio. ABSTRACT Common parasitic trematodes such as small liver fluke was determined in more than 24 provinces; giant liver fluke in more than 43 provinces, giant intestinal fluke in more than 16 provinces, small intestinal flukes in more than 15 provinces, lung fluke in more than 10 provinces in Vietnam. Objectives: Used molecular method for identification of species of human Trematode. Methods: molecular method (PCR technique) using mitochondrial genetic markers as cob, cox1, nad1, nuclear markers as ITS-2 and ribosomal 18S rRNA. Results: Adult worms and larvae were collected from 22 provinces in Vietnam were taxonomically identified by the sequence obtained for the above species were compared with those of the known species from different geographical origins in the world. Conclusions: The Vietnamese isolates were identified as Paragonimus heterotremus; Fasciola gigantica (pure and hybrid with F. hepatica); Clonorchis sinensis in the North, Opisthorchis viverrini in the South; Fasciolopsis buski; Haplorchis pumilio; H. taichui. ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới, có trên 40 triệu người nhiễm sán lá truyền qua thức ăn phân bố ở nhiều nước, đặc biệt ở các nước nhiệt đới(11). Trong 10 năm gần đây và hiện nay, phương pháp sinh học phân tử dựa vào kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) sử dụng chỉ thị di truyền hệ gen nhân và hệ gen ty thể đang được ứng dụng rộng rãi và có độ tin cậy cao, đặc biệt được coi là rất có hiệu quả trong giám định và phân loại ký sinh trùng(11). Tại Việt Nam, bệnh sán lá phổ biến hầu khắp trong cả nước như sán lá gan nhỏ (Clonorchis và Opisthorchis) lưu hành ở ít nhất 24 tỉnh với tỷ lệ nhiễm, có nơi 37-40% (Nam Định, Hà Tây, Thanh Hoá, Phú Yên)(16); sán lá gan lớn (Fasciola) lưu hành ở ít nhất 43 tỉnh(14,16), có nơi tỷ lệ nhiễm 11,1% (Khánh Hoà)(10); sán lá phổi (Paragonimus) lưu hành ở ít nhất 9 tỉnh, có nơi tỷ lệ nhiễm 15% (Sơn La)(12,15). Từ trước đến nay, việc xác định thành phần loài giun sán ở Việt Nam thường dựa vào đặc điểm hình thái học. Vấn đề định loại bằng hình thái học đã đóng góp to lớn vào việc xác định thành phần loài ký sinh trùng, song vẫn còn những hạn chế nhất định và chính phân loại bằng sinh học phân tử sẽ khắc phục được những khiếm khuyết đo(5,6). Do vậy, việc nghiên cứu sinh học phân tử đối với các loài giun sán nói riêng và ký sinh trùng nói chung là hết sức cần thiết ở nước ta hiện nay. Mục tiêu nghiên cứu đề tài này là: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử (kỹ thuật PCR và phân tích chuỗi gen) để xác định thành phần loài của một số loài sán lá ký sinh ở người thường gặp ở Việt Nam. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thu thập mẫu Thu thập mẫu trên người Sán lá gan, sán lá ruột từ bệnh nhân bằng đãi phân khi điều trị; mẫu sán lá phổi từ đờm bệnh nhân khi điều trị. Các mẫu được thu thập từ các địa phương như sau: Sán lá gan nhỏ tại: Nam Định, Ninh Bình, Hà Tây, Thanh Hoá, Hà Nam, Hoà Bình, Quảng Ninh, Nghệ An, Thừa Thiên- Huế, Quảng Nam, Phú Yên, Bình Định và Đắc Lắc; sán lá phổi tại: Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Hoà Bình, Yên Bái; sán lá ruột lớn tại: Nam Định, Ninh Bình, Nghệ An, Thừa Thiên- Huế, Cần Thơ và An Giang; sán lá ruột nhỏ tại Yên Bái, Quảng Ninh, Nam Định, Ninh Bình, Thừa Thiên Huế, Lâm Đồng. Thu mẫu từ vật chủ trung gian ấu trùng sán lá gan từ cá tại Hà Nội, Nam Định; ấu trùng sán lá ruột nhỏ tại Nam Định, Ninh Bình; ấu trùng sán lá phổi thu thập từ cua tại Hoà Bình, Sơn La, Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái theo phương pháp tiêu cơ bằng pepsin acid. Bảo quản mẫu - Mẫu sán được rửa sạch bằng nước muối sinh lý. - Mẫu được cố định trong cồn 70% và bảo quản lạnh – 20°C, cho đến khi sử dụng. Các bước tiến hành kỹ thuật Tách chiết ADN từ mẫu nghiên cứu: ADN tổng số được tách chiết bằng bộ hoá chất Genomic-Tip Kit hoặc DNeasy hoặc QIAamp DNA kit (QIAGEN Inc.) theo qui trình của nhà sản xuất. Mô tả rút gọn như sau: mẫu vật bảo quản trong cồn 70% được lấy ra và cho cồn bay hơi hết trong ly tâm chân không, sau đó rửa nhiều lần trong PBS. Mẫu vật được nghiền kỹ và xử lý với các dung môi của Kit, rồi hấp phụ lên màng và ly chiết ADN theo qui trình tách chiết. Chọn mồi cho phản ứng PCR Gen cox1 (cytochrome oxidase 1) hoặc gen cob (cytochrome oxidase b) hoặc nad1 (nicotinamide dehydrogenase subunit 1) là gen ty thể, vùng giao gen ITS-2 (internal transcribed spacer 2) của hệ gen nhân hay gen 18S ribosome được chọn làm đích nghiên cứu. Quy trình phản ứng PCR ADN đích đã được nhân bản bằng PCR tiêu chuẩn với bộ hoá chất PCR Master Mix Kit (Promega). Chu trình nhiệt của PCR trên máy Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Inc., Mỹ) gồm các bước như sau: 940C/5 phút trong 1 chu kỳ; tiếp theo là 35 chu kỳ ở 940C/1 phút, 500C/1 phút và 720C/1 phút; chu kỳ cuối kéo dài 10 phút ở 720C. Sản phẩm PCR được tinh chế bằng bộ hoá chất QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.) và được dòng hoá vào vector có tên gọi là pCR2.1 hoặc pCR2.1TOPO của bộ hoá chất TA-cloning Kit (Invitrogen Inc.). Vector pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR được chuyển nạp vào dòng tế bào IVNaF’ và chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp kháng sinh và chỉ thị màu (Sambrook và Russell, 2001). ADN của plasmid có chứa sản phẩm PCR cần nghiên cứu được tách chiết với bộ hoá chất QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN Inc.)(5,7,8). Trình tự nucleotid của ADN trong plasmid chứa sản phẩm PCR tái tổ hợp được giải trình trên máy tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer của hãng Perkin-Elmer (Mỹ). Chuỗi nucleotid được xử lý bằng chương trình SeqEd1.3; sau đó so sánh sử dụng chương trình AsemblyLIGN1.9 và MacVector8.2 (Accelrys Inc.). Trong phân tích phả hệ, tất cả các chuỗi của các chủng chọn lọc trong đó có các chủng của Việt Nam được sắp xếp theo chương trình GENEDOC2.5, sau đó được đưa vào phân tích phả hệ bằng chương trình MEGA3.1 về thành phần nucleotid và acid amin, sử dụng hệ số tiến hoá thấp ME (minimum evolution index) (Kuma và cs, 2004). Phương pháp xử lý nucleotid/ chuỗi acid amin và ứng dụng tin-sinh học xử lý kết quả Giải trình nucleotid trực tiếp hoặc sau khi dòng hoá, từ ADN của plasmid tái tổ hợp, được thực hiện bằng máy giải trình tự động, xử lý bằng các phần mềm được cung cấp chuyên biệt. Giám định chuỗi ADN (gen chẩn đoánểttước hết bằng truy cập Ngân hàng gen (GenBank) bằng chương trình BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) (Altschul và cs, 1997). Sự đồng nhất giữa 2 hay nhiều chuỗi được thu nhận qua so sánh đa chuỗi (multiple alignment) bằng chương trình ClustalW bố trí sẵn trong hệ chương trình MacVector8.2 Tra cứu so sánh sử dụng các phần mềm có trong các Trung tâm tin-sinh học quốc tế (NCBI = National Centre for Biotechnology Information/USA (http://ww.ncbi.nlm.nih.gov) hay sử dụng một số chương trình đặc biệt có ở ExPASy (http://expasy.ch). Sự sai khác về nucleotid và acid amin dưới 5% thông thường được đánh giá là biến đổi nội loài (intraspecific variation) và 5% trở lên là biến đổi ngoại loài (Interspecific variation) (Blair và Agatsuma, 1993). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết quả xác định loài sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis Bảng 1: So sánh nucleotid tại 10 điểm có sự sai khác trong chuỗi gen cox1 của Clonorchis spp Việt Nam với C. sinensis chủng Trung Quốc (CsCN) Ký hiệu Chủng gốc Các vị trí trong chuỗi gen cox1 trong giải trình tự Nước Địa phương 9 10 22 69 219 318 436 439 440 441 Cs(CN) T. Quốc Quảng Tây C C T C [...]... H.Quốc Nam Hàn C C T C T C G C T T CsNgNB Việtnam Ninh Bình C C T T T C G C T A CsNgTH Vietnam Thanh Hoá C C T T T C G C T A CsNgNB2 Việtnam Ninh Bình C C T T T C G C T A CsNgTH2 Vietnam Thanh Hoá C C T T T C G C T A CsNgND Vietnam Nam Định C C T T T C G C T A CsNgBG Vietnam Bắc Giang C C T T T C G C T A CsNgHB Vietnam Hoà Bình C C T T T C G C T A CsNgHT Vietnam Hà Tây C C T T T C G C T A CsNgHNa Việtnam... Việtnam Hà Nam C C T T T C G C T A CsNgQN Vietnam Quảng Ninh C C T T T C G C T A CsNgNA Vietnam Nghệ An C C T T A C G C G A CsNgDN Vietnam Đồng Nai C C T T T T G C T A CsMeND Vietnam Nam Định T C G T T C G T T A CsMeHNo Vietnam Hà Nội C T G T T C T C T A Ghi chú: CsNgNB= mẫu Clonorchis ở Ninh Bình; CsNgND= mẫu Clonorchis ở Nam Định; CsNgTH= mẫu Clonorchis ở Thanh Hoá; CsNgBG= mẫu Clonorchis ở Bắc Giang;... CsNgNB= mẫu Clonorchis ở Ninh Bình; CsNgND= mẫu Clonorchis ở Nam Định; CsNgTH= mẫu Clonorchis ở Thanh Hoá; CsNgBG= mẫu Clonorchis ở Bắc Giang; CsNgHB= mẫu Clonorchis ở Hoà Bình; CsNgHT= mẫu Clonorchis ở Hà Tây; CsNgHNa= mẫu Clonorchis ở Hà Nam; CsNgQN= mẫu . XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI SÁN LÁ THƯỜNG GẶP Ở VIỆT NAM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ TÓM TẮT Sán lá ký sinh ở người thường gặp ở Việt Nam bao gồm sán lá gan nhỏ lưu hành ở ít nhất 24 tỉnh, sán lá. nhất ở 43 tỉnh, sán lá ruột lớn ít nhất 16 tỉnh, sán lá ruột bé ở ít nhất 15 tỉnh, sán lá phổi ở ít nhất 10 tỉnh. Mục tiêu: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định thành phần loài sán lá. nay, việc xác định thành phần loài giun sán ở Việt Nam thường dựa vào đặc điểm hình thái học. Vấn đề định loại bằng hình thái học đã đóng góp to lớn vào việc xác định thành phần loài ký sinh trùng,