XÉT NGHIỆM ELISA PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN NS1 TÓM TẮT Đặt vấn đề: Sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue là một trong những bệnh truyền nhiễm quan trọng nhất tại Việt Nam. Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 của virút Dengue trong huyết thanh bệnh nhân giúp phát hiện nhiễm virút Dengue trong giai đoạn sớm. Mục tiêu: Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên đoán âm của xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag. Phương pháp: Tiền cứu, mô tả cắt ngang. Kết quả: Độ nhạy của xét nghiệm ELISA bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag là 94,90%, độ đặc hiệu là 100%, giá trị tiên đoán dương là 100% và giá trị tiên đoán âm là 94,44%. Kết luận: Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 của virút Dengue có thể ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán sớm sốt Dengue/SXH Dengue. ABSTRACT ELISA TO DETECT NS1 ANTIGEN FOR THE DIAGNOSIS OF DENGUE FEVER AND DENGUE HAEMORRHAGIC FEVER Phan Văn Bé Bảy, Hoàng Tiến Mỹ * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 13 - Supplement of No 1 - 2009: 249 - 255 Background: Dengue fever/Dengue haemorrhagic fever is one of the most important emerging infectious diseases in Vietnam. Recently, detecting NS1 Dengue antigen in patients’ sera has been described as an alternative method for early diagnosis. Objectives: Evaluating the sensitivity, the specificity, the positive predictive value and the negative predictive value of the Platelia™ Dengue NS1 Ag. Method: Prospective, description, cross-sectional study Results: The sensitivity, the specificity, the positive predictive value and the negative predictive value are 94.9%, 100%, 100%, 94.44%, respectively. Conclusion: Detecting NS1 Dengue antigen can be used in early Dengue fever and Dengue haemorrhagic fever diagnosis. ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt Dengue (SD)/sốt xuất huyết (SXH) Dengue là bệnh nhiễm virút cấp tính gây ra bởi 4 týp virút Dengue: DEN-1, DEN-2, DEN-3 và DEN-4. Bệnh được truyền từ người sang người qua trung gian muỗi Aedes aegypti. Bệnh đang lưu hành trên 100 quốc gia thuộc các khu vực có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới ở vùng Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương. Có khoảng 2,5-3,0 tỉ người sống trong vùng có nguy cơ bị nhiễm bệnh, ước tính số trường hợp mắc hàng năm khoảng 50-100 triệu người, trong đó hơn 90% trường hợp là trẻ em dưới 15 tuổi (3,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.) . Sốt Dengue/SXH Dengue vẫn còn là thách thức cho các nhà dịch tể học lẫn thầy thuốc lâm sàng và vẫn chưa có vắcxin phòng bệnh (Error! Reference source not found.) . Tại Việt Nam, sốt Dengue/ SXH Dengue là một trong những bệnh truyền nhiễm có tỉ lệ mắc và chết cao nhất ở trẻ em và bệnh đã và đang trở thành vấn đề y tế nghiêm trọng. Trong năm 2007, trong 20 tỉnh thành khu vực phía Nam ghi nhận có 87.950 trường hợp mắc và có 81 trường hợp chết. Đồng Tháp là một trong những tỉnh có số mắc và chết cao nhất trong khu vực này với số mắc là 13.012 và có 9 trường hợp tử vong (Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.) . NS1 của virus Dengue là 1 glycoprotein, trọng lượng phân tử 46-50 kD, thể hiện dưới 2 dạng: dạng kết hợp màng (mNS1) và dạng tiết (sNS1) quyết định tính đặc hiệu nhóm và loài. Chức năng của NS1 đến nay chưa được xác định đầy đủ nhưng người ta nhận thấy nó tham gia vào quá trình sao chép RNA của virút, cần thiết cho sự tồn tại của virút (Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.) . Lượng NS1 dạng tiết (sNS1) có nồng độ cao trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm virút Dengue trong giai đoạn sớm khi có biểu hiện lâm sàng và có liên quan với mức độ virút trong máu (Error! Reference source not found.) . Nhiễm virút Dengue hiện nay được phát hiện bằng nhiều xét nghiệm như: phân lập virút, phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược (RT-PCR), ELISA phát hiện kháng nguyên, phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI), phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn men (MAC-ELISA, GAC-ELISA), thử nghiệm miễn dịch nhanh (sắc ký miễn dịch). Tuy nhiên một số xét nghiệm đòi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền, một số thì không phát hiện sớm được bệnh do đáp ứng kháng thể chậm, khi bệnh nhân đã qua giai đoạn cấp (Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.) . Vì vậy, việc phát hiện sớm và chính xác là một nhu cầu cần thiết cho cả thầy thuốc lẫn bệnh nhân. Gần đây hãng Bio-Rad cung cấp bộ kit phát hiện kháng nguyên NS1 của virút bằng kỹ thuật ELISA. Đây là một hứa hẹn khả quan tại Việt Nam bởi vì xét nghiệm này có thể phát hiện bệnh sớm trong giai đoạn bệnh nhân còn sốt hơn nữa không đòi hỏi phương tiện đắt tiền (Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.) . Tuy nhiên, hiện nay giá trị của xét nghiệm này trên người Việt Nam còn chưa được ghi nhận đầy đủ. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 trong chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue” nhằm đạt được những mục tiêu: xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên đoán âm của xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag. ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Tiền cứu, mô tả cắt ngang. Đối tượng nghiên cứu Nhóm nghiên cứu: 196 mẫu máu được xác định nhiễm virút Dengue bằng xét nghiệm MAC-ELISA Dengue (mẫu máu lần 1, khi bệnh nhân mới vào viện, là âm tính và mẫu máu lần 2, từ ngày sốt thứ 6 trở đi là dương tính). Nhóm chứng âm: 170 mẫu máu từ người khỏe mạnh hiến máu tình nguyện, có xét nghiệm MAC-ELISA Dengue âm tính. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ 29/09/06 đến 29/08/07 tại Khoa Nhiễm và Khoa Vi sinh-Bệnh viện Đồng Tháp. Phương pháp nghiên cứu - Kỹ thuật xét nghiệm: xét nghiệm MAC-ELISA Dengue (bộ kít do Labô Arbovirus - Khoa Vi sinh Miễn Dịch - Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh sản xuất), xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 (bộ kít Platelia ™ Dengue NS1 Ag do hãng Bio-Rad Laboratories, Marnes La Coquette, Pháp sản xuất). Xác định týp virút Dengue bằng kỹ thuật TaqMan Real time RT-PCR thực hiện tại Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng thuộc Đại học Offord - Anh quốc tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Thành phố Hồ Chí Minh với các mẫu máu lấy lần thứ nhất khi bệnh nhân nhập viện. - Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên NS1: áp dụng nguyên tắc miễn dịch men kiểu sandwich một bước trên plaque. Bệnh phẩm và chứng được ủ trực tiếp, cùng lúc với cộng hợp trong các giếng đã gắn với kháng thể đơn dòng từ chuột (MAb) ở nhiệt độ 37ºC trong 90 phút. Nếu mẫu có kháng nguyên sẽ tạo thành phức hợp MAb-NS1-MAb/peroxidase. Sau khi rửa, phức hợp miễn dịch được biểu hiện khi thêm vào giếng dung dịch sinh màu để khởi đầu cho phản ứng tạo màu. Sau khi ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, ngừng phản ứng bằng dung dịch acid. Đọc kết quả bằng quang phổ kế với bước sóng 450/620 nm. Sự hiện diện kháng nguyên NS1 trong mẫu được xác định bằng cách so sánh độ hấp thu của mẫu thử (OD) với độ hấp thu của ngưỡng phát hiện (CO). - Thu thập dữ liệu từ bệnh nhân và kết quả xét nghiệm. - Xử lý số liệu bằng phần mềm Stata 8.0. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Một số đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu Trong 196 mẫu nghiên cứu, có 102 nam (52,04%) và 94 nữ (47,96%). Độ tuổi trung bình là 11,18 ± 6,36 (2-35). Số trẻ em <15 tuổi là 155 (79,08%) và số trẻ lớn và người lớn ≥15 tuổi là 41 (20,92%). Ngày sốt trung bình khi nhập viện là 2,79 ± 0,55 (2-5). Số ca có sốc là 21, số ca không sốc là 175. Phân độ lâm sàng: có 39 ca sốt Dengue (19,90%), 91 ca SXH độ I (46,43%), 45 ca SXH độ II (22,96%), 21 ca SXH độ III (10,71%) và không có ca SXH độ IV. Thực hiện xét nghiệm RT-PCR tỉ lệ dương tính là 189/196, trong đó có 158 DEN-1 (83,60%), 25 DEN-2 (13,23%), 6 DEN-3 (3,17%) và không có DEN-4. Độ nhạy của kít Platelia ™ Dengue NS1 Ag Độ nhạy chung: 94,9% (186/196). Bảng 1: Kết quả xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 của virút Dengue bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag Platelia ™ Dengue NS1 Ag Số ca/số thử (%) Dương tính 186/196 (94,9) Nghi ng ờ 2/196 (1,02) Âm tính 8/196 (4,08) Bảng 2: Kết quả xét nghiệm bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag theo giới Platelia ™ Dengue NS1 Ag Giới S ố ca (+)/ca thử Tỉ lệ d ương tính (%) Nam 99/102 97,06 N ữ 87/94 92,55 Tổng cộng 186/196 94,90 Bảng 3: Tỉ lệ dương tính của xét nghiệm bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag chia theo nhóm tuổi. Platelia ™ Dengue NS1 Ag Nhóm tuổi S ố ca (+)/ca thử Tỉ lệ d ương tính (%) <15 tuổi 149/155 96,13 ≥15 tuổi 37/41 90,24 Tổng cộng 186/196 94,90 Bảng 4: Tỉ lệ dương tính của xét nghiệm bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag chia theo phân độ lâm sàng. Platelia ™ Dengue NS1 Ag Phân đ ộ lâm sàng S ố ca (+)/ca thử Tỉ lệ d ương tính (%) Sốt Dengue 37/39 95,87 SXH độ I 87/91 95,60 SXH độ II 42/45 93,33 SXH độ III 20/21 95,24 Bảng 5: Tỉ lệ dương tính của xét nghiệm bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag chia theo bệnh cảnh lâm sàng. Platelia ™ Dengue NS1 Ag Bệnh cảnh S ố ca (+)/ca thử Tỉ lệdư ơng tính (%) Không sốc 166/175 94,86 Có sốc 20/21 95,24 Bảng 6: Tỉ lệ dương tính của xét nghiệm bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag chia theo ngày sốt khi nhập viện. Ngày sốt Platelia ™ Dengue NS1 Ag S ố ca (+)/ca thử Tỉ lệd ương tính (%) Ngày th ứ 2 52/53 98,11 Ngày th ứ 3 125/133 93,98 Ngày th ứ 4 7/8 87,5 Ngày th ứ 5 2/2 100,00 Bảng 7: Kết quả xét nghiệm Platelia™ Dengue NS1 Ag theo từng týp huyết thanh virút Dengue Platelia ™ Dengue NS1 Ag Týp virút S ố ca (+)/số chủng Tỉ lệd ương tính (%) DEN-1 153/157 97,45 DEN-2 22/25 88.00 DEN-3 5/5 100,00 Tổng cộng 180/187* * Đã loại bỏ 2 ca có kết quả ELISA NS1 Ag là nghi ngờ [...]... có 21/196 ca có sốc trong đó hầu hết ở trẻ dưới 15 tuổi (18/21) Hiệu quả của xét nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag Độ nhạy Trong nghiên cứu của chúng tôi, độ nhạy của xét nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít này khá cao: 94,9% (186/196) Không có khác biệt về tỉ lệ dương tính của xét nghiệm này với các đặc điểm như giới (p = 0,294), tuổi (p = 0,291), phân độ lâm... Dussart(Error! thì có thể phát hiện được kháng nguyên NS1 đến ngày thứ 9 khi có biểu hiện bệnh Trong nghiên cứu của chúng tôi, các mẫu máu thử ELISA NS1 được lấy ngay khi bệnh nhân vào viện với ngày có triệu chứng sốt dưới 5 ngày do đó độ nhạy của xét nghiệm cao Bệnh nhân vào viện thì không phải lúc nào cũng sớm nên việc nghiên cứu để xác định khả năng phát hiện kháng nguyên NS1 trong bao lâu và nhiều... DEN-1, DEN-2 và DEN-3 Độ đặc hiệu của kít xét nghiệm: 100% Giá trị tiên đoán dương của kít xét nghiệm: 100% Giá trị tiên đoán âm của kít xét nghiệm: 94,44% Qua các kết luận nêu trên, xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 của virút Dengue có thể ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán sớm sốt Dengue/SXH Dengue KIẾN NGHỊ - Sử dụng thường qui kít Platelia™ Dengue NS1 Ag (BIO-RAD - Pháp) để xác định chẩn... của nhóm chứng âm, thực hiện xét nghiệm bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag kết quả tất cả đều âm tính với xét nghiệm này Bảng 8: Tổng hợp kết quả ELISA NS1 Ag của 2 nhóm mẫu bệnh nhân nghiên cứu và nhóm chứng âm MAC- MACTổng ELISA ELISA (cộng (+) ) NS1 Ag (+) 186 0 186 NS1 Ag (-) 10 170 180 Tồng cộng 196 170 366 Như vậy theo bảng 8 ta tính được độ đặc hiệu của kít Platelia™ Dengue NS1 Ag là: 170/170 = 100%... tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm Do kít xét nghiệm này có giá trị tiên đoán dương là 100% và giá trị tiên đoán âm cao (94,44%) nên nó rất hữu ích trong việc xác định hay loại trừ bệnh nhân bị nhiễm virút Dengue Các ưu điểm của kít Platelia™ Dengue NS1 Ag Kít Platelia™ Dengue NS1 Ag áp dụng nguyên tắc miễn dịch men một bước trên plaque Xét nghiệm này thực hiện đơn giản, nhanh và dễ đọc kết quả do... không thể phân tích được thử nghiệm này có thể sử dụng để dự báo sớm cho bệnh SXH Dengue nặng hay không, do hiện tại kít Platelia™ Dengue NS1 Ag không phải là xét nghiệm định lượng Chi phí xét nghiệm cũng là vấn đề cần quan tâm Giá trung bình mỗi giếng là 70.000 đồng nên giá thành cho mỗi mẫu xét nghiệm sẽ cao hơn nếu làm từng mẫu riêng rẽ so với làm cùng lúc nhiều mẫu (mỗi đợt chạy phải có 1 giếng chứng... nghiên cứu này nhiễm týp DEN-4 do đó chưa thể so sánh một cách đầy đủ hiệu quả của xét nghiệm trên các mẫu máu nhiễm các týp virus Dengue khác nhau KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 196 trường hợp xác định nhiễm virút Dengue bằng xét nghiệm MAC -ELISA và 170 mẫu máu chứng âm, chúng tôi rút ra những kết luận sau: Độ nhạy của kít xét nghiệm: 94,9% Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ dương tính với những... lấy mẫu trung bình của chúng tôi là sớm hơn (2,79; range 2-5; SD 0,55) p = 0,000(Error! Reference source not found.) Trong nghiên cứu năm 2007 ở Malaysia, Sekaran S.D và cộng sự, tuy xét nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 Dengue bằng kít của hãng khác (Panbio-Australia) nhưng độ nhạy là 60/66 (91%) cũng tương đương với trong nghiên cứu của chúng tôi (p = 0,2516)(Error! Reference source not found.) Trong... của chúng tôi thì tỉ lệ dương tính là tương đương 37/41 (90,24%), p = 0,7716 Độ nhạy của xét nghiệm trong nghiên cứu của chúng tôi tương đương với xét nghiệm của Kamarasamy V và cộng sự (93,3%, n = 224, p = 0,4893) vào năm 2007 khi sử dụng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag (Bio-Rad Corporate HQ, Hercules, USA) thực hiện trên 224 huyết thanh từ bệnh nhân xác định nhiễm Dengue cấp, trong đó ngày lấy mẫu trung... hoặc loại trừ bằng xét nghiệm là cần thiết Xét nghiệm này tỏ ra rất hữu ích trong các trường hợp như vậy vì độ nhạy và độ đặc hiệu cao Hơn nữa, với sự mở rộng phạm vi địa lý nhiễm virút Dengue, sự gia tăng số ca và mức độ trầm trọng được ghi nhận, sử dụng phương pháp này giúp xác định sớm những trường hợp nhiễm virút Dengue góp phần vào việc quản lý bệnh Một số giới hạn Kít xét nghiệm này không xác . Hiệu quả của xét nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag. Độ nhạy Trong nghiên cứu của chúng tôi, độ nhạy của xét nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít này. kít xét nghiệm: 100%. Giá trị tiên đoán dương của kít xét nghiệm: 100%. Giá trị tiên đoán âm của kít xét nghiệm: 94,44%. Qua các kết luận nêu trên, xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1. của xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag. Phương pháp: Tiền cứu, mô tả cắt ngang. Kết quả: Độ nhạy của xét nghiệm ELISA bằng kít Platelia™ Dengue NS1