52 thông dụng . Trong (standard PCR), DNA Taq pol 4 loại deoxyribonucleotide (Hình 3.4). Hình 3.4. Sơ đồ kỹ thuật PCR chuẩn (anchored PCR), kỹ thuật này yêu cầu chỉ cần biết trình tự nucleotide ở một đầu của khuôn mẫu và gắn một đuôi đồng trùng hợp nhân tạo (ví dụ: dA) kia (chưa biết trình tự). Sau đó đoạn oligo(dT) (Hình 3.5). (inverse PCR), đ các với đoạn hạn chế nhờ enzyme DNA ligase đoạn hai p đã 3.6). II. Quy trình PCR - Phân tử DNA có chứa đoạn DNA cần khuếch đại - 2 primer (F và R) P A DNA khuôn mẫu Biến tính Taq polymerase P B (P A ) và (P B ) là các primer đặc hiệu 53 - Taq pol - 4 loại dNTP - Đệm và các muối khoáng Hình 3.5. Sơ đồ kỹ thuật PCR mỏ neo 2. Thực hiện phản ứng a : eppendorf tube (E-tube) loại 0,5 mL, trộn đều các thành phần sau: Đệm 10 PCR 4,5 L Hỗn h ) 4 L Primer-F (10 pmol/ L) 2,5 L Primer-R (10 pmol/ L) 2,5 L Thêm H 2 40 L 5’ 5’ 3’ 3’ N 1 X N 2 N 1 X N 2 N 2 X N 1 P x P A DNA khuôn mẫu X: trình tự đã biết; N 1 và N 2 : trình tự chưa biết Khuếch đại PCR bằng primer đặc hiệu của trình tự đã biết (P X ) và primer đặc hiệu của chuỗi neo (P A ) A A 54 Taq pol: 10 2 L Taq pol (5 units/ L) 1 L Thêm H 2 20 L 3.6. Sơ đồ ược 2.3. Bổ sung 5 L DNA khuôn mẫu (100 ng) vào 40 L dung dịch của master mix tube. 2 Taq pol. 2.5. Đặt E-tube đựng dung dịch phản ứng vào heating block của máy PCR để thực hiện chế độ nhiệt theo chu kỳ như sau: DNA đã biết X Y 5’ 5’ 3’ 3’ X Y PCR Tạo vòng bằng DNA ligase Enzyme hạn chế Enzyme hạn chế 55 - Start program - 95 o C/5 phút - : 95 o C/30 giây, 50 o 72 o C/1 phút - 72 o C/10 phút - 4 o C - Chạy điện di để h 3.7) - -20 o C - đ ư bằng thực tham khảo. - và Taq pol, sau đó chia ra từng tube rồi cho DNA và Taq pol . - Thao tác trong tủ cấy vô trùng (hoặc không). Hình 3.7. Điện di các sản phẩm PCR. SM: Chuẩn kích thước DNA. 1, 2, 3, 4 5: Các khác nhau. SM 1 2 3 4 5 SM 56 1 - 2 dài hơn (20-24 mer) , genomic DNA không h t . 50% GC 3’ - nhiệt độ nóng chảy (T m ) 4 o C cho GC 2 o C cho AT 5 o (T a ) 4-6 o T m T a . 20 oligonucleotide: T a = 4 (G + C) + 2 (A + T) – 5 o C (1) . 1 RAPD (random amplified polymorphic DNA): . 2 STS (sequence-tagged site): STS primer được thiết kế trên cơ sở các trình tự của RAPD markers. 57 3. Magnesium 2+ 2 pol 2+ - 2+ hiệu 2+ (Mg 2+ - pol 2+ . ribonucleotide triphosphate (dNTPs) 10 -20 o 20-200 . 5. Enzyme Taq pol pol 1-2,5 unit cho 100 . 0,5 unit/25 pol pol . pol pol - 0,1% (v/v) Triston X-100. 58 0,1 20-mer) trong 25 - . : gia DNA - . Thông thường, nồng độ DNA khuôn mẫu được sử dụng trong khoảng từ 10-100 ng/25 L dung dịch phản ứng. - 0,5 M (12,5 pmol/25 -dimers. 10. Khởi động nóng PCR (“host-start” PCR) . DNA k 59 pol đ , . họa cho khởi động nóng PCR. E-tube loại 0,5 mL và trộn đều các thành phần sau: Đệm 10 PCR 4,5 L ) 4 L Primer-F (10 pmol/ L) 2,5 L Primer-R (10 pmol/ L) 2,5 L Thêm H 2 40 L pol: 10 2 L Taq pol (5 units/ L) 1 L Thêm H 2 20 L 10.3. Bổ sung 5 L DNA khuôn mẫu (100 ng) vào 40 L dung dịch của master mix tube. 10.4. Đặt E-tube đựng dung dịch phản ứng vào heat block của máy PCR để thực hiện chế độ nhiệt theo chu kỳ như sau: - Start program - “Hot start”: Khoảng 80 o C/10 giây «pause» - sung 2 L aq pol. - Restart - 94 o C/5 phút 60 - : 94 o C/30 giây, 54 o 72 o C/1 phút. - 72 o C/10 phút - 4 o C - Chạy đi - -20 o C T m (non-specific). - (priming) sự . - T m ). Primer có chiều của primer càng nhỏ. Trong khi khuếch đại, một sự cố nào đó của quá trình ủ cũng sẽ làm giảm kết quả PCR. Để tối ưu hóa PCR, người ta sử dụng primer có chiều dài tối thiểu sao cho đảm bảo T m khoảng 54 o C hoặc hơn chút ít, điều này sẽ cung cấp những cơ hội tốt nhất đ đặc trưng của sản phẩm PCR và hiệu suất phản 61 ứng cao. Những oligonucleotide ngắn (15 base hoặc ngắn hơn) đư . Chiều dài primer tối thiểu cho hầu hết các ười ta thư đ - , tạo thành sợi đôi ổn định trong tổng hợp DNA. Thông thư 28-35 mer cần cho việc khuếch đại các trình tự có mức độ dị hợp cao. Đối với những primer ngắn hơn 20 mer, có thể sử dụng công thức tính T m liên hệ với các base: T m = 4 (G + C) + 2 (A + T). Trong khi primer dài hơ đúng. 2. Vị trí đầu 3’ của primer nên được xác định cẩn thận, vì nó có tính chất quyết định cho sự thành công của PCR. Khi chúng ta xác định được một amino acid, hai base đầu tiên trong codon của nó hoặc ba base trong trường hợp nó được mã hóa bằng codon đơn (methionin và tryptophan) thì hai hoặc ba base đầu tiên này được dùng như đầu 3’. Những cặp base hoàn chỉnh giữa những đầu 3’ của primer và khuôn mẫu cho phép chúng ta có được kết quả mong muốn, và giảm thiểu tối đa hiện tượng bắt cặp sai (mismatch) trong khoảng 5-6 nucleotide tại đầu 3’ của primer. Thông thư đầu 5’ của primer vẫn không làm thay đổi quá trình gắn mồi. Nhiệm vụ của đầu 3’ trong primer là kiểm soát hiện tượng g ă ượng tương đồng trong cùng một cặp primer. Nếu không thận trọng trong việc xác định đ ư - một sự khuếch đại mà ta mong muốn. Trong trường hợp có nhiều cặp primer đưa vào trong cùng một phản ứng (multiplex PCR), chúng ta cần phải kiểm tra gấp đôi hiện tượng bổ sung cho nhau của tất cả primer. T m Primer của PCR phải duy trì được hàm lượng GC đến mức có thể được. Những oligonucleotide có 20 base với 50% GC thường có giá trị T m [...]... mẫu để tổng hợp sợi DNA thứ hai (tương tự như giai đoạn thứ nhất và thứ hai của quá trình tổng hợp cDNA-xem chương 6) Giai đoạn thứ hai Dùng DNA sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR như đã trình bày ở trên RNA được cấu tạo nhờ bốn loại nucleotide (adenine, guanine, cytosine và uracil) liên kết với nhau tạo thành một chuỗi đơn Khi chuỗi nucleotide này được biến đổi thành DNA thì uracil (U)... thành sợi DNA thứ nhất phải nhờ đến một enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) do vậy giai đoạn này được gọi là phiên mã ngược (RT), sau đó quá trình tổng hợp sợi DNA thứ hai lại nhờ một enzyme khác là DNA polymerase I (thường dùng đoạn Klenow) Khi đã có DNA sợi đôi từ khuôn mẫu RNA thì phản ứng tiếp theo sẽ là khuếch đại gen nhờ kỹ thuật PCR được thực hiện với ba mức nhiệt độ phù hợp ở mỗi... khuếch đại một đoạn DNA từ khuôn mẫu RNA trải qua hai giai đoạn nói trên được gọi là RT-PCR Do trong tự nhiên một số virus có hệ gen là RNA (retrovirus) nên muốn khuếch đại một đoạn gen của nó thì người ta phải dùng kỹ thuật RTPCR Một số nghiên cứu khác về mRNA cũng cần đến RT-PCR để biến đổi sợi RNA thành DNA cho quá trình tạo dòng để phân tích trình tự gen (gene sequencing) hay tái tổ hợp (recombination)... 67 hợp chuẩn Kỹ thuật này ặc hiệu A khuôn mẫu (dT) ược 2.2 ư ư tương ứng , tiếp theo hai Cắt DNA bằng RE Tạo vòng Chú thích Vùng kế cận trên (upstream) Vùng kế cận dưới (downstream) PCR Vị trí cắt của các RE Vùng đã biết trình tự 3.11 đã biết ược Hai primer đặc hiệu được gắn vào trình tự khuếch đại 68 5’ 3’ i cDNA (5’ 3’ 3.11) (restricti (simple sequence repeats, SSR), và đa hình chiều dài đoạn DNA. .. polymorphism, AF , tiết kiệm thời gian và có 4 Ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng Trước đây, kỹ thuật phân tích RFLP thường được sử dụng để xác định các đột biến dẫn tới các bệnh di truyền ở người Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng được trong trường hợp đột biến đó dẫn đến sự thay đổi trình tự có thể phát hiện được trên cơ sở độ dài của đoạn DNA Ngược lại, trường hợp 69 ... kiểu gen của mẫu vật (đồng hợp tử: chỉ có allele 1 hoặc chỉ có allele 2, dị hợp tử: có cả hai allele 1 và 2) và phân biệt sự đa hình nucleotide đơn (single nucleotide polymorhism, SNP) VII nhiều giới thiệu : + + + + λgt11 + Multiplex PCR + + + + 65 ( - này ên nhau (overlapping), do đó ra đoạn (Hình 3.10 Thông thư 16-30 nucleotide : - 66 - Primer C Primer A Genomic DNA Trình tự gen Primer B Primer... quá trình ủ đ Hàm lượng GC và Tm phải khớp với một cặp primer được thiết kế Nếu giá trị Tm ơ hội cho hiện tượng gắn primer nhầm càng cao Do đ ư đến hàm lượng GC V Kỹ thuật RT-PCR Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA theo nguyên lý của PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất Phiên mã ngược khuôn mẫu RNA thành sợi DNA thứ nhất, sau đó dùng sợi này làm khuôn mẫu để tổng hợp. .. chạy điện di DNA trên agarose gel sau khi phản ứng kết thúc Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi (SYBR... lớn Các kết quả của real-time PCR có thể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (số bản copy của DNA) Real-time PCR định lượng còn được biết như là qPCR Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà không cần điện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa vào quá trình được tăng lên Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá... thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ 2 Phân tích tổng quát một phản ứng real-time PCR Để hiểu được real-time PCR như thế nào, chúng ta bắt đầu bằng một đường cong khuếch đại mẫu (Hình 3.9) Trong hình này, số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x, và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩm được khuếch đại trong tube, được trình bày ở trục y Đường cong khuếch đại có 2 pha, . DNA thứ nhất, sau đó dùng sợi này làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi DNA thứ hai (tương tự như giai đoạn thứ nhất và thứ hai của quá trình tổng hợp cDNA-xem chương 6). Giai đoạn thứ hai. Dùng DNA. Chuẩn kích thước DNA. 1, 2, 3, 4 5: Các khác nhau. SM 1 2 3 4 5 SM 56 1 - 2 dài hơn (20- 24 mer) , genomic DNA không h t . 50% GC 3’ - nhiệt độ nóng chảy (T m ) 4 o C cho GC 2 o C. về mRNA cũng cần đến RT-PCR để biến đổi sợi RNA thành DNA cho quá trình tạo dòng để phân tích trình tự gen (gene sequencing) hay tái tổ hợp (recombination) trong nghiên cứu biểu hiện gen.