ở 40-65oC tổng hợp mạch nhờ DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) 70-72oC PCR có ứng dụng rộng rãi chẩn đoán y học, phân tích đa dạng sinh học, chọn giống nhiều lĩnh vực khác Nhà khoa học Mỹ (Tiến sĩ Mullis) người phát minh kỹ thuật PCR nhận giải Nobel năm 1993 Cùng chia sẻ Giải Nobel với Mullis Smith (Canada) có đóng góp mang tính tảng cho việc gây đột biến điểm định hướng, dựa oligonucleotide việc phát triển chúng nghiên cứu protein Phân tích trình tự gen (gene sequencing) Là kỹ thuật xác định trình tự theo cấu trúc bậc chuỗi nucleotide phân tử nucleic acid Phân tích trình tự DNA có phương pháp hóa học MaxamGilbert phương pháp enzyme Sanger Trong năm gần đây, số phương pháp xác định trình tự nhờ hỗ trợ máy tính xuất Bên cạnh kỹ thuật thông thường sử dụng polyacrylamide gel để phân ly phân tử DNA có độ dài khác nhau, kỹ thuật liên quan đến phát huỳnh quang nucleotide đánh dấu, phân tích trình tự DNA khối phổ, điện di mao dẫn lai với đoạn oligonucleotide tổng hợp nhân tạo đời Năm 1980, Sanger (Anh) Gilbert (Mỹ) trao giải Nobel có đóng góp quan trọng phương pháp xác định trình tự nucleotide phân tử DNA Đóng góp mốc lịch sử to lớn sinh học phân tử, nguyên lý tất máy xác định trình tự DNA tự động sử dụng khắp giới Phần cuối (telomere) Đoạn cuối, phần cuối nhiễm sắc thể thẳng eukaryote, bao gồm trình tự DNA ngắn lặp lại nhiều lần Phần tâm (centromere) Phần co thắt thấy nhiễm sắc thể kỳ giữa, nơi hai nhiễm sắc tử đính với Phiên mã (transcription) Là trình xúc tác enzyme phiên mã RNA polymerase để tổng hợp mRNA từ khuôn mẫu DNA Phiên mã ngược (reverse transcription) Quá trình tổng hợp DNA từ khuôn mẫu mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 193 Phóng xạ tự ghi (autoradiography) Kỹ thuật phát phân tử có đánh dấu phóng xạ thơng qua hiệu ứng tạo ảnh phân tử phim X-quang Phosphatase kiềm (alkaline phosphatase) Enzyme loại bỏ nhóm 5’-phosphate từ đầu phân tử DNA để lại nhóm 5’hydroxyl Plasmid có cấu trúc mạch vịng kép, nằm tế bào chất ngồi nhân, có khả chép độc lập nhiễm sắc thể tế bào Tồn sinh vật prokaryote eukaryote Ngày nay, plasmid thiết kế nhân tạo sử dụng rộng rãi vector dùng kỹ thuật tạo dòng biểu gen Plasmid khơng tiếp hợp (non-conjugative plasmid) Ví dụ: plasmid ColE1, loại plasmid không dùng tiếp hợp cho trình sống, thơng thường plasmid có kích thước bé, tồn với số lượng nhiều Cơ chế nhân lên (nhiều sao) chúng khác hoàn tồn với plasmid tiếp hợp Plasmid khơng tương hợp (incompatible plasmid) Là plasmid tồn với vài hệ tế bào vật chủ, sau q trình phân chia tế bào, số chúng bị thải loại Muốn tương hợp tế bào vật chủ, plasmid khác phải có chung số đặc điểm trình tồn Plasmid tiếp hợp (conjugative plasmid) hay plasmid F (fertility (F) plasmid) Là plasmid chuyển giao DNA chúng từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác nhờ phương thức tiếp hợp (do chúng có tổ hợp gen để sản xuất ống protein hay cịn gọi lơng giới tính (sex pile) làm cầu nối hai tế bào vi khuẩn với nhau) DNA plasmid, chí DNA hệ gen vi khuẩn, thông qua ống protein để chuyển từ tế bào vi khuẩn “cho” sang tế bào vi khuẩn “nhận” Các plasmid, việc chuyển giao DNA riêng chúng, cịn có khả chuyển giao phần hay nhiều phần hệ gen tế bào vi khuẩn vật chủ đến tế bào vi khuẩn “nhận” khác Do vậy, chúng gọi nhân tố giới tính (sex factor) vi khuẩn vật chủ, có vai trò quan trọng bảo tồn di truyền vi khuẩn theo phương thức Công nghệ DNA tái tổ hợp 194 Plasmid tương hợp (compatible plasmid) Là loại plasmid có tế bào vật chủ không ảnh hưởng lẫn Khi tế bào vật chủ phân chia, chúng đồng thời phân chia tồn vĩnh viễn Polyacrylamide Là polymer acrylamide bisacrylamide có cấu trúc gồm liên kết chéo tạo mảng xốp (giống bọt biển) Các chất phải chui vào lỗ gel được, chất có khối lượng phân tử nhỏ trước ngược lại Polynucleotide Trình tự nucleotide nối đồng hóa trị với nhau, vị trí 3’ pentose nucleotide nối với liên kết phosphodieste vị trí 5’ pentose nucleotide Polypeptide Một chuỗi dài amino acid nối với liên kết peptide Prokaryote Sinh vật đơn bào khơng có nhân tế bào điển hình, DNA nằm tế bào chất khơng có màng bao bọc, khơng có ngun phân giảm phân; đại diện điển hình vi khuẩn Prophage Phage ơn hịa xen vào nhiễm sắc thể vi khuẩn tiềm tan Nó chép đồng thời với nhiễm sắc thể tế bào vi khuẩn chủ Protein Một phân tử lớn gồm nhiều chuỗi polypeptide, chuỗi có trình tự amino acid khối lượng phân tử đặc trưng Protein hợp chất quan trọng bậc thể sống Về cấu trúc, protein phân tử mạch dài gồm đơn vị cấu trúc nhỏ amino acid nối với qua mối liên kết peptide Khối lượng phân tử protein từ vài nghìn đến vài triệu Có khoảng 20 loại amino acid Các loại protein phức tạp có liên kết thêm với nhóm bổ sung Protein dung hợp (fusion protein) Là protein tái tổ hợp lai mã hóa gen lai (fusion gene) dung hợp in vitro đoạn gen khác plasmid vector sau biến nạp vào vi sinh vật chủ (chẳng hạn E coli) Vì vậy, protein dung hợp mang trình tự amino acid hai protein khác biệt tổng hợp từ đầu N vector biểu Protein nguyên thể (native protein) Là protein tái tổ hợp mã hóa gen ngoại lai (foreign gene) vi sinh vật chủ Khác với protein dung hợp, protein nguyên thể tổng hợp từ đầu N khơng phải từ đầu N vector Công nghệ DNA tái tổ hợp 195 Purine Một hợp chất dị vịng, kiềm, có nitrogen, thành phần nucleotide nucleic acid Purine chứa nhân pyrimidine kết hợp với nhân imidazol Pyrimidine Một nitrogen base dị vịng có nucleotide nucleic acid Retrovirus Là loại virus RNA chứa enzyme reverse transcriptase sinh sản dạng DNA mạch kép Chúng có khả xâm nhiễm tế bào vật chủ cao Khi xâm nhiễm có khả gắn hệ gen virus với hệ gen tế bào vật chủ, sở để thiết kế vector liệu pháp gen hiệu Ribonuclease Enzyme xúc tác đặc hiệu việc phân hủy RNA cách cắt mối liên kết phosphodiester RNA Ribonucleic acid (RNA) Thường phân tử đa phân mạch đơn gồm đơn vị cấu trúc sở ribonucleotide Về mặt hóa học RNA giống với DNA RNA v óa DNA Ribonucleotide Đơn vị cấu trúc sở RNA, gồm ba thành phần: đường ribose, nitrogen base nhóm phosphate Ribosome Người ta thấy ribosome ty thể, có tổng hợp số protein ty thể RNA bổ sung (complementary RNA) RNA ligase eukaryote mRNA (pre-mRNA) mRNA hoàn chỉnh e RNA polymerase (DNA-dependent RNA polymerase), x mẫu Công nghệ DNA tái tổ hợp polymerase 196 RNA ribosome (ribosomal RNA, rRNA) L E coli RNA thông tin (messenger RNA, mRNA) Một loại RNA phiên mã từ trình tự DNA mRNA truyền thơng tin di truyền từ nhiễm sắc thể tới ribosome để mẫu, nucleotide m sung polynucleotide mẫu ngoại hymine l p m ribosome (transfer RNA, tRNA) ribosome amino acid phân tử pro amino acid amino acid nitrogen base mRNA amino acid m e RNA kích thước nhỏ nhân (small nuclear RNA, snRNA) Sàng lọc (screening) Kỹ thuật nhận dạng dòng DNA thư viện hệ gen (genomic library) thư viện cDNA (cDNA library) phương pháp lai mẫu dị có đánh dấu [ -32P]dCTP với vết tan (trường hợp dùng bacteriophage λ làm vector tạo dòng cho xâm nhiễm vào vi khuẩn E coli) khuẩn lạc (dùng plasmid làm vector tạo dòng) thư viện màng nylon nitrocellulose Tín hiệu lai phát phóng xạ tự ghi phim X-quang Công nghệ DNA tái tổ hợp 197 Sinh học phân tử (molecular biology) Khoa học nghiên cứu tượng sống mức độ phân tử Lĩnh vực khoa học trẻ tuổi điểm gặp khoa học kinh điển di truyền học, hóa sinh học, tế bào học, vật lý học, hóa học hữu hóa lý Theo cách hiểu phổ biến nay, sinh học phân tử khoa học nghiên cứu gen hoạt động chúng mức độ phân tử, bao gồm phiên mã, dịch mã, chép, điều hòa biểu gen, tái tổ hợp chuyển gen Sinh tổng hợp protein (protein synthesis) Phản ứng hóa học diễn ribosome tạo nên phân tử protein từ amino acid sở thông tin di truyền nhận từ nhân tế bào thông qua mRNA Southern blot Kỹ thuật chuyển cố định DNA biến tính từ agarose gel (sau phân đoạn điện di) lên màng lai nylon hay nitrocellulose để lai với mẫu dò đánh dấu đồng vị phóng xạ [ 32 P]dCTP digoxigenin-dUTP Số (copy number) (1) Số phân tử plasmid có tế bào vi khuẩn (2) Số lượng gen hệ gen sinh vật Sơ đồ phóng xạ tự ghi (autoradiogram) Hình ảnh sinh phim X-quang phát xạ hạt phóng xạ Tái tổ hợp (recombination) Q trình mà nhiễm sắc thể hay phân tử DNA đứt phần đứt nối lại theo tổ hợp Quá trình xảy tế bào sống (qua trao đổi chéo phân bào giảm nhiễm) hay ống nghiệm nhờ enzyme cắt nối DNA Tạo dòng gen (gene cloning) Còn gọi nhân dòng, tách dịng hay dịng hóa, sản sinh nhiều phân tử DNA, thường phân tử DNA tái tổ hợp plasmid vector, cách chép phân tử vật chủ thích hợp chẳng hạn vi khuẩn E coli Terminal transferase Enzyme bổ sung gốc nucleotide vào đầu 3’ oligonucleotide polynucleotide Tế bào khả biến (competent cell) Các tế bào vi khuẩn có khả tiếp nhận DNA ngoại lai q trình biến nạp Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 198 Thể biến nạp (transformant) Tế bào sinh vật nhận gen sinh vật khác trình biến nạp biểu chức gen kiểu hình (polymorphism) hệ gen kiểu cắt hạn chế (restriction patterns) Thể tái tổ hợp (recombinant) Các cá thể tế bào mang tổ hợp gen khác với cha mẹ chúng q trình tái tổ hợp di truyền sinh Thơng tin di truyền (genetic information) Thông tin lưu trữ phân tử DNA sinh vật dạng trình tự xếp bốn nucleotide ký hiệu A, T, C G đóng vai trị ”chữ cái” ”ngôn ngữ” di truyền Trong ngôn ngữ này, từ có ba chữ gọi ba Nghĩa từ amino acid có mặt phân tử protein tương ứng Mỗi ”câu” ngôn ngữ di truyền gen chứa đựng thông tin di truyền để đảm nhiệm chức trọn vẹn Mỗi chức đặc tính sinh lý, hình thái hay cấu trúc sống Do chế chép theo kiểu nửa bảo toàn DNA mà thơng tin di truyền truyền xác từ hệ sang hệ không thay đổi Thư viện cDNA (cDNA library) Tập hợp dòng DNA tạo từ mRNA tế bào mô cụ thể bacteriophage vector, đại diện cho thông tin di truyền mà tế bào biểu Thư viện hệ gen (genomic library) Tập hợp tất đoạn DNA tạo từ phản ứng cắt hạn chế genome bacteriophage vector, đại diện cho tồn cho thơng tin di truyền hệ gen Trì hỗn gel (gel retardation) Phương pháp xác định điểm bám protein đoạn DNA, dựa vào độ di chuyển chậm chúng so với DNA không bị protein bám thí nghiệm điện di gel Trình tự dẫn đầu (leader sequence) Một ba phần chủ yếu phân tử mRNA Trình tự nằm đầu 5’ mRNA mang thông tin để ribosome protein đặc hiệu nhận biết bắt đầu trình tổng hợp polypeptide, trình tự dẫn đầu khơng dịch mã thành trình tự amino acid Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 199 Trình tự điều hịa (regulatory sequence) Một trình tự DNA tham gia vào trình điều hịa gen Ví dụ: trình tự promoter operator Trình tự khởi động (promoter) Trình tự nucleotide đặc hiệu nằm thành phần operon, có chức điều hịa hoạt động operon, nơi RNA polymerase bám vào để bắt đầu trình phiên mã Trình tự đặc trưng promoter có khoảng 20-200 nitrogen base Trình tự Shine-Dalgarno (Shine Dalgarno sequence, SD) Còn gọi vùng liên kết ribosome (RBS), phần trình tự nucleotide đầu 5’ mRNA prokaryote kết hợp bổ sung cặp base với đầu 3’ 16S rRNA, dùng làm tín hiệu cho khởi đầu dịch mã Trình tự tăng cường (enhancer) Trình tự nucleotide dạng cis làm tăng cường độ phiên mã promoter gen eukaryote Nó nằm cách promoter hàng ngàn cặp base hoạt động theo hai hướng vị trí so với promoter Ủ để gắn mồi (annealing) cách sử dụng dNTP có mơi trường để kéo dài primer nhờ xúc tác enzyme Taq DNA polymerase (trong khuếch đại PCR) DNA polymerase I (trong tổng hợp cDNA) Ức chế amber (amber suppresser) codon Vật chủ (host) Tế bào dùng để nhân phân tử DNA lên nhiều lần Vector Là phân tử DNA đ biểu gen, (E coli nấm men) Có ba nhóm vector gồm: (1) Nhóm plasmid, (2) Nhóm phage/phagemid, (3) Nhóm nhiễm sắc thể nhân tạo (artificial chromosome: BAC, YAC… Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 200 Vector tạo dịng (cloning vector) Phân tử DNA mạch kép có khả tự chép tế bào vật chủ Có thể gắn vào phân tử đoạn vài đoạn DNA khác nguồn tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp dùng để nhân dòng Vector biểu (expression vector) Phân tử DNA mạch kép có mang tín hiệu cần thiết (promoter, terminator vùng liên kết ribosome) cho biểu khung đọc mở (gen) nhân dòng sản xuất protein tương ứng tế bào vật chủ Vết tan (plaque) Vòng tròn suốt xuất thảm đục vi khuẩn mọc môi trường thạch đặc, tan vỡ lặp lại nhiều chu kỳ tế bào vi khuẩn bị bacteriophage xâm nhiễm sinh tan Virus Phức hợp chứa nucleic acid (DNA RNA) nằm vỏ bọc protein, có khả gây nhiễm tái bên tế bào vật chủ đặc hiệu, tạo nhiều virus, lan truyền từ tế bào sang tế bào khác Virus dạng sống khơng có cấu trúc tế bào, có khả xâm nhập vào tế bào sống xác định sinh sản bên tế bào Giống tất cá sinh vật khác, virus có máy di truyền riêng mình, mã hóa việc tổng hợp hạt virus từ chất có tế bào vật chủ Như vậy, virus vật ký sinh nội bào Virus phân bố khắp nơi tự nhiên, xâm nhập vào tất nhóm sinh vật Người ta biết khoảng 500 loại virus xâm nhập động vật máu nóng, 300 loại xâm nhập thực vật bậc cao Một số khối u ung thư động vật người virus Virus tồn hai dạng: dạng nghỉ hay ngoại bào dạng sinh sản hay nội bào Kích thước hạt virus từ 15-350 nm, chiều dài số loại virus đạt tới 2000 nm Phần lớn virus nhìn thấy qua kính hiển vi điển tử Chất mang thông tin di truyền virus nucleic acid: DNA RNA Vì vậy, phân virus thành hai loại: loại mang DNA loại mang RNA Vị trí cos (cos site) hay đầu cos (cos end) Trình tự nucleotide cắt để tạo thành phần mở rộng sợi đơn, kết dính hai đầu cuối phân tử DNA mạch thẳng phage (ví dụ: phage λ) Vịng cặp tóc (hairpin loop) Vùng chuỗi đơn bổ sung tạo nếp gấp chứa cặp base tạo thành xoắn kép, Vùng hướng (downtream) Đề cập đến vị trí đoạn trình tự nằm phía đầu 3’ gen đoạn gen quan tâm Công nghệ DNA tái tổ hợp 201 Vùng liên kết ribosome (ribosome binding sites, RBS) Là trình tự nuleotide phân (xem trình tự Shine-Dalgarno) Vùng ngược hướng (upstream region) Vị trí trình tự nucleotide nằm phía đầu 5’ phân tử DNA so với gen quan tâm Vùng tạo dòng (multiple cloning sites, MCS) hay vùng đa nối (polylinker hay polycloning sites) số enzyme cắt hạn chế thông dụng, thiết kế để chèn đoạn DNA ngoại lai vào Western blot Kỹ thuật chuyển protein tổng số phân tách điện di SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) lên màng nylon nitrocellulose để lai với kháng thể đặc hiệu sau kháng thể hai có đánh dấu enzyme nhằm phát protein kháng nguyên tương ứng YAC (Yeast artificial chromosome) Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men, dùng làm vector để tạo dòng đoạn DNA có kích thước lớn nấm men Tài liệu tham khảo/đọc thêm Ban Từ điển-NXB Khoa học Kỹ thuật 2002 Từ điển Bách khoa Sinh học NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Lawrence E 1995 Henderson’s Dictionary of Biological Terms 7th ed Longman Group Ltd Singapore Nill K 2002 Glossary of Biotechnology Term 3rd ed CRC Press LLC, USA Old RW and Primrose SB 1994 Principles of Gene Manipulation Blackwell Scientific Publications, Osney Mead, Oxford, UK Singleton P and Sainsbury D 2001 Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed John Wiley & Sons, Ltd UK Công nghệ DNA tái tổ hợp 202 Lời nói đầu Cơng nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen) phận quan trọng cơng nghệ chìa khóa (key technology) lĩnh vực công nghệ sinh học Công nghệ DNA tái tổ hợp đời sở thành tựu sinh học phân tử đóng vai trò cách mạng phát triển sinh học cải tạo sinh giới Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép nhà công nghệ sinh học phân lập khuếch đại gen đơn từ genome sinh vật để nghiên cứu, biến đổi chuyển vào thể sinh vật khác Các kỹ thuật gọi tạo dịng gen sản xuất số lượng lớn gen xác định Bên cạnh giáo trình như: sinh học phân tử, nhập môn công nghệ sinh học, công nghệ tế bào, cơng nghệ chuyển gen… giáo trình cơng nghệ DNA tái tổ hợp giúp sinh viên tiếp cận thêm lĩnh vực khác công nghệ sinh học thông qua việc cung cấp kiến thức theo hướng tạo dòng biểu gen sau: - Các enzyme dùng tạo dòng phân tử - Các hệ thống vector - Một số kỹ thuật tạo dòng gen: điện di, PCR… - Tạo dòng xây dựng thư viện genomic DNA cDNA - Biểu gen tạo dòng E coli Do giáo trình xuất lần đầu tiên, lĩnh vực công nghệ DNA tái tổ hợp lại phức tạp, nên khó tránh khỏi thiếu sót chưa đáp ứng yêu cầu bạn đọc Vì thế, chúng tơi mong nhận nhiều ý kiến đóng góp để lần xuất sau hồn thiện Chúng tơi chân thành cảm ơn Quỹ Nâng cao chất lượng-Dự án Giáo dục đại học hỗ trợ chúng tơi biên soạn giáo trình này, PGS TS Lê Trần Bình đọc thảo góp nhiều ý kiến quý báu Các tác giả Công nghệ DNA tái tổ hợp Chương Các enzyme dùng tạo dòng phân tử sinh vật prokaryote, chúng bacteriophage để , người ta tìm thấy từ khoảng 250 chủng vi sinh vật Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II III Các enzyme dùng phổ biến thuộc type II, có chế tác động đơn giản Đây nuclease cắt vị trí đặc hiệu nằm bên sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên gọi endonuclease Tên gọi đầy đủ chúng restriction endonuclease type II, hay gọi đơn giản enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE) Các enzyme hạn chế type II Cách gọi tên enzyme hạn chế dựa qui ước quốc tế Tên chi tên loài sinh vật, mà tìm thấy enzyme, dùng để đặt cho phần đầu tên enzyme (viết nghiêng) bao gồm: chữ thứ tên chi hai chữ đầu tên lồi Ví dụ: enzyme tách chiết từ vi khuẩn Escherichia coli có tên Eco, enzyme tách chiết từ vi khuẩn Bacillus globigii viết Bgl… Ngồi ra, tên gọi enzyme hạn chế bổ sung thêm phần sau (viết thẳng), tùy thuộc vào chủng vi khuẩn liên quan tùy thuộc vào có mặt hay khơng yếu tố ngồi nhiễm sắc thể Ví dụ: RI enzyme EcoRI có nghĩa sau: R viết tắt chủng RY13, I bậc xác định vi khuẩn (first identified order in bacterium) Giá trị enzyme hạn chế tính đặc hiệu chúng riêng biệt bao - : enzyme Eco hexanucleotide (6 nucleotide): Công nghệ DNA tái tổ hợp 5’ GAATTC 3’ EcoRI 5’ G AATTC 3’ + 3’ CTTAAG 5’ 3’ CTTAA G 5’ Eco (protruding) 5’ khác (ví dụ: Pst 5’ Trong đó, m : SmaI) lại 1.1) Stt Tên enzyme EcoRI 5’…G AATTC…3’ 3’…CTTAA G…5’ 5’…G AATTC…3’ 3’…CTTAA G…5’ HindIII 5’…A AGCTT…3’ 3’…TTCGA A…5’ 5’…A AGCTT…3’ 3’…TTCGA A…5’ PstI 5’…CTGCA G…3’ 3’…G ACGTC…5’ 5’…CTGCA G…3’ 3’…G ACGTC…5’ HpaI 5’…GTT AAC…3’ 3’…CAA TTG…5’ 5’…GTT AAC…3’ 3’…CAA TTG…5’ HpaII 5’…C CGG…3’ 3’…GGC C…5’ 5’…C CGG…3’ 3’…GGC C…5’ HaeIII 5’…GG CC…3’ 3’…CC GG…5’ 5’…GG CC…3’ 3’…CC GG…5’ BamHI 5’…G GATCC…3’ 3’…CCTAG G…5’ 5’…G GATCC…3’ 3’…CCTAG G…5’ BglII 5’…A GATCT…3’ 3’…TCTAG A…5’ 5’…A GATCT…3’ 3’…TCTAG A…5’ SmaI 5’…CCC GGG…3’ 3’…GGG CCC…5’ 5’…CCC GGG…3’ 3’…GGG CCC…5’ 10 XmaI 5’…C CCGGG…3’ 3’…GGGCC C…5’ 5’…C CCGGG…3’ 3’…GGGCC C…5’ Công nghệ DNA tái tổ hợp Với bốn loại nitrogen base phân tử DNA giả thiết trình tự xếp chúng ngẫu nhiên, tần số mong đợi (kỳ vọng) đoạn trình tự xác định nào, theo tính tốn 4n, n chiều dài đoạn nhận biết Từ đó, thấy với đoạn có bốn nucleotide cách 256 cặp base chúng lặp lại lần, đoạn sáu nucleotide cách 4096 cặp base lặp lại Tất nhiên, giá trị dao động lớn, nói chung chiều dài đoạn sinh gần với giá trị tính tốn Chẳng hạn, enzyme nhận biết đoạn trình tự bốn nucleotide sản sinh đoạn ngắn so với đoạn sáu nucleotide (cohesive ends), gọi đầu lồi hay đầu so le -C Ví dụ: đầu dính tạo nhờ PstI 5’ CTGCAG 3’ PstI 5’ CTGCA G 3’ + 3’ GACGTC 5’ -C 3’ G ACGTC 5’ (blunt ends), gọi đầu thơ Ví dụ: đầu tạo nhờ HaeIII 5’ GGCC 3’ HaeIII 5’ GG CC 3’ + 3’ CCGG 5’ - 3’ CC GG 5’ DNA : vào đầu (đoạn nối) cách t o có từ 10-20 nucleotide +G trình tự sau: 5’ NN GAATTC NN 3’ 3’ NN CTTAAG NN 5’ +D Công nghệ DNA tái tổ hợp (xem chương 6) Isochizomer 1.1 (4 nucleotide) : - Mbo Sau3AI : 5’ GATC 3’ 3’ CTAG 5’ - trình tự: Bam 5’ GGATCC 3’ 3’ CCTAGG 5’ khác (hybrid) (G TCGAC) : Sal XhoI cắt trình tự (C TCGAG) Sal 5’ G TCGAG 3’ 5’ GTCGAG 3’ C 5’ XhoI: 3’ CAGCTC 5’ + 3’ CAGCT Methyl hóa mục đích (CH3 : Eco : GAATTC CTTAAG Cơng nghệ DNA tái tổ hợp methyl hóa * GAATTC CTTAAG * , RE E coli dam : dcm - dam (DNA adenine methylase) 5’…G ATC…3’ me Nhưng DNA - dcm (DNA cystosine methylase) me 5’…C CAGG…3’ bên yếu dcm me 5’…C CTGG…3’ Enzyme chủ EcoRII, enzyme Bst Eco BstNI cho Eco E coli dcm 5.1 Các loại đệm dùng phản ứng cắt DNA : - (H) - (M) - (L) Công nghệ DNA tái tổ hợp ( o - -20 o 1.2 NaCl MgCl2 Dithiothreitol (mM) (mM) (mM) (mM) 10 10 50 10 10 100 Cao Tris.HCl pH 7,5 50 10 Riêng enzyme Sma , bao gồm: 20 mM KCl, 10 mM Tris.Cl (pH 8), 10 mM MgCl2, mM dithiothreitol 5.2 0,2-1 g DNA/20 L phản ứng : 17 L L phản ứng ( RE (vortex) Ví dụ: BstXI XbaI 10 (H) : 10 (H) EcoRI : 10 (H) Một unit ( sung unit/μL u) , ký hiệu 20 : BstXI : 1Công nghệ DNA tái tổ hợp o /50 C XbaI /37oC EcoRI /37oC 10 mM L( - - hai -20oC (hoặc -80oC (ice bath) II Các enzyme trùng hợp DNA polymerase (DNA-dependent DNA polymerase) DNA polymerase điều kiện in vitro E coli n DNA polymerase I enzyme E coli : - Hoạt tính polymerase 5’ 3’ cho tổng hợp DNA theo chiều 5’ nucleoti Công nghệ DNA tái tổ hợp E coli xúc tác ... đầu trình tổng hợp polypeptide, trình tự dẫn đầu khơng dịch mã thành trình tự amino acid Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 199 Trình tự điều hịa (regulatory sequence) Một trình tự DNA tham gia vào trình. .. Singleton P and Sainsbury D 20 01 Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed John Wiley & Sons, Ltd UK Công nghệ DNA tái tổ hợp 20 2 Lời nói đầu Cơng nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi kỹ thuật... patterns) Thể tái tổ hợp (recombinant) Các cá thể tế bào mang tổ hợp gen khác với cha mẹ chúng trình tái tổ hợp di truyền sinh Thông tin di truyền (genetic information) Thông tin lưu trữ phân tử DNA sinh