MƠ HÌNH VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢI LO ÂU CỦA MỘT SỐ PHỐI HỢP TỪ DƯỢC LIỆU TÓM TẮT Mở đầu: Việc tìm thuốc giải lo âu khơng có có tác dụng có hại nhu cầu thiết Do đó, việc khảo sát mơ hình áp dụng nhằm sàng lọc thuốc chữa bệnh phong phú an toàn từ tự nhiên hay tổng hợp cần thiết Mục tiêu: Khảo sát mô hình dược lý nhằm nghiên cứu tác dụng giải lo âu, qua đó, khảo sát thăm dị tác dụng giải lo âu công thức phối hợp từ cao dược liệu Phương pháp: Ba mơ hình nghiên cứu tác dụng giải lo âu khảo sát bao gồm mơ hình mơi trường mở, mơ hình chữ thập nâng cao mơ hình ngăn sáng - tối Chuột nhắt đực trắng, chủng Swiss abino cho uống phối hợp cao chiết CT1, CT2 CT3 phối hợp từ cao chiết dược liệu rau má, quế nhân sâm, có so sánh với diazepam mg/kg Kết quả: Khi sử dụng diazepam liều 2mg/kg (p.o.) thể tác dụng tác dụng giải lo âu chuột nhắt Khi khảo sát tác dụng công thức mơ hình dược lý thực nghiệm mơi trường mở, chữ thập nâng cao, ngăn sáng-tối lặp lại kết cơng thức thử nghiệm khơng có tác dụng giải lo âu Kết luận: Đề tài thành cơng việc chứng tỏ áp dụng ba mơ hình điều kiện thực tế nhằm sàng lọc hoạt chất có tác dụng giải lo âu Từ khóa: mơ hình giải lo âu, chuột nhắt, Swiss abino, rau má, quế, nhân sâm ABSTRACT EVALUATING THE APPLICABILITY OF ANXIETY MODELS FOR SCREENING SOME NATURAL PRODUCTS FORMULAE Nguyen Son Tung, Nguyen Ngoc Khoi * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 14 - Supplement of No - 2010: 80 – 85 Background: The use of animal models of anxiety has been fundamental in the search for new anxiolytic compounds and for the understanding of the brain mechanisms underlying anxiety Objectives: To evaluate the applicability of mouse models for screening anxiolytic compounds In this study, three formulae from Centella asiatica, Cinnamomum cassia and Panax ginseng extracts were used as testers Method: Five-week-old male Swiss albino mice were used Three models in mice were investigated including open field (OF), elevated plus-maze (EPM) and light dark (LD) test Compounds were administered at a rate of 0.1 ml/10 g and diazepam mg/kg as a positive control All test were performed sixty minutes after receiving the oral treatments Results: These above mentioned formulae administered groups did not reveal any changes in anxiety-like behaviours However, diazepam mg/kg administered group showed displayed an increased number of entries and spent more time in the centre area in OF, significantly increased in the percentage of open arm entries and the time spent on the open arm in EPM, and spent more time in light box in LD test Conclusion: All together, we provide evidence that these models is sensitive and applicable, and diazepam mg/kg is a good positive control for the screening of anxiolytic-like effects Key words: anxiolytic, mice, Swiss abino, Centella asiatica, Cinnamomum cassia, Panax ginseng ĐẶT VẤN ĐỀ Bên cạnh việc nghiên cứu dược phẩm tổng hợp mới, người nhận nguồn thuốc chữa bệnh phong phú an toàn từ tự nhiên Nhiều dược liệu (đa số nghiên cứu cao toàn phần) phát có tác dụng giải lo âu thử nghiệm dược lý thú vật Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành khảo sát mơ hình dược lý nhằm nghiên cứu tác dụng giải lo âu, qua đó, khảo sát thăm dò tác dụng giải lo âu công thức phối hợp từ cao dược liệu rau má, quế nhân sâm Đây dược liệu chứng minh có tác dụng giải lo âu (1, 2, 3) nguồn dược liệu lớn, dễ tìm với hy vọng giảm liều sử dụng so với sử dụng cao riêng lẻ mà trì hiệu tác dụng giải lo âu, làm tiền đề cho nghiên cứu NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Ba dược liệu lựa chọn để nghiên cứu đề tài gồm có: rau má (Centella asiatica (L.) Urban), quế (Cinnamomum cassia Blume) nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer) mua TP Hồ Chí Minh Các dược liệu lưu mẫu Ban nghiên cứu khoa học, Khoa Dược, ĐH Y-Dược TP Hồ Chí Minh Súc vật nghiên cứu: Chuột nhắt đực trắng (chủng Swiss abino, – tuần tuổi, khối lượng từ 20 – 25 g) cung cấp Viện Văcxin & Sinh phẩm Y tế Nha Trang Chuột nuôi ổn định tuần thức ăn thường trước tiến hành thử nghiệm Hóa chất: diazepam (Valium®), asiaticosid chuẩn cung cấp Ban Nghiên Cứu Khoa Học, Khoa Dược, ĐH Y-Dược TP HCM Chiết xuất: Nguyên liệu sấy 50 OC giờ, đem xay để đạt kích thước – mm Cam thảo chiết nước phương pháp đun hồi lưu (2 lần) Nghệ chiết cồn 96O theo phương pháp ngấm kiệt Nhân sâm chiết phương pháp đun hồi lưu với cồn 90 độ (3 lần) cồn 45O (3 lần) Tỷ lệ dung môi: dược liệu 1: 10 Tất dịch chiết sau giảm áp đến cao lỏng Kết chiết xuất tính sau trừ độ ẩm Định lượng Cao rau má: Mẫu cao toàn phần cho vào cột Diaion HP-20, rửa giải nước, metanol 50% metanol Lấy phân đoạn metanol 50% metanol, bay dung mơi để thu saponin tồn phần Định lượng asiaticosid saponin toàn phần từ cao rau má phương pháp HPLC Các điều kiện tiến hành HPLC: Máy HPLC LC-10AD (Shimadzu, Nhật) Cột Supelcosil LC18 (250 x 4,6 mm), kích thước hạt µm, kèm cột bảo vệ Supelguard (20 x 4,6 mm) Pha động: acetonitril - metanol - nước (25: 20: 55) Tốc độ dịng: 0,7 ml/phút Mẫu thử: cân xác khoảng 10 mg saponin tồn phần, hịa tan ml pha động, lọc qua lọc 0,45 µm trước bơm vào máy HPLC Thể tích bơm: 10 µl Dectector PDA, bước sóng phát hiện: 203 nm Cao quế: Tiến hành theo phương pháp định lượng acid hữu dược liệu, “Bài giảng Dược liệu”, tập 1, ĐH Dược Hà Nội Cân 500 mg cao tồn phần, hịa tan vào nước lọc qua giấy lọc vào bình định mức 100 ml, thêm nước cho đủ 100 ml Lấy 10 ml dịch nước cho qua cột nhựa cationit để loại cation Dịch nước rửa giải trung hòa Ba(OH)2 0,01N Qua lượng Ba(OH)2 tiêu thụ ta định lượng acid hữu toàn phần cao quế Cao nhân sâm: Định lượng G-Rb1 G-Rg1 saponin toàn phần từ cao nhân sâm phương pháp HPLC Máy HPLC LC-10AD (Shimadzu, Nhật), cột Supelcosil LC18 (250 x 4,6 mm), kích thước hạt µm, kèm cột bảo vệ Supelguard (20 x 4,6 mm), pha động: acetonitril – nước (33: 67), tốc độ dòng: 0,7 ml/ phút Cân 6,63 mg saponin tồn phần, hịa tan pha động, lọc qua lọc 0,45 µm trước bơm vào máy HPLC với thể tích bơm: 10 µl Dectector PDA, bước sóng phát hiện: 203 nm Các quy trình định lượng thẩm định độ độ xác (được xây dựng để định lượng saponin sâm Triều Tiên nghệ Ban NCKH – Khoa Dược) Các công thức phối hợp dược liệu khảo sát Tác dụng giải lo âu rau má, nhân sâm, quế chứng minh với liều có tác dụng sau: Rau má: liều asiaticosid 10 mg/kg (p.o.) có tác dụng giải lo âu chuột nhắt thử nghiệm mơ hình chữ thập nâng cao(3) Quế: cao tồn phần chiết cồn 50% quế có tác dụng giải lo âu chuột nhắt liều 750 mg cao/kg (p.o.), mơ hình dược lý thực nghiệm chữ thập nâng cao(1) Nhân sâm: liều 1200 mg bột nhân sâm/kg (p.o.), 100 mg saponin toàn phần/kg (i.p.) 5mg saponin G-Rb1/kg (i.p.) có tác dụng giải lo âu thử nghiệm chữ thập nâng cao chuột nhắt(2) Vì mục đích thăm dị có hay khơng tác động hiệp lực dược liệu này, phối hợp chúng với liều thấp liều Cụ thể, dùng rau má với liều khoảng 3-5 mg asiaticosid/kg, tương đương với khoảng 100150 mg cao toàn phần/kg (hàm lượng asiaticosid mẫu cao toàn phần rau má đề tài 3,23%) Liều asiaticosid mg/kg chứng minh khơng có tác dụng giải lo âu sử dụng riêng lẻ (3) Bên cạnh đó, để đảm bảo tính khả thi dùng cho người (liều dược liệu sử dụng lớn, phải mức chấp nhận được) hạn chế tổng liều dược liệu mức 200 mg cao/kg cân nặng chuột Vì lý trên, công thức phối hợp đưa thử nghiệm chuột nhắt (tính kg cân nặng chuột) sau: Công thức 1: Rau má: 150 mg cao khô/kg Quế: 50 mg cao khô/kg Công thức 2: Rau má: 100 mg cao khô/kg Quế: 100 mg cao khô/kg Công thức 3: Rau má: 150 mg cao khô/kg Quế: 25 mg cao khô/kg Nhân sâm: 25 mg cao khơ/kg Bố trí thí nghiệm Tất chuột mã hóa chữ số để thuận tiện cho việc phân tích kết sau Chuột chia ngẫu nhiên thành nhóm: Nhóm 1: nhóm chứng, uống nước cất Nhóm 2: nhóm đối chiếu, uống diazepam liều mg/kg Nhóm 3: nhóm thử, uống cơng thức Nhóm 4: nhóm thử, uống cơng thức Nhóm 5: nhóm thử, uống cơng thức Mơ hình mơi trường mở (Open field test): Bộ dụng cụ gồm hộp kích thước 40 x 40 x 40 cm, với tường suốt, đáy hộp chia làm 16 ô vng có kích thước (10 x 10 cm) Sàn chia làm vùng rìa vùng trung tâm (kích thước 20 x 20 cm, nằm giữa) Cường độ chiếu sáng sàn 100 lux Chuột thử nghiệm cho uống 60 phút trước thử nghiệm Tất chuột đặt cố định vào góc mơ hình, thực thử nghiệm phút, ghi nhận số ô vuông chuột di chuyển vào, số lần đứng lên, thời gian số lần vào vùng trung tâm Chuột tính di chun lần vào vùng trung tâm chân chuột bước qua vạch phân cách Mơ hình chữ thập nâng cao (Elevated plus-maze) Bộ dụng cụ gồm cánh tay mở (30 cm x cm) cánh tay đóng (30 cm x cm) với tường cao 25 cm, làm plexiglas Phần giao cánh tay hình vng (5 cm x cm) Cánh tay mở có gờ cao 0,25 cm bao quanh để ngăn chuột rơi xuống đất Bộ cánh tay đặt cao nhà 73 cm, cường độ chiếu sáng cánh tay mở 20 lux Chuột thử nghiệm cho uống 60 phút trước thử nghiệm Tất chuột đặt vùng trung tâm, hướng phía cánh tay mở, sau chuột tự di chuyển khám phá phút, ghi nhận số lần vào thời gian lưu lại vùng cánh tay (đóng và/hoặc mở) chuột Chuột tính lần vào cánh tay mở chân chuột bước qua vạch phân cách vùng trung tâm cánh tay mở Mơ hình ngăn sáng - tối (Light - dark test) Bộ dụng cụ gồm hộp làm plexiglas, có ngăn, ngăn có kích thước 40 x 20 cm Trong ngăn chiếu sáng với cường độ 400 lux, gọi ngăn sáng Ngăn lại sơn đen để giữ tối với cường độ ánh sáng không lux, gọi ngăn tối Hai ngăn thơng với cửa có kích thước x cm Chuột thử nghiệm cho uống 60 phút trước tiến hành thử nghiệm Chuột đặt cửa ngăn cách vùng sáng, tối, hướng ngăn sáng Sau chuột tự khám phá phút, ghi lại camera gắn bên Ghi nhận lại số lần vùng sáng chuột thời gian vùng sáng Chuột tính vùng sáng chân vượt qua lằn phân cách vùng Xử lý số liệu thực nghiệm Các liệu biểu thị dạng Mean±SEM Qua phân tích số liệu phép kiểm Kolmogorov-Smirnov cho thấy có phân bố khơng bình thường số dãy số liệu Do việc xử lý thống kê sử dụng phần mềm SPSS phiên 16, sử dụng phép kiểm Kruskal-Wallis, dùng phép kiểm Mann-Whitney-U test để so sánh khác biệt lô Sự khác xem có ý nghĩa giá trị p