Đang tải... (xem toàn văn)
Nhóm Pencillium được phân loại lại vào năm 1996 dựa vào sự khác nhau của dãy DNA ribosom và đặc tính chuyển hoá thứ cấp. Trước đây được chia thành hai loại khác nhau – một là được dùng cho phomat ( Penicillium roqueforti var. roqueforti) và một là tạo patulin.
ĐỀ TÀI PENICCILIUM ROQUEFOTI GVHD: K.S. PHẠM MINH NHỰT NHÓM 7 TRẦN THUỴ KIM BÌNH TRƯƠNG THỊ TRÚC HÀ PHẠM NGÔ ÁNH THƯ HUỲNH THỊ DIỆU HIỀN MỤC LỤC Lời nói đầu Phần I Tổng Quan Về Penicillium Roqueforti I. Lịch sử phát hiện .4 II. Phân loại khoa học 4 III. Đặc điểm nhận dạng 6 IV. Đặc điểm sinh hoá .9 Phần II Các Phương Pháp Xác Định I. Phương pháp truyền thống .8 II. Các phương pháp hiện đại 1. Phương pháp PCR .22 2. Phương pháp RAPD .25 Phần III: Kết Luận 2 LỜI NÓI ĐẦU Trong những năm gần đây với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, quá trình định danh cho nhiều loài vi sinh vật cũng như dễ dàng hơn với thiết bị hiện đại hơn. Nhiểu loại vi sinh có lợi, hại đều được biết đến rõ ràng hơn. Trong những năm vi sinh học phát triển một loài sinh độc tố nhưng có ít trong đó có loại nấm mốc Peniccilium roqueforti được xác định từ trong sản phẩm phomat xanh vốn quen thuộc với dân châu Âu. Penicilium roqueforti được các nhà khoa học tìm hướng đi mới ngoài việc sử dụng để sản xuất phomat xanh. 3 PHẦN I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN Đầu tiên được mô tả bởi Thom vào năm 1906, Penicillium roqueforti thoạt đầu là một loài hỗn tạp của nấm xanh sinh bào tử. Chúng được chia thành các nhóm loài khác nhau dựa trên sự khác biệt về kiểu hình, và sau đó chúng được kết hợp thành một loài bởi Raper và Thom. Nhóm Pencillium được phân loại lại vào năm 1996 dựa vào sự khác nhau của dãy DNA ribosom và đặc tính chuyển hoá thứ cấp. Trước đây được chia thành hai loại khác nhau – một là được dùng cho phomat ( Penicillium roqueforti var. roqueforti) và một là tạo patulin. II. PHÂN LOẠI KHOA HỌC Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Giống: Penicillium Loài: Penicillium roqueforti 4 Charles Thom (1872-1956) Hình ảnh được phóng đại vài trăm triệu lần dưới kính hiển vi điện tử (Penicillium roqueforti var. carneum), Penicillium roqueforti được phân loại thành ba loài là Pencillium roqueforti, Penicillium carneum và Penicillium paneum. III. ĐẶC ĐIỂM 1. Đặc điểm hình thái 5 Hình ảnh Penicilium roqueforti Penicilium roqueforti là loại mốc có màu xanh, có cuốn đính bào từ, sinh bào tử, sinh sản hữu tính, hình sợi, thuộc ngành nấm nang. 6 Qúa trình hợp giao tử (A – F) ; Toàn giao (Hologamy)(G – J); Tiếp xúc giữa 2 giao tử (K– L); Tự giao (autogamy)(M – N: sinh sản ở nấm mốc. 2. Đặcđiểm bào tử Bào tử của nấm mốc Penicilium roqueforti : hình cầu gần như hình tròn, bề mặt tròn nhẵn(kích thước 3,5- 5,5 µm), không có màng tế bào. Cuống dài 100-200 x 4-5,5,…. Khuẩn lạc Penicilium roqueforti 7 Bào tử Penicilium roqueforti 3. Môi trường sống Đặc điểm trên môi tổng hợp: Penicillium roqueforti chỉ là một loài của Penicillium mà nó có thể phát triển trên môi trường chứa 0-5% acid acetic, ở nồng độ rượu cao, và ở nồng độ oxy thấp (nói rõ trong phần sau). Khuẩn lạc trên môi trường Czapek thạch và MEA 25 o C phát triển rất nhanh chóng, đường kính đạt 4-5 cm, trong vòng 14 ngày, các bào tử có các cuống mọc dày đặc, mượt, Màu xanh xanh, sau đó trở nên tối hơn. Dịch tươi do loài này tiết ra trong như giọt pha lê. Mùi không rõ nét. Sau đó môi trường thay đổi màu sắc từ màu xanh sang xanh đậm. Cuống bào tử đính kích thích 100-200 x 4,0-6,5 μm. Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màu xanh lục, nhẵn-tường, chủ yếu là từ 4-6 mm, có khi đến 8mm. Phân bố trong tự nhiên: Roqueforti Penicillium là một loại nấm hoại sinh phổ biến , nó thì tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và có thể được phân lập từ đất, các chất hữu cơ phân hủy và các bộ phận của cây Ngoài ra, chúng được tìm thấy trong ẩm ướt, hầm tối, đến 8 Hình ảnh P.roqueforti vườn đất và tán lá, mà còn trong phòng tắm, nước, đường ống, con dấu cao su, ngưỡng cửa sổ, thảm, nệm và đồ nội thất… 4. Tốc độ phát triển Tốc độ phát triển nhanh trên các môi trường và đạt kích thước sau: CYA: 34- 55mm, MEA: 35-56 mm, YES: 47-74 mm. Khuẩn lạc của Penicilium roqueforti phát triển rất tốt trên môi trường acid acetic : 0,5%, và cũng phát triển tốt trên CREA thích hợp trên môi trường acid. IV. ĐẶC TÍNH SINH HOÁ 1. Sinh hợp chất thứ cấp 1.1. Penicilium roqueforti là loài sinh ra hợp chất thứ cấp marcfortines và fumigaclvine A. Những tư liệu về những hợp chất này tạm thời chưa được rộng nên khó khăn trong việc lấy nó làm tư liệu. 9 Marcfortines từ Penicilium roqueforti 1.2. Độc tố PR và eremofortin C Là chất chuyển hóa thông thường của Penicilium roqueforti. Các cấu trúc hóa học của hai hợp chất liên quan chặt chẽ với nhau và khác nhau chỉ bởi một aldehyde và một nhóm acohol tại vị trí C-12 . Định tính, định lượng độc tính enzyme: Các hoạt động tối đa các enzym trong các môi trường đã được tìm thấy vừa xảy ra vào ngày 13 tính từ khi bắt đầu thí nghiệm, trong đó tương ứng cực đại của PR trong vật chứa độc tố. Enzyme này được phân lập và tinh chế từ các môi trường và vừa khuẩn ty thể của nấm tương ứng thông qua một thao tác liên quan đến amoni sulfat và fractionation DEAE-cellulose sắc ký. Sản lượng đã được 33,3 và 21,6% cho các enzym có hoạt tính trung. Độ pH tối ưu cho enzym khi pH 5,6. Khi nó xúc tác sự chuyển đổi ở 30 ° C và phân rã với thời gian phản ứng khi ở nhiệt độ cao. Ở 100 ° C, hoạt động của enzyme đã hoàn toàn bị mất. Các K. và Vmax của các enzym như được xác định ở 30 ° C là 0,02 mM và 4.0, umol / phút mỗi mg, tương ứng. Trọng lượng phân tử của enzyme đã được ước tính bằng cách lọc ,áp suất sắc ký lỏng thu được là I-250 protein đến 40.000. Độc tố PR và eremofortin C (EC) là chất chuyển hóa thứ cấp của nấm Penicillium roqueforti, những độc tố này gây nguy hiểm cho những người sử dụng sản phẩm phomat bị nhiễm penicilium roqueforti. Hình: phân tích chất độc bằng phương pháp HPLC . sự hoạt động của độc tính trong Penicilium roqueforti. 10 [...]...Kể từ khi phát hiện và cô lập PR độc tố , nó làm sáng tỏ đ ộc tố nấm mốc con đường tổng hợp sinh học của các độc tố khác có liên quan và chuyển hóa qua lại lẫn nhau Cấu trúc của PR : 11 Công thức một số loại chất độc do Penicilium roqueforti sinh tổng hợp 2 Oxy hoá các acib béo Khả năng của nấm để ôxi hóa của các axit béo chuỗi trung bình được thu Ketones methyl lần đầu tiên... chloramphenicol(1ml/100ml môi trường), Glycerol 220g Tiến hành định danh cho loài nấm mốc Penicilium roqueforti bằng môi trường CYA,YES II XÁC ĐỊNH P.ROQUEFORTI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI 1 Xác định bào tử Penicilium roqueforti bằng phương pháp PCR Phương pháp lấy mẫu không khí tích hợp và phân tích DNA để phát hiện các bào tử nấm Penicilium roqueforti Tóm tắt: Bào tử P.roqueforti được thu thập trực... định danh Penicilium roqueforti cần môi trường CYA(môi trường thạch Czapek Yeast Autolysate) , YES Khuẩn lạc phát triển trên môi trường CYA: làm môi trường chuyển từ màu vàng kem sang màu nâu nhạt Khuẩn lạc có màu xanh nhạt.Trên môi trường YES: khuẩn lạc làm môi trường từ vàng nhạt sang màu nâu Khuẩn lạc có màu xanh lục Penicilium roqueforti trên CYA 2 Penicilium. .. xuất Exo-polygalacturonase (Exo-p): Dựa trên môi trường kem dầu bí ngô (PuOC ) kết hợp bổ sung lúa mì, cám (WB), và vi nấm mốc Penicilium roqueforti, nhằm thực hiện quá trình lên men bề mặt bán rắn SSF 14 Hình trên cho thấy : Khả năng tổng hợp của Penicilium roqueforti sản sinh Exo- P, trên môi trường PuoC Exo-P tăng từ đầu quá trình và đạt những giá trị tối đa là 1452U/g.d.w... các bào tử bất hoạt vào không được nhỏ hơn 1000 Sau đó bằng cách phá vỡ các bào tử, có hoặc không có tinh chế DNA, Penicilium roqueforti đã có thể phát hiện DNA từ một bào tử duy nhất P roqueforti bào tử được thêm vào từ không khí các mẫu nồng độ cao của các bào tử nấm không rõ nguồn gốc: phấn hoa, bụi đã làm giảm độ nhạy phát điện Tuy nhiên, bằng cách sử dụng DNA tinh khiết, nó đã... quả: Trình tự phân tích Penicilium chủng Các khu vực 600 bp giữa 18S và 28S gen trong đó có 5-8s gen đã được khuếch đại 28 Hình trên thực hiện phản ứng RAPD phân tích 10 chủng P roqueforti (1-10) 5 của P carneum(11-15) và 5 của P panium (16-20) Sử dụng mồi NS2(a) NS7(b) thứ tự các chủng như sau: 29 30 PHẦN III: KẾT LUẬN Trong các kết luận gần đây về Penicilium roqueforti có... ôxi hóa của các axit béo chuỗi trung bình được thu Ketones methyl lần đầu tiên được ghi nhận, người đã cho thấy Penicillium roqueforti và hai loài của chi Aspergillus sản xuất Ketones methyl khi nuôi vi nấm trong vài tuần trong môi trường acid béo Năng lực của các bào tử của P roqueforti để tạo Ketones methyl nhanh chóng biến mất dần dần khi bào tử nảy mầm.Tỷ lệ sự hình thành của 1-2-heptan trong những... Roquefort Roquefort là sản phẩm lên men từ sữa cừu hoà với nước nóng ở 32 o C , sản phẩm đông tụ nhờ các enzyme protease( trong đó một là pepsin), giai đoạn này người ta bổ sung vi nấm Penicilium roqueforti Phô mai này sau đó tăng trưởng và phát triển ở nhiệt độ thích hợp là 8 oC, với điều kiện nhiệt độ Roquefort sinh trưởng thoát hơi CO2 trong quá trình lên men Sản... hiện khai thác phenol-chloroform và lượng isopropanol Chúng tôi đổi cách thực hiện bằng cách thêm 20 ng của glycogen ở bước thêm isopropanol trong quá trình ly tâm DNA cũng được chiết xuất từ sợi nấm của P roqueforti Phát hiện của P roqueforti DNA by PCR roqueforti DNA bằng PCR: Đoạn mồi: người ta sử dụng 2 loại đoạn mồi một là ITS4 ( 5’TCCTCCGCTTAGATATGC) và ITS5 ( 5’AGTAAAAGTCGTAACAAGG)... Platinum Taq, đệm (20 mM Tris HCl [pH 8,4], 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2 ), 0,2 mM triphosphates deoxyribonucleoside, và DNA dung dịch pha loãng của bào tử P roqueforti và 5-50 ng mycelium hoặc bào tử của nấm khác Điều kiện chu kì bào tử được 95 ° C trong 10 phút và nhiệt độ 94 ° C trong 30 s, 42 ° C trong 2 phút, và 72 ° C trong 2 phút Kết hợp PCR và Southern blotting: đó là phương pháp kết . động của độc tính trong Penicilium roqueforti. 10 Kể từ khi phát hiện và cô lập PR độc tố , nó làm sáng tỏ độc tố nấm mốc con đường tổng hợp sinh. màng tế bào. Cuống dài 100-200 x 4-5,5,…. Khuẩn lạc Penicilium roqueforti 7 Bào tử Penicilium roqueforti 3. Môi trường sống Đặc điểm