Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Tên đề tài: Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân nhằm nâng cao hàm lượng Artemisinin ở cây thanh hao hoa vàng bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 Năm bảo vệ : 2010 Học viên : Lê Trung Kiên Cán bộ hướng dẫn: PGS. TS Lê Huy Hàm Ths. Đào Thanh Bằng Hà Nội – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Tên đề tài: Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân nhằm nâng cao hàm lượng Artemisinin ở cây thanh hao hoa vàng bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 Năm bảo vệ : 2010 Học viên : Lê Trung Kiên Cán bộ hướng dẫn: PGS. TS Lê Huy Hàm Ths. Đào Thanh Bằng Hà Nội, 12/2010 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 I. NGUỒN GỐC, PHÂN BỐ VÀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC 3 1.1. Nguồn gốc, phân bố 3 1.2. Đặc điểm thực vật học. 4 1.2.1. Rễ cây Thanh hao 4 1.2.2. Thân cây Thanh hao 4 1.2.3. Lá cây Thanh hao 5 1.2.4. Hoa cây Thanh hao 5 1.2.5. Hạt cây Thanh hao 6 II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY THANH HAO 7 2.1. Nghiên cứu về kỹ thuật trồng Thanh hao 7 2.2. Nghiên cứu chọn giống Thanh hao 9 2.3. Nghiên cứu hàm lƣợng Artemisinin và động thái tích luỹ Artemisinin trong cây Thanh hao 11 III. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HẠT NHÂN TRONG CHỌN TẠO GIỐNG 13 3.1. Khái niệm đột biến và chọn giống đột biến. 13 3.2. Tình hình nghiên cứu chọn giống đột biến trên thế giới. 14 3.3. Tình hình nghiên cứu chọn giống đột biến trong nƣớc. 16 3.4. Phƣơng hƣớng của chọn giống đột biến trong thời gian tới 19 3.4.1. Tìm kiếm, gây tạo và xây dựng chiến lƣợc sử dụng các đột biến 19 Kết hợp nghiên cứu đột biến với nghiên cứu sinh học phân tử 20 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn IV. CƠ SỞ KHOA HỌC ĐỂ XÁC ĐỊNH LIỀU BỨC XẠ CHO VIỆC CHIẾU XẠ CÂY THANH HAO. 21 4.1. Chiếu xạ hạt khô 21 4.2. Chiếu xạ callus 22 PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23 1.1. Chiếu xạ hạt: 23 1.2. Chiếu xạ callus: 23 II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23 III. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 24 3.2. Chỉ tiêu theo dõi 24 PHẦN III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 I. THẾ HỆ M1 (2006): 26 1.1. Chiếu xạ hạt 26 1.1.2. Kết quả theo dõi thời gian nẩy mầm của hạt sau chiếu xạ. 26 1.1.3. Khả năng sinh trƣởng của giống Thanh hao hoa vàng thế hệ M1 28 1.2. Chiếu xạ callus 32 1.2.1. Tạo vật liệu sạch cho nuôi cấy in-vitro cây thanh hao hoa vàng 32 1.2.2. Xác định môi trƣờng thích hợp để tạo callus ở cây thanh hao hoa vàng 33 1.2.3. Chiếu xạ callus thanh hao 35 II. THẾ HỆ M2 (2007) 37 2.1. Cây chiếu xạ từ hạt 37 2.1.1. Thời gian nẩy mầm của hạt sau chiếu xạ 37 2.1.2. Khả năng sinh trƣởng của giống Thanh hao hoa vàng thế hệ M2 39 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2. Cây chiếu xạ callus (ở các liều 0; 3 và 5 kr) 42 2.3. Phân tích hàm lƣợng Artemisinin ở cây thế hệ M2 43 III. THẾ HỆ M3 (2008) 45 3.1. Tình hình sinh trƣởng của cây Thanh hao thế hệ M3 45 3.2. Phân tích hàm lƣợng Artemisinin 46 IV. Thế hệ M4 (2009) 50 4.1. Kết quả đánh giá tỷ lệ nẩy mầm của các dòng triển vọng. 50 4.2. Thời gian nảy mầm, tuổi cây con, thời gian từ trồng đến bén rễ hồi xanh 51 4.3. Đánh giá khả năng sinh trƣởng của các dòng triển vọng thế hệ M4 52 4.4. Phân tích hàm lƣợng Artemisinin 53 4.5. Đánh giá năng suất của các dòng có triển vọng 56 V. Thế hệ M5 (2010) 57 5.1. Xây dựng quy trình thâm canh cho dòng thanh hao triển vọng 57 5.1.1. Mục tiêu nghiên cứu 57 5.1.2. Vật liệu nghiên cứu 57 5.1.3. Nội dung nghiên cứu. 57 5.1.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 58 5.2. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 58 5.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng thời vụ tới năng suất sinh vật học của một số dòng thanh hao triển vọng. 58 5.2.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của mật độ tới năng suất và hàm lƣợng của các dòng thanh hao triển vọng. 60 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 I. KẾT LUẬN 64 II. ĐỀ NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHAO MUC LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lª Trung Kiªn Khãa 11 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU Trên phạm vi toàn cầu, những năm gần đây bệnh sốt rét lại phát triển trở lại, hàng năm giết chết gần 2 triệu người và gần 270 triệu người khác mắc bệnh. Nguyên nhân là do các chủng ký sinh trùng gây bệnh đã dần trở nên kháng các loại thuốc trước đây. Theo thông báo của WHO sau một thời gian dài sử dụng các thuốc điều trị bệnh sốt rét như Quinin, Chloroquin, Mefloquin,…đến nay ký sinh trùng sốt rét đã kháng hầu hết các loại thuốc trên. Có 15 nước Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương (Trong đó có Việt Nam), 10 nước Nam Mỹ, 15 nước Châu Phi và Nam Sahara bệnh sốt rét phát triển mạnh nhất. Năm 1979 các nhà khoa học Trung Quốc đã tìm ra hoạt chất Quing-hao-su (Artemisinin) từ cây Qing-hao (Thanh hao) có khả năng điều trị bệnh sốt rét (Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 2004). Cây hoa thanh hao hoa vàng có tên khoa học là Artemisia annua L., cây sống lâu năm, mọc hoang dại thành từng đám ở vùng đồi núi, ven sông suối. Năm 1990 nước ta đã chiết xuất từ lá thanh hao chất Artemisinin trên quy mô công nghiệp. Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cây thanh hao đang được phát triển mạnh. Song vấn đề đặt ra cần phải giải quyết là thời gian chiếm dụng đất của nó quá dài so với cây trồng nông nghiệp khác, giống thanh hao trồng chủ yếu là các giống tự nhiên có hàm lượng Artemisinin thấp. Do vậy, việc chọn tạo, cải tiến giống thanh hao có hàm lượng hoạt chất Artemisinin cao nhằm giảm diện tích đất trồng nhưng vẫn cung cấp đủ lượng Artemisinin tự nhiên cần thiết cho ngành Dược là nhiệm vụ cần phải giải quyết của các nhà chọn tạo giống cây trồng. Gây đột biến là phương pháp hữu hiệu để tạo vật liệu khởi đầu đa dạng và hữu ích cho chọn giống trong nông nghiệp. Tính đến tới tháng 7 - 2006 đã có 2428 giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến thực nghiệm. Tuy nhiên cho đến nay, vẫn chưa có một công bố nào về cải tiến giống cây dược liệu bằng phương pháp gây đột biến. Lª Trung Kiªn Khãa 11 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 Viện Di truyền nông nghiệp là một viện nghiên cứu chuyên sâu trong lĩnh vực di truyền, chọn giống và công nghệ sinh học thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Viện cũng là cơ quan đầu mối quan trọng nhất ở nước ta trong việc ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tiến giống cây trồng nông nghiệp. Với sự phối hợp giữa Công ty Dược liệu Mediplantex và viện Di truyền nông nghiệp, xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Chọn tạo giống cây Thanh hao hoa vàng có hàm lượng Artemisinin cao bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến” Mục đích của đề tài: Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân nhằm nâng cao hàm lượng Artemisinin ở cây thanh hao hoa vàng bằng chiếu xạ hạt và chiếu xạ callus. Để thực hiện đƣợc mục tiêu trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện các nội dung sau: Chiếu xạ hạt, liều 10 Kr Chiếu xạ callus liều 3Kr Quần thể M3: chọn các cá thể M3-1, M3-2, M3-3……. Có hàm lƣợng artemisinin cao Quần thể M4: chọn các cá thể M4-1, M4-2, M4-3…… có hàm lƣợng artemisinin cao và đặc tính nông học tốt Thế hệ M5: dòng triển vọng phát triển từ cá thể M4-9, M4-28 2006 2007 2008 2009 2010 Quần thể M2 Thế hệ M1 Thí nghiệm mật độ, thời vụ, phân bón Khảo nghiệm sinh thái Giống gốc Lª Trung Kiªn Khãa 11 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. NGUỒN GỐC, PHÂN BỐ VÀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC 1.1. Nguồn gốc, phân bố Thanh hao hoa vàng là cây bản địa của các vùng Đông và Bắc Mỹ (Ontario, New Hampshire, Virginia, Tenneesse, Kankas và Arkans). Từ miền trung đến tận miền nam Châu Âu (Anbanni, Bungari, Tiệp Khắc, Pháp, Đức, Rumani và Liên Xô cũ) và gần như trên toàn bộ lãnh thổ châu Á (Apganistan, Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Triều Tiên, Mông Cổ và Xiberia) (Hiroshi Kawamoto và cộng sự, 1999)[19]. Nhưng thanh hao mọc tập trung và nhiều nhất là ở Trung Quốc, Trung Á và Việt Nam (Phạm Mạnh Kiên, Đinh Huỳnh Kiệt, 1995)[22]. Ở Việt Nam, cây thanh hao chính thức được nhà thực vật học người Pháp phát hiện và mô tả năm 1922, ngoài tên khoa học là Artemisia annua L., thanh hao hoa vàng còn có các tên khác như thanh hao, ngải hoa vàng, bù hao, hoàng hoa cao, …Thanh hao được phân bố ở nước ta gồm các tỉnh: Lạng Sơn (10 huyện), Cao Bằng (7 huyện), Bắc Giang (3 huyện), Quảng Ninh (3 huyện), Bắc Cạn (2 huyện) và Hải Dương (1 huyện). (Nguyễn Thượng Đông, 1995)[3]. Hình 1: Sự phân bố của cây thanh hao trên thế giới Lª Trung Kiªn Khãa 11 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 1.2. Đặc điểm thực vật học. 1.2.1. Rễ cây Thanh hao Rễ thanh hao thuộc loại rễ cọc, rễ chính to và dài hơn các rễ phụ khác nhưng phát triển không cân đối với phần trên mặt đất. Giai đoạn từ mọc mầm đến trước khi cây phân nhánh rễ thanh hao hầu như chỉ có một rễ chính. Khi rễ chính kéo dài được khoảng 10 - 15 cm thì rễ bên phát triển. Trung bình mỗi cây thanh hao có từ 150 - 170 rễ. Rễ thanh hao phân bố tập trung ở tầng đất từ 30 - 40 cm, rất ít ra rễ sâu tới 50cm. Do vậy thanh hao chịu hạn kém, dễ bị nghiêng, đổ khi gặp gió bão (Nguyễn Văn Thuận, 2001)[1]. 1.2.2. Thân cây Thanh hao Thanh hao là cây thân thảo, hoá gỗ. Thời gian sinh trưởng từ khi hạt nảy mầm đến khi cây bắt đầu ra nụ là cây thân thảo. Thời gian phát triển từ lúc cây hình thành nụ, nở hoa, thụ phấn, đậu hạt cho đến lúc hạt chín là cây thân gỗ. Cây cao trung bình từ 1,5 đến 3,0 m. Cây gồm 1 thân chính và rất nhiều cành cấp I, cấp II, cấp III. Thân cây có hình trụ nhưng phần vỏ cây lại có nhiều đường gờ và rãnh chạy dọc thân nên nhìn bề ngoài cây có hình đa giác. Lớp vỏ ngoài của thân cây ở thời kỳ sinh trưởng có độ dày chiếm khoảng 25% - 35% đường kính thân cây. Khi cây chuyển sang thời kỳ phát triển, lớp vỏ mỏng dần và cuối cùng chỉ còn là lớp vỏ rất mỏng bọc bên ngoài thân cây, lớp vỏ này có thể tạo thành sợi xơ, khá bền chắc. Theo sự mỏng dần, xơ hoá của lớp vỏ, phần gỗ của lõi cây càng to dần và hoá gỗ cứng chắc. Đến cuối thời kỳ phát triển cây thanh hao đã trở thành hoá gỗ hoàn toàn. Thông thường mỗi cây có từ 20 - 120 cành cấp I, 240 - 250 cành cấp II. Cành phân bố đều ra bốn phía. Trên thân chính, cành cấp I, cành cấp II và cấp III đều mang lá. Thân cây Thanh hao thường có màu xanh, tím nhạt đến tím thẫm. Tỷ lệ cây màu xanh thường chiếm trên 80% quần thể. Dạng thân màu tím thường có thời gian sinh trưởng ngắn hơn, năng suất lá xanh thấp hơn còn hàm lượng Artemisinin là tương đương. Khả năng chống chịu sâu bệnh, đổ lốp thì cây thân tím hơn hẳn cây thân xanh (Nguyễn Văn Thuận, 2001)[1]. [...]... giống thanh hao Theo các tài liệu nghiên cứu cho thấy: Thanh hao là cây dễ trồng cho năng suất sinh học cao (35tấn/ha), có độ biến động lớn về hàm lượng Artemisinin trong các tập đoàn giống thanh hao đã thu được, trung bình của quần thể thanh hao về hàm lượng Artemisinin là 0,39% Một chương trình nghiên cứu nhằm nâng cao hàm lượng Artemisinin trong cây thanh hao, nhất thiết phải được tiến hành bằng. .. trưởng; 24/2 - cây bắt đầu ra hoa; 14/3 - thời kỳ cây đã có 50% ra hoa và 24/3 lúc cây có hoa 100% Kết quả cho thấy hàm lượng Artemisinin trong lá thanh hao cao nhất vào thời điểm cây có 50% hoa, thậm chí cao gấp 4 - 5 lần so với thời kỳ cây còn trong giai đoạn sinh trưởng (trích theo Nguyễn Văn Thuận, 2001) [1] Hàm lượng Artemisinin trong lá thanh hao trồng và mọc hoang ở các tỉnh phía Bắc có hàm lượng. .. tăng dần theo liều lượng chiếu xạ Ở công thức 7 krad trở lên số cây và tỷ lệ cây xuất hiện khảm có sự sai khác so với đối chứng ở mức xác suất 95% Khả năng sinh trưởng của cây thanh hao hoa vàng thế hệ M1 biểu hiện ở động thái tăng trưởng thân, cành Kết quả nghiên cứu cho thấy cây thanh hao hoa vàng sau chiếu xạ hạt ở thể hệ M1 phát triển bình thường Số cành cấp I, cấp II và Số hóa bởi Trung tâm Học... nền đất có hàm lượng các nguyên tố vi lượng (Fe, Mn, Cu, Zn, và B) thấp với thanh hao trồng trên đất có hàm lượng các nguyên tố vi lượng này cao cho thấy: chiều cao cây, khối lượng tươi, hàm lượng Artemisinin của thanh hao trên đất có hàm lượng các nguyên tố vi lượng cao đều cao hơn so với trồng ở đất có hàm lượng các nguyên tố vi lượng thấp (trích theo J Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái... 20/7 hàm lượng Artemisinin trong lá của các dòng thanh hao đều thấp hơn khi phân tích hàm lượng Artemisinin vào 20/8 - 30/8 và cao nhất là vào 14/9 (trước khi cây có nụ) (Nguyễn Văn Hoan, 2008) [7] III TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HẠT NHÂN TRONG CHỌN TẠO GIỐNG 3.1 Khái niệm đột biến và chọn giống đột biến Đột biến là sự thay đổi trong gen hoặc trong nhiễm sắc thể, thể đột biến. .. xạ được sử dụng là 1, 4, 7, 10, 15kr và đối chứng không chiếu xạ mỗi liều 2 gr hạt Hạt được gieo ngay sau khi chiếu, tỷ lệ nảy mầm và sức sinh trưởng của cây con tỷ lệ nghịch với liều chiếu xạ 1.1.2 Kết quả theo dõi thời gian nẩy mầm của hạt sau chiếu xạ Trong quá trình nghiên cứu, chọn tạo, cải tiến giống bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến, việc theo dõi tỷ lệ nảy mầm của hạt sau chiếu xạ có vai... tuần các cây được chiếu sáng với thời gian 8h, 10h, 12h/ngày đều ra hoa còn những cây chiếu sáng 16h, 20h, 24h thì không ra hoa Cây ra hoa nếu độ dài ngày nhỏ hơn 13h30 phút (trích theo J F S Ferreira et al., 2005)[12] Ở Việt Nam thanh hao bắt đầu nở vào tháng 10 Hoa có màu vàng đến vàng nhạt, mỗi cây có rất nhiều hoa, một cây Thanh hao cao trung bình 2,5m có thể có khoảng 300.000 hoa Các hoa ở các cành... lancea Hàm lượng Artemisinin trong Artemisinin apiacea chỉ ở mức 0,08% nhưng trong Artemisinin annua thì hàm lượng Artemisinin lại cao hơn Hàm lượng Artemisinin trong lá khô thanh hao mọc ở Virgina, Maryland và Columbia là 0,06% Thanh hao ở Trung Quốc có từ 0,01 - 0,7% Artemisinin, đặc biệt tại tỉnh Szechwan tỷ lệ ấy là 0,53 - 0,59% và ở Sharman là 0,79% (trích theo Nguyễn Văn Thuận, 2001)[1] Cây thanh hao. .. nhiều ở các công thức thí nghiệm Hoa của cây thanh hao thế hệ M1 cũng không thấy có sự sai khác so với giống ban đầu Hình 5: Các dạng thể khảm của thanh hao sau chiếu xạ ở các liều 7 và 10kr Ở thế hệ M1, ảnh hưởng của chiếu xạ tới cây trồng chỉ là giảm sinh trưỏng, phát triển của cây, gây chết và xuất hiện thể khảm Ảnh hưởng của các liều chiếu xạ khác nhau đến sinh trưởng và phát triển của cây thanh hao. .. hoạt chất trong cây vào các giai đoạn cây thanh hao chuẩn bị kết thúc thời kỳ sinh trưởng trước lúc ra hoa trên ruộng thí nghiệm trồng cây thanh hao (trích theo Nguyễn Văn Thuận, 2001)[1] Một phương pháp vi nhân giống thanh hao bằng sử dụng công nghệ nuôi cấy mô để tạo ra các dòng vô tính từ các cây thanh hao trồng ở đồng ruộng Quan sát quần thể thanh hao mọc ngoài đồng, chọn những cây có các dòng . giống cây Thanh hao hoa vàng có hàm lượng Artemisinin cao bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến Mục đích của đề tài: Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân nhằm nâng cao hàm lượng Artemisinin ở cây thanh. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Tên đề tài: Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân nhằm nâng cao hàm lượng Artemisinin ở cây thanh hao hoa vàng bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến Chuyên. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Tên đề tài: Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân nhằm nâng cao hàm lượng Artemisinin ở cây thanh hao hoa vàng bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến Chuyên