Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn – Phần 2 Phân tích thành phần acid béo 1. 5mg tế bào khô + dung dịch kiềm (R1) 1ml, vortex 5- 10 sec, giữ ở 100 o C trong 5min, vortex 5-10 sec, giữ tiếp ở 100 o C trong 25min, để nguội xuống nhiệt độ phòng, có thể đặt trực tiếp dưới vòi nước sau khi hạ xuống 80 o C 2. Thêm dung dịch methyl hóa (R2): 2ml, giữ ở 80 o C trong 10min, để nguội xuống nhiệt độ phòng. Quá trình này thấy xuất hiện khói trắng 3. Thêm dung dịch tách (R3) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong10min, loại bỏ lớp dưới (lớp nước) 4. Thêm dịch rửa (R4) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong 5 min, ly tâm 2000rpm trong 3min, chuyển 2/3 lớp trên (lớp dung môi) sang ống đựng mẫu (mẫu thường không màu) 5. Nếu lớp phía trên chưa trong, thêm 1-3 giọt dung dịch R5, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong 5min, ly tâm lại lần nữa. Chú ý: Các bước cần thực hiện liên tục, trước khi tiến hành cần chuẩn bị heatblock 100 and 80 o C. R1: NaOH 15g, Methanol (HPLC grade) 50 mg, MQ 50ml R2: 6N HCl 65ml, Methanol (HPLC grade) 55ml, pH 1.5 R3: n-hexane (HPLC grade or n-hexane 1000) 50ml, methyl-ter-butyl ethel (HPLC grade) 50ml R4: NaOH 10.8g, MQ 900ml R5: 100ml MQ + 40g NaCl 6. Mẫu được phân tích bằng sắc ký khí (hệ thống MIDI) Phân tích thành phần phospholipid 1. 100mg tế bào khô + dung dịch chlorofolm: methanol: 0,3% NaCl (50:100:40) = 2ml: 4ml:1,6ml . Trộn bằng khuấy từ trong 4 giờ. Chuyển sang ống ống falcon, ly tâm 3000 rpm trong 5 phút. 2. Lấy dịch trên. Thêm 1,75ml NaCl 0.3% và 1,75ml chloroform. Lắc đều, ly tâm 5000 rpm trong 5 phút. Loại lớp trên cùng và lớp giữa. 3. Làm khô bằng Nitơ lỏng. Nếu ngừng công việc, giữ ở -20 o C. 4. Hòa tan bằng 100 µl ethanol. 5. Chấm mẫu lên 4 bản HP-TLC (high performance) 6. Dung môi chạy TLC chiều 1: Chloroform: Methanol: Water = 65:25:4 Dung môi chạy TLC chiều 2: Trước khi chạy chiều 2, chấm Standard Chloroform: Acetic acid: Methanol: Water = 80:18:12:5 7. Nhận biết các loại phospholipid: Bản 1: Nhận biết các glycolipit: Chuẩn bị thuốc thử anisaldehyde: Acetic acid 1ml p-anisaldehyde 5ml H 2 SO 4 5ml Ethanol 90ml Phun thuốc thử, giữ ở 110 o C trong 15 phút Các phospholipid chứa đường như GlcNU chứa NPG và PIMs, glycolipit sẽ hiện lên dưới dạng các chấm màu vàng xanh. Bản 2: Nhận biết các amino lipit - Phun ninhydrin lên bản TLC. Giữ ở 120 o C trong vài phút. - Các phospholipid chứa nhóm amino được nhận biết dưới dạng các chấm màu tím đỏ như PE, OH-PE, lyso-PE, PME, PS, NPG Nhận biết tất cả phospholipid bằng thuốc thử Dittmer Lester - Chuẩn bị thuốc thử Ditmer Lester: Sol I 25N H 2 SO 4 100mg MoO 3 4,011g Hòa tan bằng cách đun ở 90 o C đến khi dung dịch trở nên trong SolII Iot 50mg Mo 0,178g Đun trong 15 phút, để nguội, lọc Trước khi dùng, trộn Sol I + Sol II (1:1) + 1 V nước rồi pha loãng 3 lần. Màu của dung dịch sẽ chuyển từ vàng sang xanh - Phun thuốc thử lên bản TLC, tất cả các phospholipid sẽ hiện lên Bản 3: Nhận biết các choline lipit - Thuốc thử Dragendorff: Sol A: Basic bismuth nitrate [Bi(OH) 2 NO 3 ] 1,7g Acetic acid 20ml Water 80ml Sol B: KI 10g Nước 25ml Trước khi dùng, trộn 20ml Sol A và 5ml Sol B vào 70ml nước. - PC và sphingomyelin được nhận biết bằng chấm vàng da cam Bản 4: - Giữ bản TLC trong hộp chứa tinh thể Iot trong 3-5 phút. Các chấm vàng và nâu vàng sẽ xuất hiện. Phản ứng dùng để nhận biết tất cả các loại phospholipid. - Những chấm vàng sẽ dần dần biến mất, có thể sử dụng bản này cho thí nghiệm tiếp theo. Nhận biết các glycolipit chứa nhóm OH - Thuốc thử Periodic acid: 1% natri metaperiodic - Phun thuốc tử periodic acid lên bản TLC. Giữ trong 5-10 phút để nhóm glycol tách khỏi lipit bởi oxi hóa - Phun nước (loại muối periodate) - Đặt bản TLC vào bể chứa acid sulfuric cho đến khi các chấm vàng nhận biết bằng Iot biến mất. - Phun thuốc thử Schiff - PI hiện lên màu vàng, PG hiện lên màu đỏ đến tím, Các lipit chứa đường hiện lên màu xanh Phân tích thành phần G+C trong ADN 1. 25µl ADN (2-25µg), giữ ở 60 o C trong 1 giờ. Giữ ở 100 o C trong 2 phút. Làm lạnh lập tức trong chậu đá, spin down. 2. Mẫu ADN 25µl + đệm acetate (40mM, pH 5,3) chứa 2mM ZnSO 4 25µl + dung dịch nuclease P1 (20U/ml) 25µl. Spin down. Giữ ở 37 o C trong 1 giờ. 3. Glycine buffer (0,1 M, pH 10,4) 25 µl + alkaline phosphatase 2µl (0.35U/µl). Spin down. Giữ ở 37 o C trong 1-2 giờ. Sử dụng làm mẫu chạy HPLC 4. Điều kiện HPLC: - Cột Cosmosil5 C18 - Nhiệt độ 35 o C - Dung môi: 0,2M ammonium phosphat: acetonenitril (40:1) - Tốc độ dòng chảy: 1 ml/min - Bước sóng: 275nm Phương pháp tách ADN xạ khuẩn - Nuôi cấy lắc trong 5 ml môi trường dịch thể YG ở nhiệt độ 28 o C - Lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy, ly tâm với tốc độ 16000g trong 5 phút ở 4 o C, thu sinh khối - Rửa bằng TE - Nghiền mẫu - Thêm 500 µl EDTA 5mM (pH 8,0), trộn đều - Thêm 50 µl lysozym (0,75 mg trong 1 ml Tris-HCl 10mM pH 8,0), trộn, giữ ở 37 o C trong 1 giờ - Thêm 50 µl SDS 20%, 50 µl proteinase K (4 mg trong 1 ml Tris- HCl 50mM pH 7,5), trộn, giữ ở 55 o C trong 30 phút - Thêm 400 µl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4 o C, thu lớp trên. Thực hiện 3 lần. - Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều - Thu ADN bằng đũa thủy tinh - Rửa trong 500 µl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên - Thêm 500 µl TE Nếu sử dụng mẫu ADN để tiến hành thí nghiệm lai ADN, cần làm tiếp các bước sau: - Thêm 50 µl RNase A (1 mg trong 1 ml Tris-HCl 50mM pH 7,5), 0,5 µl RNase T 1 , giữ ở 37 o C trong 20 phút - Thêm 50 µl proteinase K, giữ ở 37 o C trong 1 giờ - Thêm 400 µl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4 o C, thu lớp trên. Thực hiện 3-4 lần. - Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều - Thu ADN bằng đũa thủy tinh - Rửa trong 500 µl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên - Thêm 100-200 µl TE Các số liệu trên được lấy từ sách Bergey’s manual systematic of bacteriology và sách Identification manual of actinomycetes. [...]... Atlas of actinomycetes Asakura Publishing Co Ltd, Japan 2 Miyadoh S (ed.) 20 01 Identification manual of actinomycetes Business Center for Academic Societies Japan 3 Williams S T.,M.E Sharpe , J.G Holt (ed.) 1989 Bergey’s manual of systematic bacteriology Williams & Wilkins, Baltimore, USA Holt J.G, N.R.Krieg, P.H.A.Sneath, J.T.Staley, S.T.Williams .20 00 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (9th . Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn – Phần 2 Phân tích thành phần acid béo 1. 5mg tế bào khô + dung dịch kiềm (R1) 1ml,. màu xanh Phân tích thành phần G+C trong ADN 1. 25 µl ADN (2- 25µg), giữ ở 60 o C trong 1 giờ. Giữ ở 100 o C trong 2 phút. Làm lạnh lập tức trong chậu đá, spin down. 2. Mẫu ADN 25 µl + đệm acetate. (40mM, pH 5,3) chứa 2mM ZnSO 4 25 µl + dung dịch nuclease P1 (20 U/ml) 25 µl. Spin down. Giữ ở 37 o C trong 1 giờ. 3. Glycine buffer (0,1 M, pH 10,4) 25 µl + alkaline phosphatase 2 l (0.35U/µl).