1 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu đồ án, em đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của thầy cô và bạn bè. Nhân đây em xin chân thành cảm ơn: - Quý Thầy Cô Trường Đại học Nha Trang đã giảng dạy chúng em trong những năm học đại học. - Đặc biệt TS Nguyễn Minh Trí và Th.S Nguyễn Thị Thanh Hải đã hướng dẫn em hết sức tận tình và chu đáo. Quý thầy cô trong bộ môn Hóa – Vi sinh đã tạo điều kiện giúp đỡ em về tinh thần cũng như vật chất trong khi làm đề tài. Các bạn trong khoa chế biến đã giúp đỡ, hỗ trợ mình trong quá trình làm. - Gia đình đã động viên, ủng hộ, khích lệ con trong thời gian qua. Nha Trang, tháng 6, năm 2011 Sinh Viên Nguyễn Thị Thảo My 2 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN 1 DANH MỤC CÁC BẢNG 4 DANH MỤC CÁC HÌNH 6 CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ 8 1.1. GIỚI THIỆU 8 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 9 1.3. NỘI DUNG ĐỀ TÀI 9 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 10 2.1. TỔNG QUAN VỀ RAU XÀ LÁCH: 10 2.1.1. Giới thiệu về Họ rau cải 10 2.1.2. Rau xà lách 10 2.2. GIỚI THIỆU VỀ PHÉP THỬ CẢM QUAN CHO ĐIỂM 13 2.2.1 Giới thiệu về phép thử 13 2.2.2 Phương pháp tiến hành 14 2.2.3 Xử lý kết quả 14 2.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Listeria monocytogenes 14 2.3.1. Sơ lượt về vi khuẩn 14 2.3.2. Giới thiệu chung về giống vi khuẩn Listeria spp và loài Listeria monocytogenes 22 2.4. Các phương pháp định lượng Listeria monocytogenes trong thực phẩm. 26 2.4.1. Định nghĩa 26 2.4.2. Các phương pháp định lượng 26 CHƯƠNG III: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 31 3.2.1. Xà Lách 31 3.2.2. Các loại hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 32 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 33 3.3.2. Quy Trình Thực hiện 34 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1. ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN XÀ LÁCH THEO CÁC CÁCH XỬ LÝ 39 4.1.1. Kết quả đánh giá cảm quan về chỉ tiêu màu sắc và trạng thái rau xà lách theo phương pháp cho điểm. 39 4.1.2. Kết luận 41 4.2. TÌNH HÌNH NHIỄM Listeria monocytogenes TRÊN RAU XÀ LÁCH 41 4.2.1. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes tại các vườn rau. 41 4.2.2. Ảnh hưởng của các quá trình xử lý đến mức nhiễm Listeria monocytogenes43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Phụ Lục 1 49 Phụ lục 2 56 Phụ lục 3 62 4 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 2.1 Thành phần hóa học của vi khuẩn gram (+) và gram (-) 16 4.1 Rau xà lách sau 5 ngày bảo quản lạnh (<4 0 C) theo các cách xử lý 39 4.2 Kết quả dánh giá của cảm quan viên về chỉ tiêu màu sắc và trạng thái của rau xà lách theo phương pháp cho điểm 40 4.3 Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở vùng kiểm tra 41 4.4 Liên hệ giữa nước tưới và mức nhiễm L. monocytogenes 42 4.5 Số lượng Listeria monocytogenes trong rau xà lách sau khi đã qua xử lý. 44 4.6 Bảng Mac Crandy 56 4.7 Xây dựng thang điểm chỉ tiêu màu sắc và trạng thái của rau xà lách theo phương pháp cho điểm cảm quan. 57 4.8 Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Vĩnh Hải 57 4.9 Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Phú Sương 1 58 4.10 Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Phú Sương 2 58 4.11 Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Phước Hải 59 4.12 Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes đường Rhamnose tại vườn rau Phú Thạnh 59 4.13 Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Đồng Nai 60 5 4.14 Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Diên Phú 1 60 4.15 Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Diên Phú 2 61 4.16 Kết quả dương tính với tại Listeria monocytogenes vườn rau Diên Phú 3 61 6 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Nội dung Trang 2.1 Xà lách cuộn 10 2.2 Tiên mao và khuẩn mao ở vi khuẩn 20 2.3 Các loại tiên mao ở vi khuẩn 21 2.4 Khuẩn mao ở vi khuẩn E. coli 22 2.5 Vi khuẩn Listeria monocytogenes 23 2.6 Cận cảnh Listeria monocytogenes qua kính hiển vi điện tử 23 2.7 Buồng đếm hồng cầu 27 2.8 Phương pháp cấy trên đĩa từ các ống tăng sinh 28 3.1 Bản đồ mô tả khu vực lấy mẫu 31 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của các phương pháp xử lý đến sự biến đổi bên ngoài của cây rau 33 3.3 Sơ đồ qua quá trình kiểm tra Listeria monocytogenes 33 3.4 Sơ đồ xử lý mẫu và tăng sinh 34 3.5 Sơ đồ định danh Listeria monocytogenes 36 3.6 Esculin dương tính (bên trái)_ Esculin dương tính (bên phải) 36 3.7 Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường Rhamnose_ dương tính (mầu vàng) âm tính (mầu xanh) 37 3.8 Hình ảnh Listeria monocytogenes trên thạch máu cừu 38 3.9 Sơ đồ cách tra bảng Mac Crandy 38 4.1 Biểu dồ biểu diễn tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở các vùng kiểm tra 41 4.2 Máy hấp vô trùng 62 7 4.3 Phòng cấy vi sinh 62 4.4 Tủ sấy 62 4.5 Máy cân điện tử 62 4.6 Đường Rhamnose 62 4.7 Dung dich BPW 62 4.8 Ống canh thang chứa môi trường BLEB 63 4.9 Môi trường thạch OXA 63 4.10 Các ống giứ chủng vi khuẩn Listeria monocytogenes 63 8 CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. GIỚI THIỆU Đã từ lâu thực phẩm là nguồn dinh dưỡng cần thiết cho hoạt động sống của sinh vật cũng như con người nói riêng. Xã hội phát triển, quan niệm ‘ăn no mặc ấm’ không còn phù hợp nữa khi chất lượng cuộc sống đang ngày một được nâng cao đối với đại bộ phận con người ngày nay. Minh chứng cho điều đó là thực phẩm đang tràn ngập trên các thị trường, đa dạng về chủng loại, mẫu mã, hình thức.Vậy khi mua hay ăn thức ăn chúng ta thường quan tâm trước nhất là khẩu vị hay độ an toàn? Theo thói quen và tập quán của người Á Đông và đặc biệt là ở Việt Nam, người tiêu dùng đã quen với việc tới các chợ cóc, chợ tạm để mua thực phẩm tươi sống về sử dụng. Người tiêu dùng nghĩ rằng thực phẩm tươi sống đảm bảo chất dinh dưỡng và ngon miệng hơn so với các sản phẩm đông lạnh, nhưng việc đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho những mặt hàng này thì các cơ quan chức năng không thể đảm bảo 100% tất cả các sản phẩm bày bán tại các chợ đó được kiểm định. Các mặt hàng thực phẩm tươi sống được bày bán tại các chợ tiềm ẩn các nguy cơ gây ra các bệnh dịch. Đối với thực phẩm đông lạnh: Các nước phát triển trên thế giới đa phần sử dụng thực phẩm đông lạnh và là thực phẩm chính trong các bữa ăn hàng ngày bởi nó được đảm bảo vệ sinh tuyệt đối, được cấp chứng nhận về vệ sinh an toàn thực phẩm. Nhưng dù nói gì đi chăng nữa, chúng ta không thể làm lơ trước những vụ ngộ độc nghiêm trọng do thực phẩm gây ra. Thông tin từ Bộ Y tế cho biết, trong năm 2010 toàn quốc đã xảy ra 132 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.676 người mắc, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp tử vong. Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên [5] Vấn đề an toàn thực phẩm đã trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm như do nguyên liệu dùng chế 9 biến hay thực phẩm bị nhiễm dộc tố của vi khuẩn nhưng phần lớn nguồn gốc từ vi sinh vật. Lâu nay, trong vấn đề an toàn thực phẩm, chúng ta chỉ lưu ý đến một số loại vi khuẩn chủ yếu như E.coli, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringgens mà chưa lưu ý đến một số loại khác như Listeria monocytogenes. Trong một đợt dịch gần đây, các chuyên gia dịch tễ học Hoa Kỳ đã thống kê cho thấy tỉ lệ tử vong 35% do nhiễm Listeria monocytogenes ở người lớn không có thai nghén, 11% ở những người dưới 40 tuổi và 63% ở những người trên 60 tuổi [18] Điều đáng nói là ngành y tế nước ta vẫn chưa quan tâm nghiên cứu, tầm soát. Có thể nói chúng ta đã bỏ sót loại vi khuẩn này là tác nhân gây ra nhiều bệnh nguy hiểm, khả năng thực phẩm bị nhiễm Listeria monocytogenes tại Việt Nam không phải là chưa từng xảy ra, mà vấn đề là công tác điều tra dịch tễ, sàng lọc và thống kê tác nhân gây bệnh chưa đạt yêu cầu, cũng như nhận thức của cộng đồng về an toàn vệ sinh thực phẩm chưa đầy đủ. Nguyên nhân không phải là vì chúng ta không biết về những nguy hiểm do Listeria monocytogenes gây ra mà vì với các phương pháp xét nghiệm lâu nay chúng ta áp dụng như soi trên kính, nhuộm v.v chỉ thấy được các nhóm vi khuẩn chung, còn việc tìm cụ thể một vi khuẩn như Listeria monocytogenes thì phải cần nhiều đến kỹ thuật chuyên môn vi sinh. Xuất phát từ thực tế trên, cùng với sự định hướng và giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô, sau gần 3 tháng nghiên cứu đến nay em đã cơ bản hoàn thành đề tài: ”Khảo sát tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong rau xà lách”. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định mức độ nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogene ở rau xà lách và tác dụng của cách rửa thường dùng đến mức nhiễm vi khuẩn này trên rau. 1.3. NỘI DUNG ĐỀ TÀI - Xác định lượng vi khuẩn Listeria monocytogene nhiễm trong rau xà lách khi chưa qua bất kỳ xử lý nào. - Ảnh hưởng của các cách rửa khác nhau: rửa dưới vòi nước chảy, ngâm rửa với dung dịch nước muối 0,85% và ngâm rửa với thuốc tím 10 ppm đến số lượng vi khuẩn Listeria monocytogene có trong xà lách 10 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1. TỔNG QUAN VỀ RAU XÀ LÁCH: 2.1.1. Giới thiệu về Họ rau cải Họ Cải (danh pháp khoa học: Brassicaceae), còn gọi là họ Thập tự (Cruciferae), là một họ thực vật có hoa. Các loại cây trồng trong họ này gần như đều có chứa chữ cải trong tên gọi. Họ này chứa một số loài có tầm quan trọng kinh tế lớn, cung cấp nhiều loại rau về mùa đông trên khắp thế giới. Các loại rau họ cải bao gồm cây bông cải xanh, rau diếp, xà lách, cải bắp, súp lơ và cải xoăn [9]. 2.1.2. Rau xà lách Là loại rau có mặt trong danh sách loại rau được ăn sống nhiều nhất cùng với xà lách xoang, rau muống, cải bẹ xanh, rau đắng, rau tần ô (cải cúc), rau má, rau thơm gia vị (húng, tía tô, húng quế ).[7] Hình 2.1: Xà lách cuộn a. Nguồn gốc Xà lách là loại cây thân thảo, ngắn ngày, dùng để ăn lá có nguồn gốc từ khu vực Địa Trung Hải, được chú ý làm thức ăn cho người cách nay khoảng 4.500 năm. Đến nay, cây rau xà lách được trồng ở khắp nơi trên thế giới. Hiện tại có khoảng 2 loại xà lách khác nhau: xà lách cuốn bắp tròn, xà lách cuốn bắp dài [9] [...]... hải sản, các loại rau ăn sống, thức ăn chế biến sẵn hay để lạnh [3] 2.3.2.4 Đặc điểm gây bệnh Bệnh do nhiễm khuẩn Listeria monocytogenes được gọi chung là bênh Listeriosis là tình trạng nhiễm khuẩn do tiếp xúc hoặc ăn phải các loại thực phẩm bị nhiễm Listeria monocytogenes Loại vi khuẩn Listeria monocytogenes được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an... CỨU Listeria monocytogene nhiễm từ rau xà lách lấy tại các vườn rau thuộc khu vực Phía Bắc thành phố Nha Trang, Phía Nam thành phố Nha Trang và khu vực huyện Diên Khánh 3 1 2 Hình 3.1: Bản đồ mô tả khu vực lấy mẫu (1) Phía Bắc thành phố Nha Trang Ghi chú: (2) Phía Nam thành phố Nha Trang (3) Khu vực huyện Diên Khánh 3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1 Xà Lách Xà lách (5  7 cây) sau khi lấy tại vườn rau. ..11 Với người Việt Nam, xà lách thật sự quen thuộc khi hầu như luôn có mặt trong các bữa ăn hàng ngày Xà lách là rau ăn kèm nhiều loại thực phẩm khác nhau như các món : riêu cua, riêu cá, bánh tôm, nem rán, bún chả, bún riêu, bún ốc Theo thống kê, hiện lượng người tiêu thụ khoảng 200g rau/ người/ ngày [7] b.Thành phần và công dụng của xà lách Cứ 100 gam xà lách sẽ cung cấp khoảng 2,2 gam carbohydrate,... định được mật độ VSV cụ thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml, 100ml … - Nhược điểm: Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn [4] [10] 2.4.2.4 Phương pháp MPN (Most Probable Number) Listeria monocytogenes tồn tại trong thực phẩm không nhiều như vi khuẩn E coli, Salmonella… nên để định lượng chính xác Listeria monocytogenes trong thực phẩm cụ thể là trong rau xà lách thì phương pháp MPN... khoa Utah (Mỹ) cho thấy rau xà lách có thể làm giảm tần suất rủi ro bị ung thư ruột kết ở cả nam lẫn nữ, do trong cải xà lách có chứa một tác nhân kháng ung thư là lutein Do hàm lượng nước cao và các vitamin nên ăn xà lách còn giúp người sử dụng có một làn da tươi mát Ngoài những công dụng trên, ăn xà lách còn hưởng được vô số lợi ích khác như giảm stress, chống lở loét, các bệnh nhiễm trùng đường tiểu... Thiên Nghiên cứu sự hút thu Cu, Pb, Zn và tìm hiểu khả năng sử dụng phân bón để giảm thiểu sự tích lũy chúng trong rau cải xanh và rau xà lách của PGS.TS Nguyễn Xuân Cự Studies on lettuce seed germination-I Coumarin induced dormancy (nghiên cứu sự nẩy mầm của rau xà lách và chất gây ngủ ở xà lách) của A.M.M.Berrie, W Parker, B.A.Knights and M.R.Hendrie Departments of Botany and Chemistry, University... sức khỏe và tính mạng của mẹ Trẻ sơ sinh có thể được sinh ra với bệnh nhiễm Listeria monocytogenes nếu mẹ ăn thực phẩm bị ô nhiễm trong thai kỳ Người khỏe mạnh có thể tiêu thụ các loại thực phẩm bị ô nhiễm mà không trở thành bệnh, nhưng những người có nguy cơ nhiễm trùng Listeria 26 monocytogenes có thể bị bệnh sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm ngay cả một vài tế bào vi khuẩn Căn bệnh này có thể được hiệu... chung về giống vi khuẩn Listeria spp và loài Listeria monocytogenes Listeria spp là giống vi khuẩn gram dương, kị khí tùy ý, có hình gậy ngắn, mảnh, không hình thành bào tử Chúng gồm 6 loài: L monocytogenes, L innocua, L seeligeri, L welshimeri, L ivanovii và L grayi Tuy nhiên, trong đó chỉ có loài L monocytogenes là tác nhân gây bệnh thực sự ở người [16][14] 23 Các loài vi khuẩn Listeria spp dung nạp... tìm thấy trong nhiều môi trường, bao gồm đất, nước thải, nước, chất thải và các loại thực phẩm Do toàn cầu hoá và sự tiêu thụ gia tăng của các thức ăn nhanh trên toàn thế giới, nên L monocytogenes đã trở thành là một tác nhân gây bệnh cơ hội thực phẩm quan trọng hiện nay [18] Hình 2.5: Vi khuẩn Listeria monocytogenes Hình 2.6: Cận cảnh Listeria monocytogenes qua kính hiển vi điện tử Listeria monocytogenes. .. người ta vẫn phát hiện vi sinh vật sống Vi khuẩn có nhiều hình thái, kích thước và cách sắp xếp khác nhau Đường kính cúa phần lớn vi khuẩn thay đổi trong khoảng 0,2  2 µm, chiều dài cơ thể khoảng 0,5-8,0 µm Những hình dạng chyủ yếu của vi khuẩn là hình cầu, hình que, hình dấu phẩy, hình xoắn, hình có sợi Mỗi tế bào vi khuẩn đều rất nhỏ và trong suốt.Vì thế khi dùng phương pháp soi tươi (phương pháp . thành đề tài: Khảo sát tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong rau xà lách . 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định mức độ nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogene ở rau xà lách và tác dụng. NHIỄM Listeria monocytogenes TRÊN RAU XÀ LÁCH 41 4.2.1. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes tại các vườn rau. 41 4.2.2. Ảnh hưởng của các quá trình xử lý đến mức nhiễm Listeria monocytogenes4 3. rau diếp, xà lách, cải bắp, súp lơ và cải xoăn [9]. 2.1.2. Rau xà lách Là loại rau có mặt trong danh sách loại rau được ăn sống nhiều nhất cùng với xà lách xoang, rau muống, cải bẹ xanh, rau