i GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà LỜI CẢM ƠN Với tất cả chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Phạm Thu Thủy và TS. Nguyễn Văn Duy đã tận tình dìu dắt, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường cùng quý thầy cô giáo trong Viện đã tận tình dạy bảo, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học, giúp tôi có một nền tảng vững chắc để bước vào đời. Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, gia đình, bạn bè và những người thương yêu tôi, luôn bên cạnh an ủi và động viên tôi giúp tôi có thêm sức mạnh để vượt qua những khó khăn và có niềm tin vào cuộc sống. Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới chị Minh Nhật, bạn Phạm Thị Huế lớp 49 SH và 2 em Lê Thị Vân và Nguyễn Thị Ngọc Bích lớp 50 SH đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người! Nha Trang, tháng 07 năm 2011 Sinh viên thực hiện Võ Thị Hà ii GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi LỜI NÓI ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Salmonella 3 1.1.1. Phân loại Salmonella 3 1.2.2. Các đặc điểm sinh học của Salmonella 4 1.2.3. Kháng nguyên của Salmonella 7 1.2.4. Khả năng và cơ chế gây bệnh của Salmonella 9 1.2.5. Gen độc tố invA của Salmonella 11 1.2.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Salmonella gây ra 14 1.2.1.Trên thế giới 14 1.2.2. Ở Việt Nam 15 1.3. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Salmonella 16 1.3.1. Phương pháp PCR 17 1.3.2. Phương pháp Realtime PCR 19 1.4. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài 22 1.4.1. Tính cấp thiết của đề tài 22 1.4.2. Mục tiêu của đề tài 22 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Vật liệu 24 2.1.1. Mẫu 24 2.1.2. Thiết bị chuyên dụng 24 2.1.3. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 24 2.2. Nội dung nghiên cứu 30 2.3. Phương pháp nghiên cứu 31 iii GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 2.3.1. Phân lập và nuôi cấy Salmonella 31 2.3.2. Nhuộm Gram 34 2.3.3. Tách chiết DNA với bộ kít Wizard ® SV Genomic DNA Purification System 35 2.3.4. Xác định nồng độ DNA bằng điện di gel agarose và đo OD 36 2.3.5. Xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella 38 2.3.6. Xây dựng quy trình Realtime PCR phát hiện Salmonella 40 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Salmonella 43 3.2. Xác định hình thái tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram 46 3.3. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn 47 3.3.1. Khả năng sử dụng các loại đường của các chủng Salmonella 47 3.3.2. Khả năng sử dụng lysin của các chủng Salmonella 50 3.4. Tách chiết DNA tổng số 51 3.5. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA 52 3.5.1. Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA 52 3.5.2. Kết quả chạy PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi invA1,2 53 3.5.3. Kết quả khảo sát nồng độ mồi invA1,2 55 3.5.4. Khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR 56 3.6. Phản ứng Realtime PCR khuếch đại đoạn gen invA 57 3.6.1. Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella 57 36.2. Khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR 58 3.6.3. Kết quả phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm khuếch đại 60 3.6.4. Kết quả xây dựng đường chuẩn Realtime PCR phát hiện Salmonella 62 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 iv GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp : Base pair BPW : Nước pepton đệm (Buffer Pepton Water) CFU : Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit) DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP : Deoxy Nucleotide Triphosphate dsDNA : Double Strand Deoxyribonucleic Acid EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ELISA : Kỹ thuật miễn dịch men (Enzyme – Linked Immuno Sorbent Assay) FDA : Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (Food and Drug Administration) LDC : Lysine Decarboxylase MR : Methyl Red OD : Mật độ quang (Optical Density) PCR : Phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction) PE : Polyethylene RNA : Ribonucleic Acid RV : Rappaport – Vassilisdis SPI : Hệ thống gen gây độc (Salmonella pathogenicity island) TBE : Tris Boric acid EDTA TE : Tris EDTA TNF : Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor) TSA : Tryptone Soya Agar VP : Voges – Proskauer WHO : Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization) v GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Số kiểu huyết thanh ở các loài và dưới loài Salmonella 4 Bảng 1.2. Tóm tắt các đặc tính sinh hoá của các loài và dưới loài Salmonella 7 Bảng 1.3. Kháng nguyên của một số chủng Salmonella 9 Bảng 1.4. Danh sách các chủng Salmonella đã được giải trình tự bộ gen 12 Bảng 2.1. Các thông số của cặp mồi invA1,2 39 Bảng 3.1. Mật độ tế bào và đặc điểm hình thái của các chủng 45 Salmonella phân lập được 45 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng các loại đường của các chủng Salmonella 50 Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn Salmonella 51 Bảng 3.4. Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella 58 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR 59 vi GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Salmonella được quan sát dưới kính hiển vi 5 Hình 1.2. Khái quát cấu trúc kháng nguyên của Salmonella 8 Hình 1.3. Ví trí các vùng gen gây độc trong hệ gen của S. typhimurium 13 Hình 1.4. Các gen trong vùng gen SPI – 1 của S. typhimurium 13 Hình 1.5. Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime PCR 20 Hình 2.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 30 Hình 2.2. Quy trình phân lập Salmonella 32 Hình 3.1. Các chủng Salmonella sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường RV ở điều kiện pH 7,4 và nhiệt độ 44 o C 43 Hình 3.2. Các khuẩn lạc của Salmonellas sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường XLD ở điều kiện pH 7,4 và nhiệt độ 37 o C 44 Hình 3.3. Các khuẩn lạc của chủng vi khuẩn S2 sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường TSA ở điều kiện pH 7,4 và nhiệt độ 37 o C 44 Hình 3.4. Tế bào của chủng vi khuẩn S2 sau khi nhuộm Gram 47 Hình 3.5. Thí nghiệm lên men đường của các chủng vi khuẩn Salmonella 49 Hình 3.6. Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn 51 Hình 3.7. DNA tổng số của các chủng Salmonella 52 Hình 3.8. Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA 53 Hình 3.9. Kết quả khảo sát độ bắt cặp của cặp mồi invA1,2 54 Hình 3.10. Kết quả khảo sát nồng độ mồi của cặp mồi invA1,2 56 Hình 3.11. Khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR 57 Hình 3.12. Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella 58 Hình 3.13. Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR 59 Hình 3.14. Biểu đồ nóng chảy (Melt curve chart) của phản ứng Realtime PCR 61 Hình 3.15. Biểu đồ đỉnh nóng chảy (Melt curve peak chart) của phản ứng Realtime PCR 62 Hình 3.16. Đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR 63 1 GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà LỜI NÓI ĐẦU An toàn vệ sinh thực phẩm hiện đang là vấn đề cấp thiết và đáng lo ngại của toàn cầu. Số vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng cao đặc biệt là các vụ ngộ độc thực phẩm hàng loạt. Các nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm có thể là do tác nhân sinh học (vi khuẩn, vi rút, nấm, ký sinh trùng ), tác nhân hóa học, tác nhân vật lý hay do các tác nhân khác. Trong đó tác nhân sinh học là nguyên nhân phổ biến và nguy hiểm nhất đặc biệt là các vi khuẩn và độc tố của chúng tiết ra. Chúng không chỉ gây hại cho sức khỏe của người tiêu dùng một cách tức thì mà còn có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng và lâu dài. Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae có hơn 2.500 kiểu huyết thanh (serotype), là các trực khuẩn Gram âm, hình que, hiếu khí tùy ý, có thể di động, có khả năng sinh hơi khi lên men dextrose. Chúng được tìm thấy phổ biến trong các loại thực phẩm có nguồn gốc từ động vật như: các loại thịt, trứng, hải sản và các sản phẩm từ chúng. Vi khuẩn này được xác định là tác nhân gây nhiễm độc thức ăn nguy hiểm nhất hiện nay. Ngoài việc gây nhiễm độc thức ăn ở người, Salmonella còn gây ra các chứng bệnh nguy hiểm khác như sốt thương hàn, phó thương hàn, nhiễm trùng máu cấp tính, sẩy thai, viêm khớp và các bệnh về đường hô hấp ở cả người và động vật gây ảnh hưởng đến sức khỏe và nền kinh tế của nhiều quốc gia trên thế giới kể cả Việt Nam. Do vậy, việc phát hiện sớm Salmonella là rất cần thiết. Tuy nhiên ở Việt Nam, việc phát hiện Salmonella hầu hết chỉ dựa trên phương pháp truyền thống: nuôi cấy kết hợp với các thử nghiệm sinh hóa, miễn dịch. Các quy trình này rất phức tạp, độ nhạy thấp và đặc biệt là rất tốn thời gian ít nhất phải mất từ 2 đến 6 ngày. Đó cũng là lý do giải thích vì sao để tìm được nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm phải mất cả tuần. Kỹ thuật Realtime PCR là kỹ thuật sinh học phân tử mới được phát triển từ kỹ thuật PCR truyền thống có độ nhạy cao, vừa cho kết quả định tính vừa kết quả định lượng và đặc biệt là rút ngắn thời gian phát hiện (< 24 giờ) so với các phương pháp truyền thống và các phương pháp sinh học dựa trên 2 GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà PCR cổ truyền khác nhưng hiện nay ở nước ta chưa có một công trình nào về ứng dụng phương pháp Realtime PCR phát hiện Salmonella trong mẫu thực phẩm được công bố. Xuất phát từ thực tế trên đề tài “Phát hiện vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp Realtime PCR” được tiến hành với các mục tiêu chính sau:  Phân lập các chủng Salmonella có mặt trong một số mẫu thực phẩm thu mua tại các cơ sở chế biến thủy sản và các chợ ở Thành phố Nha Trang và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn này bằng các thử nghiệm sinh hóa.  Xác định gen độc tố invA của vi khuẩn Salmonella bằng kỹ thuật Realtime PCR và so sánh kết quả với kỹ thuật PCR phát hiện Salmonella, tạo cơ sở khoa học cho việc phát hiện và điều trị bệnh sớm.  Xây dựng đường chuẩn của phương pháp Realtime PCR từ đó có thể định lượng chính xác số bản sao DNA ban đầu có trong mẫu phân tích và suy ra lượng vi khuẩn có trong mẫu thực phẩm. 3 GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Salmonella 1.1.1. Phân loại Salmonella a. Phân loại khoa học Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Salmonella Loài: Salmonella bongori & Salmonella enterica b. Phân loại theo cấu trúc kháng nguyên Ðến nay người ta đã xác định được hơn 2.500 kiểu huyết thanh thuộc chi Salmonella. Trong đó, Salmonella được chia làm 2 loài chính là S. enterica và S. bongori. S. enterica lại được chia ra làm 6 dưới loài khác nhau là S. enterica (S. enterica I), S. salamae (S. enterica II), S. arizonae (S. enterica IIIa), S. diarizonae (S. enterica IIIb), S. houtenae S. enterica IV) và S. indica (S. enterica VI). Loài S. bongori còn được gọi là Salmonella V ( Popoff, 2001). Các kiểu huyết thanh này được chia theo hệ thống của Kaffmann – White dựa vào kháng nguyên bề mặt tế bào vi khuẩn: kháng nguyên thân hay kháng nguyên O (somatic antigen), kháng nguyên roi hay kháng nguyên H (flagellar antigen) và kháng nguyên vi (vi antigen) (Popoff, 2001; WHO, 2005). Kháng nguyên O là chuỗi phức hợp lipopolysaccharide nằm trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Kháng nguyên H được tạo thành bởi các tiểu phần protein roi (flagellin). Sự đa dạng về vùng giữa của flagellin là cơ sở cho sự đa dạng về kháng nguyên H. Một số kiểu huyết thanh như là S. typhi, S. paratyphi C, S. dublin còn có thêm kháng 4 GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà nguyên vi. Đây là loại kháng nguyên định vị bên ngoài vỏ polysaccharide của vi sinh vật, có liên quan đến tính độc riêng với tế bào chủ. Các kiểu huyết thanh gây bệnh cho người và động vật máu nóng chủ yếu nằm trong S. enterica I chiếm tới 99,5%. Dưới loài này có 1.478 kiểu huyết thanh. S. enterica II có 498 kiểu huyết thanh, S. enterica IIIa có 94 kiểu huyết thanh, S. enterica IIIb có 327 kiểu huyết thanh, S. enterica IV có 71 kiểu huyết thanh, S. enterica VI có 12 kiểu huyết thanh và S.bongori (V) có 21 kiểu huyết thanh (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Số kiểu huyết thanh ở các loài và dưới loài Salmonella (Nguồn: Popoff, 2001) 1.2.2. Các đặc điểm sinh học của Salmonella a. Đặc điểm hình thái của Salmonella Năm 1880, Eberth là người đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn Salmonella được phân lập từ lát cắt lách, hạch bạch huyết của bệnh nhân sốt thương hàn dưới kính hiển vi điện tử. Loài Salmonella Dưới loài Số kiểu huyết thanh S. enterica S. enterica (I) 1.487 S. salamae (II) 498 S. arizonae (IIIa) 94 S. diarizonae (IIIb) 327 S. houtenae (IV) 71 S. india (VI) 12 S. bongori (V) 21 Tổng 2.501 [...]... đã phát triển các kít Realtime PCR để đưa vào ứng dụng tại nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng có trang bị PCR tại Vi t Nam như kít Realtime PCR phát hiện và định lượng HBV (Hepatitis B virus); kít RT Realtime PCR phát hiện và định lượng HCV (Hepatitis C virus) – RNA và kít RT Realtime PCR định lượng HIV1 (Human immunodeficiency virus1 ) – RNA Bệnh vi n Nhi đồng 1 Thành phố Hồ Chí Minh cũng đã thực hiện. .. Trong đó, vi c xác định Salmonella chủ yếu sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống mất nhiều thời gian và công sức Hiện chỉ có một số ít công trình nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR cổ điển để phát GVHD: TS Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 16 hiện Salmonella được công bố như đề tài Phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm bằng phương pháp PCR của Trần Linh Thước (2005) hay đề tài Phát hiện Salmonella. .. Sử dụng phương pháp miễn dịch học (dựa trên nguyên tắc tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể) giúp phân biệt được các chủng Salmonella, tuy nhiên phương pháp này gặp phải một nhược điểm là dễ tạo kết quả dương tính giả Ngoài ra, các phương pháp sinh học phân tử cũng được sử dụng để phát hiện Salmonella như phương pháp PCR, mutiplex PCR, Realtime PCR, Trong đó, so với các phương pháp dựa trên PCR cổ... thuật Realtime – PCR để chẩn đoán xác định các tác nhân gây vi m não ở trẻ em hay các công trình nghiên cứu về ứng dụng kỹ thuật này trong vi c phát hiện các virus gây bệnh trên tôm như virus gây bệnh đốm trắng (Phạm Thị Mỹ Hạnh, 2005), bộ kít Realtime PCR phát hiện virus gây hoại tử khối u của công ty Nam Khoa Tuy nhiên chưa có một công trình nghiên cứu nào về ứng dụng phương pháp Realtime PCR để phát. .. Salmonella có mặt trong một số mẫu thực phẩm thu mua tại các cơ sở chế biến thủy sản và các chợ ở Thành phố Nha Trang và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn này bằng các thử nghiệm sinh hóa GVHD: TS Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 23  Xác định gen độc tố invA của vi khuẩn Salmonella bằng kỹ thuật Realtime PCR và so sánh kết quả với kỹ thuật PCR phát hiện Salmonella, tạo cơ sở khoa học cho vi c phát hiện. .. phát hiện và định lượng Salmonella trong các mẫu thực phẩm được công bố 1.3 Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Salmonella Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện Salmonella như phương pháp nuôi cấy truyền thống, quan sát hình thái dưới kính hiển vi, kiểm tra các đặc tính sinh hóa, phương pháp miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot) và các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, ... pháp dựa trên PCR cổ điển (PCR, mutiplex PCR, nested PCR) thì phương pháp Realtime PCR có nhiều ưu điểm vượt trội hơn như có độ nhạy cao hơn, cho kết quả sớm hơn do không cần phải chạy điện di sau phản ứng và đặc biệt phương pháp này giúp định lượng chính xác được Salmonella trong mẫu và rút ngắn thời gian phân tích 1.3.1 Phương pháp PCR a Nguyên lý Nhân bản DNA bằng phản ứng PCR là một quy trình dựa... polymerase sử dụng 1.3.2 Phương pháp Realtime PCR a Nguyên tắc Nguyên tắc của Realtime PCR tương tự PCR truyền thống Tuy nhiên phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay cả khi phản ứng đang xảy ra Khả năng này được thực hiện nhờ vào sự phát tín hiệu huỳnh quang của chất phát huỳnh quang hoặc các mồi được đánh dấu huỳnh quang được thêm vào PCR mix Sự gia tăng lượng... đối với Realtime PCR Ngoài các ưu điểm kể trên thì phương pháp Realtime PCR vẫn còn gặp một số hạn chế như yêu cầu về thiết bị đọc tín hiệu huỳnh quang và máy tính đi kèm và đòi hỏi kỹ năng về thao tác và sử dụng máy GVHD: TS Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 22 Tuy nhiên ở những phương pháp trước thì vấn đề hạn chế này cũng tương tự, chính vì vậy phương pháp Realtime PCR là phương pháp tối ưu nhất hiện nay... spp trong thực phẩm bằng PCR của Phẩm Minh Thu và cộng sự (2000) Tuy nhiên sử dụng kỹ thuật này chỉ xác định sự có mặt của vi khuẩn mà không cho kết quả định lượng chính xác số lượng bản sao DNA đích có trong mẫu phân tích Những năm gần đây phương pháp Realtime PCR một trong những phương pháp cải tiến mới nhất dựa trên nguyên lý PCR đã được ứng dụng chủ yếu vào vi c phát hiện các virus gây bệnh trên . ứng dụng phương pháp Realtime PCR phát hiện Salmonella trong mẫu thực phẩm được công bố. Xuất phát từ thực tế trên đề tài Phát hiện vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp Realtime PCR được. định gen độc tố invA của vi khuẩn Salmonella bằng kỹ thuật Realtime PCR và so sánh kết quả với kỹ thuật PCR phát hiện Salmonella, tạo cơ sở khoa học cho vi c phát hiện và điều trị bệnh sớm dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella 38 2.3.6. Xây dựng quy trình Realtime PCR phát hiện Salmonella 40 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Salmonella 43