Đang tải... (xem toàn văn)
Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt
MỤC LỤC MỞ ĐẦU 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1. Cấu trúc của lignocellulose . 4 1.1.1. Cấu trúc thành tế bào thực vật .4 1.1.2. Cellulose .7 1.1.3. Lignin 10 1.1.4. Hemicellulose .14 1.2. Enzyme thủy phân lignocellulose 16 1.1.5. Enzyme cellulolytic .17 1.1.6. Enzyme xylanolytic .19 1.3. Ứng dụng của enzyme lignocellulolytic . 22 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1. Nguyên liệu 23 2.1.1. Mẫu đất 23 2.1.2. Hóa chất .23 2.1.3. Thiết bị 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu . 24 2.1.4. Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt .24 2.1.5. Nhận dạng chủng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 24 2.1.5.1. Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn 24 2.1.5.2. Tách chiết ADN tổng số 24 2.1.5.3. Định lượng ADN bằng cách đo độ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 260 nm và 280 nm 26 2.1.5.4. PCR nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S .26 2.1.5.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector p-GEM T .27 2.1.5.6. Tách ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli DH5α 27 2.1.5.7. Đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S .28 2.1.6. Thu nhận chế phẩm enzyme .30 2.1.7. Xác định hoạt độ enzyme 30 2.1.7.1. Xác định hoạt độ enzyme 30 2.1.7.2. Ảnh hưởng của pH đối với hoạt độ và độ bền của enzyme 32 2.1.7.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt độ và độ bền của enzyme .32 2.1.8. Xác định protein 33 2.1.9. Thủy phân các chất lignocellulose .33 2.1.10. Tách phức hệ multienzyme từ dịch lỏng của môi trường nuôi cấy .33 2.1.11. Điện di gel và kỹ thuật zymogram .33 2.1.12. Sắc ký bản mỏng (TLC) .34 1 KẾT LUẬN 34 KIẾN NGHỊ .35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 2 MỞ ĐẦU Cùng với sự phát triển của nông nghiệp, hàng năm hàng triệu tấn chất lignocellulose bắt nguồn từ các hoạt động nông nghiệp, được thải ra môi trường. Điều này không chỉ làm tăng thêm gánh nặng môi trường mà còn làm lãng phí về các nguồn sinh khối, do đó cần phải thực hiện nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối với việc thải các chất thải vào môi trường. Các phương pháp xử lý hóa học và sinh học thông thường ngày càng khó đạt được mức độ cần thiết để loại bỏ các chất ô nhiễm này. Vì vậy cần phải triển khai những biện pháp xử lý sao cho vừa nhanh hơn, rẻ hơn, hiệu quả hơn, đáng tin cậy hơn vừa đem lại lợi ích kinh tế. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, công nghệ sinh học đã được ứng dụng rộng rãi trong xử lý chất thải nông nghiệp. Thế hệ nhiên liệu sinh học đầu tiên dựa trên đường, tinh bột và dầu thực vật, tuy nhiên chưa thực sự có được những ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. Lignocellulose được xem là thế hệ nhiên liệu sinh học thứ hai. Đối với môi trường và các ngành kinh tế, các chất thải lignocellulose sẽ được sử dụng như một nguồn nguyên liệu để sản xuất các chất hóa học, nhiên liệu và các vật chất tương hợp khác. Bên cạnh đó, các nguồn nguyên liệu này được đặc biệt quan tâm vì giá thành thấp và nguồn cung cấp dồi dào. Quá trình biến đổi sinh học các chất thải thành nhiên liệu có thể mang đến các lợi nhuận về kinh tế cũng như về môi trường [1]. Lignocellulose (sinh khối thực vật) bao gồm các polysaccharide chủ yếu là cellulose, hemicellulose (xylan) và lignin, trong đó cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất. Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 35% đến 50% khối lượng khô thực vật, còn hai hợp chất, hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20-30% và 5-20% khối lượng khô của cơ thể thực vật [23]. Với tính sẵn có lignocellulose trở thành một nguồn năng lượng tái tạo dồi dào [36]. 3 Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng và triển vọng sử dụng enzyme vào việc biến đổi sinh học các chất thải lignocellulose để tạo ra các đường đơn hữu ích từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3]. Nhằm thu được enzyme có hoạt tính thủy phân lignocellulose hiệu quả thành các đường đơn và đường đôi từ phế phụ liệu nông nghiệp, để rồi từ đó đưa vào ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm có giá trị trong đời sống con người, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “ Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt”. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cấu trúc của lignocellulose 1.1.1. Cấu trúc thành tế bào thực vật Trong tự nhiên, các lớp của thành tế bào thực vật được minh họa bằng mô hình của gỗ (Hình 1.1). Ở giữa các tế bào, có một hợp chất đóng vai trò như keo dán gắn kết các tế bào lại với nhau, đó là lớp gian bào (middle lamella). Lớp này cấu tạo từ các chất keo, có bản chất pectin và không có tác động về quang học. Bên trong là thành tế bào sơ cấp (primary wall). 4 Hình 1.1: Cấu trúc thành tế bào thực vật [37] Thành tế bào sơ cấp có thể được chia thành mặt bên trong và mặt bên ngoài. Sự sắp xếp của các vi sợi trong thành tế bào sơ cấp phân tán tăng dần từ mặt trong ra mặt ngoài. Tiếp đến là thành tế bào thứ cấp gồm 3 lớp: lớp ngoài (S1), lớp giữa (S2) và lớp trong (S3). Sự phân chia thành tế bào thứ cấp thành ba lớp S chủ yếu là do sự định hướng khác nhau của các vi sợi trong ba lớp đó. Điển hình các vi sợi định hướng xoắn trong vách tế bào. Lớp ngoài của thành tế bào thứ cấp, các vi sợi được định hướng trong cấu trúc xoắn chéo có độ nghiêng tạo thành một góc lớn với trục dọc của tế bào. Lớp giữa là lớp dày nhất và ở lớp giữa có góc nhỏ và độ nghiêng của sợi xoắn ốc trong khi vi sợi trong lớp 3 được sắp xếp như ở lớp ngoài, với một góc rộng với trục dọc của tế bào. Ngoài ra trong một số trường hợp, trên mặt trong của thành tế bào có lớp sần sùi (W). Chức năng của thành tế bào là chống đỡ cho các cơ quan của cây đặc biệt là các vách dày và cứng. Thành tế bào còn giữ các chức năng quan trọng chính như hấp thụ, thoát hơi nước hay vận chuyển và bài tiết. Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, chúng ta có thể tìm thấy lignocellulose ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các chất 5 thải rắn trong thành phố. Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin (Hình 1.2). Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau, trong khi lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này là khác nhau giữa các loài. Hơn nữa, thành phần cấu tạo trong cùng một cây hay các cây khác nhau là khác nhau dựa vào độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây và các điều kiện khác. Thành phần của lignocellulose được trình bày ở bảng 1.1 [9]. Hình 1.2: Thành phần chủ yếu của lignocellulose Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến [9] Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0 0-15 6 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu của lúa mì 30 50 15 Rác đã phân loại 60 20 20 Lá cây 15-20 80-85 0 Hạt bông 80-95 5-20 0 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy hóa học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nước thải ban đầu 8-15 - 24-29 Chất thải của lợn 6 28 - Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.7-5.7 Cỏ ở bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4 Cỏ mềm 45 31.4 12.0 Các loại cỏ (trị số trung bình cho các loại) 25-40 25-50 10-30 Bã thô 33.4 30 18.9 Lượng lớn lignocellulose được thải ra từ các ngành lâm nghiệp, nông nghiệp, công nghiệp giấy và gây ra ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, lượng lớn các sinh khối thực vật dư thừa được coi là rác thải có thể được biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá trị khác nhau như nhiên liệu sinh học, hóa chất, các nguồn năng lượng rẻ cho quá trình lên men, bổ sung chất dinh dưỡng cho con người và thức ăn cho động vật [15]. 1.1.2. Cellulose Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C 6 H 10 O 5 ) n, và là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4- O- (β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.3). Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 10 11 7 tấn cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%). Hình 1.3: Công thức hóa học của cellulose Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn công [40]. Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh thể và vô định hình như hình 1.4 [29]. Hình 1.4: Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô định hình. 8 Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b như trên hình vẽ. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β - glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180 o cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro [2]. Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen. Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose. Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết β-1 4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, vì vậy giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hidro được tạo thành giữa các nhóm OH của chúng. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose. Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối 9 sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn. 1.1.3. Lignin Lignin là một phức hợp chất hóa học phổ biến được tìm thấy trong hệ mạch thực vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật. Lignin là một trong các polymer hữu cơ phổ biến nhất trên trái đất. Lignin có cấu trúc không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình, chiếm 17% đến 33% thành phần của gỗ. Lignin không phải là carbohydrate nhưng có liên kết chặt chẽ với nhóm này để tạo nên màng tế bào giúp thực vật cứng chắc và giòn, có chức năng vận chuyển nước trong cơ thể thực vật (một phần là để làm bền thành tế bào và giữ cho cây không bị đổ, một phần là điều chỉnh dòng chảy của nước), giúp cây phát triển và chống lại sự tấn công của côn trùng và mầm bệnh. Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn. Hơn nữa, lignin đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon, tích lũy carbon khí quyển trong mô của thực vật thân gỗ lâu năm, là một trong các thành phần bị phân hủy lâu nhất của thực vật sau khi chết, để rồi đóng góp một phần lớn chất mùn giúp tăng khả năng quang hợp của thực vật. Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn. Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans- sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol (Hình 1.5). 10 [...]... 4 ml aniline, 200 ml aceton và 30 ml axit phosphoric 80% [33] Đường glucose, cellobiose, xylose và xylooligosaccharide được dùng làm chất chuẩn KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu nêu trên, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1 Đã phân lập được một số chủng vi khuẩn, trong đó có chủng NKP13 có khả năng phân giải lignocellulose từ 34 mẫu vi khuẩn thu thập được 2 Đoạn gen... PCR 9700, máy lắc nuôi cấy, nồi hấp khử trùng, tủ ổn nhiệt, máy trộn vortex 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.1.4 Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic ưa nhiệt Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường cơ bản gồm K2HPO4 0,15g/l, KH2PO4 0,29g/l, urea 0,21g/l, cao nấm men 0,45g/l, muối khoáng 0,02%, resazurin 0,0025%, cystein 0,004% và giấy lọc 1% làm cơ chất Môi trường được xử lý bằng... giải phóng phân tử Dglucose từ đường cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác Hình 1.9: Tác dụng của từng enzyme trong cellulose 18 1.1.6 Enzyme xylanolytic Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân của nó đòi hỏi các ảnh hưởng của một hệ thống enzyme phức tạp Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse, β-xylosidase) và enzyme phân nhánh (α-arabinofuranosidase,... tự nucleotide và cho thấy sự tương đồng tới 98% so với trình tự của đoạn gen tương ứng từ loài vi khuẩn Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum HM585225 được công bố trong ngân hàng gen thế giới 3 Chủng vi khuẩn NKP13 sinh trưởng được trên môi trường có cơ chất là vỏ ngô trong điều kiện kỵ khí và có khả năng sinh enzyme xylanolytic và CMCase với hoạt động thích hợp ở pH 6.0 và ở nhiệt độ 70 oC... sạch 2.1.5 Nhận dạng chủng vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic ưa nhiệt 2.1.5.1 Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn Phương pháp nhuộm Gram cải tiến như sau [1]: - Chuẩn bị chủng vi khuẩn sạch: các chủng được nuôi cấy trên môi trường thạch đã nêu ở trên - Tím kết tinh được nhỏ để làm vết bôi và để trong 1 phút - 1-2 giọt dung dịch (lugol) được bổ sung và giữ 30 giây đến 1 phút Tiêu bản được tẩy... vi sinh vật cellulolytic và xylanolytic không ở trong môi trường riêng biệt mà chúng tồn tại cùng với các loài khác như nấm và vi khuẩn Các chủng này sẽ đóng vai trò như trung tâm thủy phân polymer để tạo ra đường và các sản phẩm thủy phân khác 1.1.5 Enzyme cellulolytic Enzyme thủy phân cellulose có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose... trùng và ủ ở 60oC, pH 7 Quá trình sinh trưởng của vi khuẩn được quan sát hàng ngày và các bước sàng lọc được tiến hành vài lần cho đến khi thu được kết quả tốt Sau đó 1 ml mỗi mẫu được dàn đều lên đĩa thạch 2,5% với môi trường tương tự như trên có chứa bã giấy 1% rồi ủ ở 60oC từ 2-3 ngày trong buồng cấy kị khí Các khuẩn lạc được sàng lọc vài lần đến khi được tinh sạch 2.1.5 Nhận dạng chủng vi khuẩn. .. các enzyme khác nhau để thủy phân hiệu quả hơn Mỗi polymer bị thủy phân bởi một số vi sinh vật sản xuất các enzyme hoạt động hỗ trợ nhau Nếu đúng như vậy, điều này có thể giúp chúng ta giải thích được tại sao vi sinh vật cellulolytic tổng hợp đặc trưng nhiều enzyme cellulase khác nhau có tính đặc hiệu gối nhau và tại sao một số enzyme xylanase lại mang vùng liên kết cơ chất gần với cellulose Các vi. .. độ đối với hoạt độ và độ bền của enzyme Nhiệt độ tối ưu của enzyme được xác định bằng cách đo hoạt độ ở dãy nhiệt độ 40oC đến 90oC, pH 7 Độ bền nhiệt của enzyme được đo bằng cách ủ enzyme ở pH 7 trong 30 phút ở các nhiệt độ khác nhau Sau đó hoạt độ còn lại được xác định như phương pháp đã nêu ở trên 32 2.1.8 Xác định protein Nồng độ protein được xác định theo phương pháp của Lowry và các cộng sự [22]... được chứng minh là sinh ra từ một số loài vi khuẩn và nấm [20,31] 1.3 Ứng dụng của enzyme lignocellulolytic Thế hệ nhiên liệu sinh học đầu tiên dựa trên đường, tinh bột và dầu thực vật, không có được những ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, vì các nguyên vật liệu này cũng được sử dụng làm thức ăn Lignocellulose được xem là thế hệ nhiên liệu sinh học thứ hai Trong thập kỷ qua, enzyme thủy phân lignocellulose . đã thực hiện đề tài: “ Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt . CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cấu. vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic ưa nhiệt. ..........................................................24 2.1.5. Nhận dạng chủng vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic