11 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Lxx : Leifsonia xyli subsp. xyli STM : Staining by Transpiration Method RSD : Ratoon Stunting Disease PCR : Polymerase Chain Reaction ctv. : cộng tác viên rRNA : Ribosome ribonuleic acid Mb : Mega bases bp : base pair ITS : Intergenic transcribed spacer region LT – EIA : Liquid Transfer Enzyme immunoassay EB – ELISA : Evaporative binding - Enzym Linked immunosorbent assay TBIA : Tissue Blot Enzym Immunoassay NCM : Nitrose cellulose membrance TRITC : Tetramethylrhodamine isothiocyanate FAT : Indirect flourescent antibody technique FADCF : Flourescent antibody directed counting filter µl : Micro litre µg : Micro gram µM : Micro mol mM : Mili mol IgG : Immunoglobulin 12 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Danh sách bệnh hại mía quan trọng và phổ biến 11 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ bó mạch đỏ và bó mạch vàng trong mỗi lóng dọc theo chiều cao cây 29 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô được chủng thông qua tỉ lệ mạch đỏ trung bình 35 Bảng 4.3. Bảng kết quả của các thử nghiệm sinh hóa đối với 8 dòng vi khuẩn đã phân lập được 41 13 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1. Cây mía 5 Hình 2.2. Một số bệnh hại phổ biến trên cây mía 10 Hình 2.3. Vi khuẩn Lxx – tác nhân gây bệnh cằn mía gốc 12 Hình 2.4. Sự phân chia của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli được phân lập từ dịch chiết nước mía 13 Hình 2.5. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc 14 Hình 3.1. Quy trình nhuộm STM để chẩn đoán cây mía bị bệnh 23 Hình 3.2. Phương pháp chủng bệnh cằn mía gốc vào cây mía nuôi cấy mô 25 Hình 4.1. Lát mỏng cắt ngang của thân mía sau khi nhuộm STM 30 Hình 4.2. Kết quả khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh 31 Hình 4.3. Mẫu thân cây mía cắt dọc 36 Hình 4.4. Kết quả thử nghiệm phản ứng sinh hóa 42 14 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Mía là một loại cây công nghiệp ngắn ngày có vị thế ngày càng quan trọng ở nước ta. Nó là một trong những cây mũi nhọn, có hiệu quả kinh tế cao, là cây có ưu thế trong việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng ở vùng đất cao chưa chủ động nước và vùng đồi thấp. Mía là cây có khả năng bảo vệ và bồi dưỡng đất, là cây làm giàu của trung du. Trước mắt, mía là cây lấy đường phục vụ cho tiêu dùng trong nước và xuất khẩu, trong tương lai mía còn là nguyên liệu quý của ngành năng lượng, ngành giấy và sợi nhân tạo (Trần Văn Sỏi, 2001). Theo Nguyễn Huy Ước (1994), mía là loại cây trồng một lần nhưng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, vì vậy đây là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loài sâu bệnh tồn tại và phát triển. Hơn nữa, khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh ngày càng đa dạng hơn. Trên thế giới hiện có 126 bệnh hại mía (Ricaud và ctv., 1989). Trong đó không thể không kể đến bệnh cằn mía gốc (Ratoon Stunting Desease - RSD); đây là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất, đặc biệt đối với những nước nông nghiệp tiên tiến có trình độ cơ giới hóa cao. Bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra. Đây là bệnh có tác động nguy hiểm nhất đến sản lượng mía trên thế giới. Bệnh có thể gây thiệt hại từ 5 – 15 % sản lượng (Comstock, 2005) và mức tổn thất có thể lên đến 50 % đối với vụ mía gốc (Davis, 1980). Vi khuẩn Lxx không gây ra các triệu chứng bên ngoài đặc trưng, hơn nữa sự lan truyền vi khuẩn lại diễn ra rất nhanh trong các ruộng mía làm cho thiệt hại do bệnh gây ra càng nặng nề hơn. Nhìn chung, cây bị nhiễm Lxx sẽ phát triển chậm hơn so với các cây khác cùng độ tuổi nên người nông dân thường lầm tưởng các triệu chứng của bệnh là do điều kiện canh tác (cây bị thiếu chất dinh dưỡng, đất trồng thiếu độ ẩm). 15 Lxx kí sinh chuyên tính trong bó mạch nên việc nghiên cứu loại vi khuẩn này rất khó khăn. Trên thế giới, vi khuẩn Lxx mới được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây. Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã đạt được một số thành công nhất định từ quá trình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc như: phân lập thành công vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh (Davis, 1980); thiết lập quy trình phát hiện Lxx trong dịch chiết và dịch khuẩn lạc bằng kĩ thuật PCR (Y Pan và ctv., 1998); giải mã trình tự bộ gen của Lxx (Luis và ctv., 2004). Ở nước ta, bệnh cằn mía gốc là một loại bệnh đã được phát hiện từ lâu, trong lịch sử cũng đã có nhiều vùng bị thiệt hại nặng nề do bệnh gây ra (Hà Đình Tuấn, 2004). Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể nào về căn bệnh này cũng như vi khuẩn Lxx; người nông dân thậm chí không biết ruộng mía của mình bị bệnh, sản lượng thu hoạch mía giảm đáng kể làm cho công suất của các nhà máy đường trong nước chỉ còn 50 – 60 % (Hà Đình Tuấn, 2004). Để phòng tránh được những thiệt hại nghiêm trọng về năng suất và phẩm chất mía do bệnh gây ra, cần phải đề ra những biện pháp kiểm soát và quản lý bệnh một cách hiệu quả. Do đó, việc phát hiện sớm vi khuẩn Lxx trên cây mía là một yêu cầu cấp thiết trong công tác tuyển chọn và kiểm định giống nhằm tạo ra một nền nông nghiệp ổn định, hiệu quả, trực tiếp thúc đẩy ngành công nghiệp mía đường phát triển, đáp ứng đủ nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Do sự thiệt hại về sản lượng đã ra gây tổn thất đáng kể cho ngành công nghiệp mía đường cũng như tính cấp thiết của việc nghiên cứu, chúng tôi đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc" nhằm tìm hiểu kĩ lưỡng hơn về tác nhân gây bệnh. Từ đó, đưa ra được một phương pháp phát hiện vi khuẩn nhanh chóng và chính xác, góp phần vào chiến lược kiểm soát và hạn chế bệnh. 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục đích Thực hiện các nghiên cứu cơ bản về bệnh cằn mía gốc và vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli để tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về sinh học phân tử (PCR, 16 dot blot, nghiên cứu cấu trúc gen, cơ chế gây bệnh), từ đó tìm ra phương pháp kiểm soát và xử lý bệnh hiệu quả. 1.2.2. Nội dung nghiên cứu Đề tài thực hiện gồm bốn nội dung chính như sau: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx trong bó mạch dọc theo vị trí lóng bằng phương pháp nhuộm STM. Chủng bệnh các cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết từ cây mía bị nhiễm Lxx. Sau đó, khảo sát thời gian vi khuẩn kí sinh gây tắc mạch và thống kê tỉ lệ cây được chủng bị nhiễm. Phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh trên môi trường thạch MSC và SC. Thử nghiệm sinh hóa nhằm xác định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn được phân lập. 17 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu sơ lƣợc về cây mía (Saccharum spp.) 2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển Qua nhiều năm tranh luận, ngày nay New-Ghine được thừa nhận là nơi nguyên sản của cây mía. Theo các tài liệu nghiên cứu về kiến tạo địa chất, nhiều tác giả cho rằng cây mía xuất hiện trên trái đất từ khi lục địa châu Á và châu Úc còn dính liền, cách đây hàng vạn năm. Ấn Độ và Trung Quốc là hai nước trồng mía có lịch sử lâu đời nhất trên thế giới. Ở Trung Quốc, căn cứ vào những tài liệu ghi chép cổ xưa cùng với sự phân bố rộng rãi của mía dại ở nhiều nơi trong nước và mức độ phong phú của những giống mía thương mại cho thấy cây mía được trồng rất lâu đời, khoảng thế kỉ VI trước công nguyên. Nghề trồng mía ở châu Á được truyền bá đi khắp nơi trên thế giới theo hai con đường: từ Trung Quốc truyền sang phía Đông Nam đến Philippine, Nhật Bản, Indonexia; từ Ấn Độ sang phía Tây tới Iran, Ai Cập, Tây Ban Nha, Ý, Cây mía được trồng ở các nước vùng Địa Trung Hải vào khoảng đầu thế kỉ XIII. Năm 1940, trong chuyến vượt biển lần 2, Christopher Columbus mới đưa mía sang châu Mỹ, đầu tiên trồng ở đảo Santo Domingo, sau đó tới Mexico (1502), Brazil (1532), Peru (1533), Cuba (1650) (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996). 2.1.2. Phân loại học Cây mía thuộc: Ngành có hạt (Spermatophyta) Lớp một lá mầm (Monocotyledoneae) Họ hòa thảo (Gramineae) Giống Saccharum. Trong giống Saccharum có năm loài: Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L.) Loài Trung Quốc (Saccharum sinence Roxh Ement Jesw) Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw) 18 Hình 2.1. Cây mía (Nguồn: www.apsnet.org/ online/slideset/sugarcane) Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.) Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround and Jesw) Các giống mía thương mại hiện nay là sản phẩm lai tự nhiên, lai nhân tạo giữa các loài kể trên với nhau hoặc do quá trình tuyển chọn từ ba loài Saccharum officinarum, Saccharum sinence, Saccharum barberi (Trần Văn Sỏi, 2003). Điều này cho thấy sự phong phú của các giống mía trồng hiện nay. 2.1.3. Phân bố Hiện nay, cây mía là cây trồng chính ở nhiều nước nhiệt đới trên thế giới. Nơi có vĩ độ cao nhất mà cây mía được trồng là Natal, Argentina, cực nam của Australia (khoảng 30 độ S), phía tây nam Pakistan (khoảng 34 độ N) và phía nam Tây Ban Nha (37 độ N) (Trích dẫn bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006). 2.1.4. Đặc điểm thực vật học 2.1.4.1. Các bộ phận của cây mía Rễ mía: cây mía có hai loại rễ là rễ sơ sinh và rễ thứ sinh. Rễ sơ sinh (rễ hom) mọc ra từ đai rễ của hom trồng; loại rễ này có nhiệm vụ bám đất, hút nước, cung cấp chất dinh dưỡng cho sự nảy mầm ở thời kì đầu sinh trưởng. Khi mầm mía chuyển thành cây con, các rễ thứ sinh mọc ra từ đai rễ của cây con tự hút nước và chất dinh dưỡng để cung cấp cho cây, các rễ sơ sinh sẽ teo dần và biến mất. Thân mía: được hình thành bởi nhiều lóng mía hợp lại, có màu sắc và hình dạng khác nhau. Thân mía không chỉ là nơi để giữ bộ lá mà còn có nhiệm vụ dẫn nước, chất dinh dưỡng từ rễ tới lá và dự trữ đường nhờ quá trình quang hợp ở bộ lá. Thân mía là đối tượng thu hoạch và là nguyên liệu chính để chế biến đường ăn. Lá: gồm có bẹ lá và phiến lá. Bẹ lá là phần bao bọc thân mía, bảo vệ mắt mầm; phiến lá có hình lưỡi mác (màu xanh hoặc màu xanh thẩm), có một gân giữa 19 màu sáng và hình dáng, kích thước khác nhau tùy giống. Lá là tổ chức đồng hóa thực sự của cây, lá có nhiệm vụ hô hấp và thực hiện quá trình quang hợp. Hoa (bông cờ): hoa mía có tổ chức sinh sản ngầm với cấu trúc đơn giản. Mỗi hoa bao gồm cả tính đực và tính cái với ba nhị, một bầu noãn và hai nhụy. Khi hoa mía nở, các bao phấn của nhị tung phấn, nhờ gió mà nhụy cái dễ dàng tiếp nhận hạt phấn. Ở cây mía, có giống ra hoa, có giống không ra hoa, có giống ra hoa sớm, có giống ra hoa muộn, đó là kết quả sinh lý tự nhiên của cây trồng nói chung và cây mía nói riêng. Tuy nhiên, trong sản xuất người ta không thích mía ra hoa. Hạt mía: là vật liệu sinh sản hữu tính của cây mía, đây là kết quả cuối cùng của giai đoạn sinh thực. Hạt mía giống một chiếc vảy nhỏ, hình thoi và nhẵn, độ dài 1 - 1,25 mm, nặng 0,15 - 0,25 mg. Hạt mía chỉ có ý nghĩa trong lai tạo tuyển chọn giống mía (Nguyễn Huy Ước, 1999; Trần Thùy, 1996). 2.1.4.2. Các giai đoạn sinh trƣởng và phát triển Theo Đoàn Thị Thanh Nhàn (1996), chu kì sinh trưởng của cây mía trong một vụ thường kéo dài 1 năm (trường hợp đặc biệt như ở Hawai là 2 năm). Nhưng chu kì khai thác của 1 ruộng mía có thể kéo dài từ 3 - 10 năm tùy vào điều kiện từng vùng. Dù là mía tơ hay mía gốc, chu kì sinh trưởng của cây mía gồm 5 thời kì: Thời kì nảy mầm: thời kì nảy mầm tính từ khi đặt hom trồng cho tới lúc mầm mía nảy thành cây con, mở đầu cho hoạt động sống của cây mía. Hom mía từ trạng thái ngủ chuyển sang trạng thái hoạt động trải qua một loạt biến đổi sinh hóa phức tạp. Trong quá trình nảy mầm, hom mía hô hấp mạnh. Dưới tác dụng của enzyme, đường saccharose và protein được phân giải thành glucose và acid amine cung cấp cho hoạt động sống của mầm, rễ. Nguồn dinh dưỡng cần thiết cho sự nảy mầm là đường glucose và acid amine, do đó hàm lượng các chất này trong hom mía nhiều hay ít có quan hệ trực tiếp đến tốc độ nảy mầm. Giữa hàm lượng đường glucose và số ngày cần thiết cho sự nảy mầm có tương quan nghịch, hàm lượng đạm tan trong hom mía tương quan thuận với tỉ lệ nảy mầm. Thời kì cây con: bắt đầu từ khi cây có lá thật thứ nhất cho đến khi phần lớn cây trong ruộng mía có 5 lá thật. Rễ cây bắt đầu phát triển khi cây con có hai lá thật, 20 như vậy trong suốt thời gian đầu cây con sống một phần dựa vào rễ hom. Sau khi rễ cây đã phát triển mạnh thì nhiệm vụ cung cấp dinh dưỡng chính do rễ cây đảm nhiệm. Do đó, trong thời kì này, phải tạo điều kiện cho lá sinh trưởng mạnh để cây quang hợp tốt, đồng thời thúc đẩy rễ cây phát triển nhanh. Thời kì đẻ nhánh (nhảy bụi hoặc đâm chồi): đẻ nhánh thực chất là sự nảy mầm của những mầm ở phần gốc của cây. Khi cây mía có từ 6 - 7 lá thật, các mầm nằm ở dưới mặt đất nảy thành nhánh. Từ thân mẹ đẻ ra nhánh cấp 1, nhánh cấp 1 đẻ ra nhánh cấp 2 và tiếp tục thành một bụi mía. Thời gian đẻ nhánh thường kéo dài từ 3 - 4 tháng tùy thuộc giống mía, thời vụ trồng, kĩ thuật chăm sóc. Thời kì vươn cao (vươn lóng): trong thời kì này, thân vươn cao nhanh, đường kính thân tăng mạnh, rễ, ngọn phát triển, số lá tăng thêm và đổi mới không ngừng. Trong các thời kì trước, mía sinh trưởng chậm vì quá trình quang hợp ở lá và sự hấp thụ ở rễ còn yếu, sản phẩm quang hợp tạo ra có hạn và một phần quan trọng phải dùng để tạo nên thân, lá, rễ. Trong thời kì vươn cao, trên cơ sở bộ lá và bộ rễ đã phát triển hoàn chỉnh, các quá trình sinh lý của cây đạt tới đỉnh cao, hiệu lực sử dụng độ phì đất đai, phân bón, năng lượng ánh sáng mặt trời tăng lên. Trong thời kì này mía sinh trưởng nhanh, tốc độ tăng trưởng chiều cao đạt từ 10 cm/tháng đến 50 cm/tháng. Do đó, thời kì vươn cao là thời kì quyết định trọng lượng thân, tức là thời kì quyết định năng suất mía cây. Thời kì chín công nghiệp và trổ cờ: vào cuối thời kì vươn lóng, nhiệt độ và lượng mưa giảm dần (ở nước ta thường là từ tháng 11 trở đi), cây mía sinh trưởng chậm lại và bước vào thời kì tích lũy đường mạnh mẽ. Sự hình thành và tích lũy đường trong cây mía bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn một là sự kết hợp của CO 2 và H 2 O thành đường đơn glucose với sự có mặt của diệp lục và ánh sáng. Giai đoạn hai là quá trình chuyển hóa đường đơn thành đường saccharose và các đường đa khác, giai đoạn này không cần ánh sáng và diệp lục. Các bộ phận của cây mía như thân, lá đều có thể tổng hợp đường mía từ đường đơn. Đường mía tổng hợp từ lá chuyển vào thân, một phần dùng cho hô hấp và cấu tạo thân, lá, rễ; phần còn lại tích lũy trong thân dưới dạng saccharose. . nghiên cứu, chúng tôi đã thực hiện đề tài: " ;Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc& quot; nhằm tìm hiểu kĩ lưỡng hơn về tác nhân gây bệnh. . cơ giới hóa cao. Bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra. Đây là bệnh có tác động nguy hiểm nhất đến sản lượng mía trên thế giới. Bệnh có thể gây thiệt hại từ. dòng vi khuẩn đã phân lập được 41 13 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2. 1. Cây mía 5 Hình 2. 2. Một số bệnh hại phổ biến trên cây mía 10 Hình 2. 3. Vi khuẩn Lxx – tác nhân gây bệnh cằn