Sông Hậu: Mẫu cá bệnh thu tại xí nghiệp Đông lạnh Thủy sản số 7 thuộc Agifish, nguồn cá từ cá bè nuôi tại Châu đốc. + Thời vụ thu mẫu Tổng số lượng mẫu thu: 80 mẫu. Mùa mưa: thu mẫu vào các tháng 6, 7 năm 1997, tổng số mẫu thu 53 mẫu (sông Tiền 32 mẫu, sông Hậu 21 mẫu). Mùa khô: thu mẫu vào tháng giêng năm 1998, tổng số mẫu thu 27 mẫu (sông Tiền 10 mẫu, sông Hậu 17 mẫu), trong đo ù có 5 mẫu đối chứng ( cá không thấy biểu hiện bệnh lý bên ngòai) có nguồn gốc bè nuôi tại sông Hậu. II.3 Phương pháp kiểm tra tổng thể mẫu cá Mẫu vật còn tươi sống - cá vừa mới chết - được đo chiều dài, cân trọng lượng, quan sát bằng mắt thường dấu hiệu bệnh lý biểu hiện bên ngòai về hình dạng, trạng thái, mùi, màu sắc cá, các bộ phận như mắt, xoang miệng, mang, các vi và hậu môn. Giải phẩu quan sát biểu hiện bệnh lý nội quan ở gan, lách, thận, dạ dày, ruột, bóng hơi, mô mở, xoang bụng. II.4 Phương pháp thu, bảo quản, vận chuyển và xử lý sơ bộ mẫu cá + Phương pháp thu mẫu - Thu mẫu cá bệnh ở bè Cá ba sa có biểu hiện bất thường như bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước, hoặc trôi ngữa bụng, tấp vào mặt khại bè dưới dòng nước chảy, cá còn thở thoi thóp, được vớt lên khỏi nước bằng vợt lưới. - Thu mẫu cá ba sa bệnh tại xí nghiệp Đông lạnh số 7 Cá ba sa nguyên liệu, được vận chuyển bằng ghe đụt từ bè nuôi đến xí nghiệp Đông lạnh. Tất cả cá hầu hết đều còn sống, cá khỏe mạnh bơi lội bình thường, cá 27 có biểu hiện các dấu hiệu bệnh lý khi quan sát bên ngoài không sử dụng để chế biến. Cá nầy được thu làm mẫu nghiên cứu. + Vận chuyển, xử lý sơ bộ mẫu cá và bảo quản mẫu vật Cá ba sa bệnh thu mẫu tại bè hay tại xí nghiệp Đông lạnh số 7 , trước tiên mẫu vật được đánh số, ghi tên lòai cá bệnh, thời gian, đòa điểm thu mẫu, tên người thu mẫu. Mẫu vật thu, nghiên cứu về vi khuẩn đònh tính: được cấy trong môi trường BHI chứa trong ống nghiệm 5ml. Các ống nghiệm được cột bó chặt, gói giấy kín đựng trong hộp nhựa, để tránh nghiêng đổ. Mẫu vật nghiên cứu về vi khuẩn đònh lượng: đựng gan cá trong túi PE, dán kín, giữ lạnh trong thùng xốp. Sau khi xử lý sơ bộ, mẫu vật được vận chuyển bằng xe bus tốc hành, từ nơi thu mẫu đến phòng thí nghiệm của viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Thời gian từ lúc thu mẫu đến khi xử lý mẫu tại phòng thí nghiệm không quá 24 giờ. II.5 Phương pháp phân lập, nuôi cấy và đònh danh vi khuẩn - Xử lý mẫu phân lập đònh tính Vi khuẩn phân lập từ các cơ quan gan, thận, lách của cá, cấy trực tiếp vào môi trường BHI (Brain Heart Infusion Broth), chứa trong ống nghiệm 5 ml đã được thanh trùng bằng Autoclave, để vào tủ ấm, nhiệt độ 30 o C, trong 24 giờ. Khi vi khuẩn đã tăng sinh khối, được cấy chuyền sang môi trường không chọn lọc (nonselective media) TSA (Tryptone Soya Agar) và môi trường chọn lọc (selective media) Aeromonas Isolation Medium Base. Tất cả để trong tủ ấm, nhiệt độ 30 o C. Khi khuẩn lạc mọc đầy đủ, chọn những khuẩn lạc rời, chiếm ưu 28 thế, tiếp tục cấy lại trên môi trường TSA, chọn giống thuần, rồi cấy chuyền sang môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) để lưu giống. + Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn theo phương pháp Hucker’s Modification. + Thực hiện các phản ứng sinh hóa, đònh danh vi khuẩn theo hệ thống phân lọai vi khuẩn của Bergey (1981). Sử dụng các phản ứng sinh hóa thực hiện đònh danh vi khuẩn. 1. Oxydase 2. Catalase 3. OF/O ; OF/ F 4. KIA 5. MR - VP 6. Simons citrate 7. Phenylalanine (agar) 8. Urea 9. Indol 10. Nitrat 11. Arginine 12. Ornithine 13. Lysine 14. H 2 S Production 15.Motility 16. KCN 17.ONPG 18. Gelatine 19. Glucose (gas) 20. Latose 21. Arabinose 22. Maltose 23. Sucrose (Saccarose) 24. Rhaminose 25. Malnitole 26. Sorbitole 27. Galactose 28. Inositole + Sử dụng API kit (Analytical Profile Index) đònh danh vi khuẩn phân lập lần hai. - Phương pháp lập kháng sinh đồ: Lập kháng sinh đồ theo phương pháp đóa giấy của Kirby - Bauer (Bộ môn vi sinh - khoa Y 1989). - Xử lý mẫu đònh lượng vi khuẩn: bằng phương pháp pha loãng hệ thống 10lần Cắt một mẫu gan, cân trọng lượng 1gr, cho vào cối thủy tinh giã nhuyễn. Sau khi mẫu vật nhuyễn mòn, cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước muối sinh lý 29 0,85% NaCl đã thanh trùng , khuấy đều bằng máy lắc. Lấy 1ml dung dòch cho vào ống nghiệm thứ I chứa 9ml nước muối sinh lý, dùng pipet hút trộn đều, rồi lấy 1ml canh khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý thứ 2. Từ ống thứ 2 , lấy 1ml canh khuẩn cho vào ống nghiệm thứ 3, cứ thế đến ống nghiệm thứ 4, 5, 6. Mỗi ống nghiệm lấy 0,1ml canh khuẩn, dàn đều (spread plate method) trên đóa môi trường PCA (Plate Count Agar) bằng đủa (que gạc) thủy tinh (mỗi ống nghiệm đếm 2 đóa). Giữ các đóa trong tủ ấm 30 o C. Sau 24 giờ, đếm khuẩn lạc trên 2 đóa, tính trung bình tổng số khuẩn lạc (CFU/gr). Sơ đồ 1: Quy trình pha loãng hệ thống canh khuẩn 30 II.6 Phương pháp tiến hành thực nghiệm gây nhiễm trở lại - Xác đònh mật độ vi khuẩn : Chủng vi khuẩn thí nghiệm được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường BHI, cấy chuyền sang đóa môi trường TSA, gạn khuẩn lạc hòa vào 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý 0,85% NaCl, với 3 mật độ vi khuẩn khác nhau thể hiện qua 3 độ đục: cao, trung bình, thấp. Mẫu canh khuẩn pha lõang theo quy trình pha lõang liên tiếp đếm khuẩn lạc. Chọn 3 ống canh khuẩn có mật độ thấp nhất trong cùng một dãy, mỗi ống canh khuẩn của mỗi mật độ vi khuẩn lấy 0,1ml dàn đều trên 2 đóa môi trường PCA, ủ trong tủ ấm 30 o C, trong 24 giờ, đếm khuẩn lạc, lấy trung bình tổng số, tính mật độ vi khuẩn/ ml. + Chuẩn bò cá thí nghiệm: Tiến hành thực nghiệm gây nhiễm vi khuẩn trở lại trên cá ba sa khỏe mạnh, nhằm xác đònh vi khuẩn tác nhân gây bệnh. Vì vậy cá ba sa thí nghiệm gây nhiễm được nuôi trong phòng thí nghiệm, để tạo sự ổn đònh hơn về điều kiện sống cũng như sức khỏe , so với cá ba sa sống bên ngòai. Cá ba sa sinh sản nhân tạo, mới nở 3 ngày, hoặc 10 ngày tuổi, từ Châu đốc, Long xuyên (An giang) chuyển đến viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, trong bao PE có bơm oxy bằng xe bus tốc hành. Tại viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, cá ương trong bể kính, kích thước 0,4 x 0,8 x 0, 45 m và 1 bể 0,45 x 1,5 x 0,5 m. Trong suốt quá trình nuôi , sục khí liên tục cả ngày lẫn đêm. Mật độ cá trong bể kính 15 con cá / 120 lit nước. Thức ăn cho cá là trứng nước ( Moina) trong tuần lễ đầu, từ tuần thứ hai trở đi, cá ăn trùng chỉ (Tubifex), thức ăn viên. (Moina, trùng chỉ được ngâm trong nước máy ít nhất 1 giờ dưới vòi nước chảy nhẹ, trước khi cho cá ăn). Nguồn nước nuôi cá là nước máy, trữ trong bể gạch men. Nước chứa trong bể ít nhất 24 giờ để lọai hết Chlor,trước khi cho vào bể kính. Bể nuôi cá hút cặn, thay nước 1lần/ ngày, 31 mỗi lần thay 30 - 80% lượng nước trong bể. Thời gian ương từ cá bột lên cá giống đạt quy cỡ tiến hành thí nghiệm là 75 ngày. + Bố trí thí nghiệm - Chọn cá thí nghiệm: Cá tương đối đồng đều về kích cỡ, bố trí 10 con / bể kính. Đo chiều dài, cân trọng lượng cá, để cá ổn đònh 1 ngày. Tiến hành bố trí thí nghiệm ở lọai cá đạt chiều dài trung bình 9,2cm, trọng lượng trung bình 8,5 gr (đợt I) và chiều dài trung bình 10,9 cm, trọng lượng trung bình 9,3gr (đợt II). - Phương pháp gây nhiễm: cá thí nghiệm gồm 100 con, được chia thành 4 nhóm. Nhóm cá đối chứng gồm 10 con, mỗi cá thể được tiêm vào xoang bụng 0,1 ml dung dòch muốâi sinh lý (0,85% NaCl) đã thanh trùng. Các cá thể thuộc 3 nhóm cá còn lại (30 con/nhóm) được tiêm vào xoang bụng 0,1 ml canh khuẩn có lượng vi khuẩn lần lượt theo từng nhóm là 10 3 , 10 5 , và 10 7 cfu/ml, (bảng 5). - Chăm sóc theo dõi cá thí nghiệm: Sau khi tiêm, cá được nuôi trong bể, mỗi bể 10 con theo từng nhóm thí nghiệm, hàng ngày chăm sóc theo dõi theo phương thức nêu trên. Thời gian theo dõi 15 ngày hoặc đến khi toàn bộ cá thí nghiệm bò chết. Trong quá trình theo dõi, ghi nhận thời điểm 50% số cá gây nhiễm bò chết, ghi nhận các dấu hiệu bệnh lý của cá chết. Bảng 5. Bố trí thí nghiệm gây nhiễm vi khuẩn trở lại trên cá ba sa Nồng độ gây nhiễm Đối chứng 10 7 cfu/ml 10 5 cfu/ml 10 3 cfu/ml Liều lượng tiêm 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml Bể thí nghiệm số 1 2 5 8 // 3 6 9 // 4 7 10 32 Thí nghiệm được thực hiện 2 đợt của 2 chủng vi khuẩn khác nhau. - Thu mẫu phân lập vi khuẩn tại phòng thí nghiệm: cá mới vừa chết do gây nhiễm, phân lập vi khuẩn xác đònh tác nhân gây bệnh. II. 7 Phương pháp tổng hợp xử lý số liệu Các số liệu thu được trong quá trình nghiên cứu được xử lý phân tích theo phương pháp thống kê toán học thông dụng. 33 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN III.1 Tình hình xuất hiện bệnh xuất huyết trong thời gian nghiên cứu III.1.1 Các yếu tố khí hậu, thủy văn chính và họat động của làng bè đến chất lượng nước của vùng nuôi III.1.1.1 Các yếu tố khí hậu - thủy văn chính Khí hậu: Năm 1997, mùa mưa đến muộn hơn các năm trước, nhiệt độ trung bình của tháng 6 (28,2 o C) cao hơn tháng 3 (26,9 o C), ngược lại nhiệt độ trung bình của nước trên sông Hậu vào tháng 6 (31,8 o C) lại thấp hơn tháng 3 (32,57 o C) (Phan thò Yến Nhi 1988). Lượng mưa đầu mùa rất thấp (43,2cm) và mưa xuất hiện vào tháng 5, trễ hơn các năm 1995, 1996 - mưa đã xuất hiện vào tháng 3,4 (Cục Thống Kê An giang 1998). Vì vậy số giờ nắng kéo dài, thời lượng nắng của tháng 6 (232,8 giờ) thấp hơn tháng 3 (274,2giờ) chỉ 41,4 giờ. Trong khi đó độ ẩm giữa tháng 3 (79%) và tháng 6 ( 80%) không chênh lệch nhau nhiều. Từ các thông số vừa nêu có thể nói yếu tố thời tiết, năm 1997 có một số biểu hiện bất thường so với những năm trước. Thủy văn: Chế độ Thủy văn trên sông Hậu, cho thấy vào tháng 3, đoạn sông Hậu ở Châu Đốc còn ảnh hưởng chế độ thủy triều bán nhật triều đều và không đều, nên dòng chảy xuất hiện hai chiều. Màu nước xanh trong do hòa lẫn màu cỏ của nước từ kênh rạch nội đồng chảy ra sông. Mực nước trung bình của tháng 3 (71cm), bắt đầu bước sang mùa kiệt, lại cao hơn mực nước trung bình của tháng 6 (51cm) (Cục Thống Kê An giang1998), là tháng giao thời của cuối mùa kiệt và đầu 34 mùa lũ. Tháng 6, nước từ thượng nguồn đã đỗ về, nên màu nước sông Hậu hơi đục và tại Châu Đốc ảnh hưởng của thủy triều yếu dần, cho đến mùa lũ, ảnh hưởng nầy trên sông Hậu tại Châu đốc dường như mất đi và dòng nước chảy một chiều về phía hạ lưu. Tất cả các yếu tố thủy văn trên đã góp phần rất lớn ảnh hưởng đến chất lượng nước của vùng nuôi thông qua các biến đổi về tốc độ dòng chảy, mực nước và chất lượng nước qua các mùa khác nhau. III.1.1.2 Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm bẩn Vào mùa khô BOD 5 trung bình 1,64 mgO 2 /l (Phan Thò Yến Nhi 1998), trò số nầy tại các điểm khảo sát không chênh lệch nhau nhiều và nằm trong giới hạn “nhỏ hơn “ 5 mgO 2 /l. Qua khảo sát các chỉ tiêu nầy, cho thấy các trò số khảo sát liên quan đến môi trường nuôi cá bè tại sông Hậu đều nằm trong giới hạn cho cá phát triển theo tiêu chuẩn nước để bảo vệ thủy sản (Lê Trình 1997). COD trung bình 17,11mgO 2 /l, trò số thấp nhất 12,18mgO 2 /l, ở đầu nguồn, cao nhất 26,66 mgO 2 /l (Phan Thò Yến Nhi 1988) ở phía sau làng bè. Các chỉ tiêu nầy đều thấp trong giới hạn cho phép nước sử dụng nuôi nuôi trồng thủy sản “lớn hơn “ 35mg/l theo TCVN.5942 -1995 (Lê Trình 1997). Về chỉ tiêu vi sinh: Coliform, hiện diện với mật độ cao, trung bình 123.10 2 MPN/100ml vượt 2 lần giới hạn tiêu chuẩn cho phép TCVN 5942 -1995 (Lê Trình 1997). Vào mùa mưa BOD 5 trung bình 1,20 mgO 2 /l, trò số BOD 5 thấp nhất tại làng bè 1,05 mgO 2 /l, và cao nhất 1,36 mgO 2 /l tại đầu nguồn. COD trung bình 6,32 mgO 2 /l, trò số thấp nhất 3,75 mgO 2 /l, tại làng bè, cao nhất 8,25 mgO 2 /l ở phía sau làng bè. Cũng như mùa khô, các chỉ tiêu BOD 5 , COD đều thấp so với giới hạn của tiêu chuẩn nuôi trồng thủy sản. Cũng như mùa khô các chỉ 35 tiêu trên có độ biến động không lớn tại các điểm khảo sát. Về chỉ tiêu vi sinh như Coliform, hiện diện với mật độ cao, trung bình 472,94.10 4 MPN/100ml vượt xa giới hạn tiêu chuẩn cho phép (TCVN 5942 -1995). Qua các chỉ tiêu khảo sát trên cho thấy nước có hiện tượng nhiễm hữu cơ, cụ thể là chỉ tiêu COD trước và sau khi chảy qua làng bè Mùa mưa, chất lượng nước tốt hơn mùa khô, bởi lượng hữu cơ trong nước không lớn và biến động không nhiều. Điều cần chú ý là chỉ số Coliform trong nước khá cao ở cả hai mùa và hiện diện cao nhất vào mùa mưa. III.1.2 Tình hình xuất hiện bệnh xuất huyết trên cá ba sa ở An giang trong thời gian nghiên cứu Vào tháng 2 -3 năm 1997, bệnh xuất huyết bộc phát cao điểm trên cá ba sa nuôi bè. Gần 100% bè cá thu họach bò nhiễm, với mức độ khác nhau. Điều chưa từng xảy ra là tỉ lệ cá dạt trong quá trình chế biến lên đến 30%, gây tổn thất nặng nề cho ngư dân. Tình trạng cá bệnh vẫn kéo dài, rãi rác nhiều nơi, tuy mức độ xảy ra có đôi phần lắng dòu sau vài tháng. Đề tài bắt đầu thực hiện vào ngày 13 tháng 6 năm 1997. Thời tiết đầu mùa mưa. Tiến hành thu mẫu cá ba sa bệnh nuôi bè, nằm tại sông Tiền - Tân Châu. Bè có sản lượng 140 tấn. Trong thời điểm nầy cá bò nhiễm bệnh xuất huyết chết khoảng 50 - 60 kg/ ngày. Đầu tháng 7/1997, tại xã Long Sơn - Phú Tân, hai bè cá ba sa nằm trên sông Tiền cách nhau 5 km, cá bò nhiễm bệnh xuất huyết, ngư dân điều trò tích cực bằng thuốc kháng sinh, tình trạng cá lúc thu mẫu vừa giảm tử vong. Đầu tháng 8/1997, thu mẫu cá bệnh tại xí nghiệp Đông lạnh số 7. Cá thu mẫu có nguồn gốc từ bè đóng trên sông Hậu - Châu đốc. Theo các nhân viên Kiểm 36 [...]... kích c : * 20 mẫu cá giống có chiều dài trung bình: 22, 8 cm, (19 - 25 cm) Trọng lượng trung bình 0,13kg ( 0,1 -0,2 kg) * 55 mẫu cá thương phẩm chiều dài trung bình: 48, 73 cm ( 39 - 59 cm) Trọng lượng trung bình: 1,62 kg (0,75 - 2,95 kg) III.2 2 Kết quả kiểm tra bằng mắt thường về dấu hiệu, triệu chứng bệnh lý của cá ba sa - Cá giống: Quan sát tổng thể cá bò xuất huyết vành môi, xoang miệng, mang tím... số 8, với mức nguyên liệu nhiễm bệnh, bò hạ loại 3,95%/ ngày Từ những ghi nhận trên, cho thấy cá ba sa bò nhiễm bệnh xuất huyết xảy ra tại nhiều điểm nuôi trong suốt thời gian nghiên cứu Đối phó với bệnh nầy, ngư dân theo kinh nghiệm đã sử dụng các lọai thuốc kháng sinh như Sulfamethoxazole, Sulfaguianidine, Tetramycine, Oxytetracyline, Chloramphenicol, Furazon, Néomycine trộn vào thức ăn cho cá để... 6/1997, cá nguyên liệu khi fillet, ngày nào cũng thấy xuất hiện cá bệnh xuất huyết - có những đốm đỏ trong thòt – với tỷ lệ khỏang 3-5%/ ngày Từ tháng 9 - 12/1997, theo báo cáo của cán bộ cơ sở về tình hình cá bệnh xuất huyết vẫn xảy ra rãi rác ở cả hai khu vực sông Tiền và sông Hậu Ngày 13 và 21/ 1 năm 19 98, thời tiết giữa mùa nắng - tiến hành thu mẫu cá bệnh tại xí nghiệp Đông lạnh số 7 Cá thu mẫu... điểm Sông Tiền có 4 điểm: gồm xã Long an -Tân châu (1 điểm), xã Long sơn - Phú Tân (3 điểm) Sông Hậu gồm có 2 điểm tại thò xã Châu đốc 37 Tổng số lượng mẫu thu là 80 , trong đó 5 mẫu thu tại sông Hậu vào mùa khô (cá không thấy biểu hiện bệnh lý bên ngoài) làm mẫu đối chứng * Cá đối chứng chiều dài trung bình: 47, 4cm (43 - 50cm) Trọng lượng trung bình: 1,41 kg (0,9 - 1,65 kg) Cá bệnh thu mẫu được phân... ngừa bệnh và điều trò, hoặc các hóa chất để điều trò bệnh như muối ăn (NaCl), sulphat đồng (CuSO4), Malachite green, Dipterex treo túi thuốc hay pha xuống be.ø Các lọai dược thảo như lá trầu loãng phun không, lá giác, lá xoan hiện nay cũng còn được sử dụng, nhưng rất ít III.2 Kết quả kiểm tra tổng thể các mẫu cá bệnh thu thập được III 2.1 Điểm thu mẫu và số lượng mẫu Điểm thu mẫu được thực hiện tại. .. vành môi, xoang miệng, mang tím bầm Xuất huyết vi lưng, vi ngực, vi bụng, vi hậu môn, vi đuôi Vi ngực tưa rách Hậu môn lồi đỏ Giải phẩu bên trong thấy gan vàng nhạt hay đỏ bầm, hoặc đỏ bầm ở rìa mép, gan sưng có đốm trắng, hay đỏ Lách đen, thận sưng, bóng khí đầy hơi, mạch máu trương to, ruột chứa ít thức ăn Hình 2 - Dấu hiệu bệnh lý của cá ba sa giống (bên ngoài) 38 . Tình hình xuất hiện bệnh xuất huyết trên cá ba sa ở An giang trong thời gian nghiên cứu Vào tháng 2 -3 năm 1997, bệnh xuất huyết bộc phát cao điểm trên cá ba sa nuôi bè. Gần 100% bè cá thu họach. bình: 1,62 kg (0,75 - 2,95 kg). III.2 2 Kết quả kiểm tra bằng mắt thường về dấu hiệu, triệu chứng bệnh lý của cá ba sa - Cá giống: Quan sát tổng thể cá bò xuất huyết vành môi, xoang miệng, mang. mùi, màu sắc cá, các bộ phận như mắt, xoang miệng, mang, các vi và hậu môn. Giải phẩu quan sát biểu hiện bệnh lý nội quan ở gan, lách, thận, dạ dày, ruột, bóng hơi, mô mở, xoang bụng. II.4