33 Hệ thống Soxhlet. Hệ thống phân tích xơ. Máy cô quay chân không. Máy ép dầu Komet (Model D85 – 1G, Đức). Máy sắc ký HPLC của hãng Hewlett Packard 1090, series 1 – lipid chromatography. 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa của lá, bánh dầu và nhân hạt xoan chịu hạn. 3.2.1.1 Xác định trọng lƣợng khô tuyệt đối [10] Cân chính xác 5g mẫu (lặp lại 3 lần đối với mỗi mẫu) trong hộp đựng mẫu sạch, khô đã được cân chính xác. Đem sấy khô ở nhiệt độ 105 0 C trong tủ sấy cho đến trọng lượng không đổi (từ 2 -5 giờ tùy theo mẫu), ở các thời điểm 2, 3, 4,…giờ sau khi sấy, lấy hộp mẫu ra ngoài tủ sấy, cho ngay vào bình hút ẩm, để nguội (khoảng 30 – 45 phút), đem cân chính xác. Sai số giữa hai lần phân tích tối đa là 5 mg, trọng lượng khô tuyệt đối được tính theo công thức: Trọng lượng khô tuyệt đối (%) = (trọng lượng mẫu khô * 100)/ trọng lượng mẫu tươi 3.2.1.2 Xác định khoáng tổng số Theo TCVN 4327 – 93; TCVN 4327 – 86 Tham khảo phương pháp TCVN 1538 – 74; AOAC Nguyên tắc Dùng sức nóng (550 – 600 0 C) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro có trong nguyên liệu. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị, dụng cụ - Cân phân tích có độ chính xác ± 0,002g - Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ (± 10 0 C) - Chén nung bằng sứ chịu nhiệt có dung tích 30 – 50 ml. + Hóa chất - HNO 3 đậm đặc - H 2 O 2 30% 34 Cách tiến hành Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung tới 550 – 600 0 C đến trọng lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm và cân (G). Cho vào chén nung khoảng 5 g mẫu (G 1 ). Cân trọng lượng chén có mẫu thử, thêm vào chén 5 giọt HNO 3 đậm đặc và 1 – 2 giọt H 2 O 2 30%. Cho vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ cho đến 550 – 600 0 C. Nung cho đến khi nguyên liệu biến thành tro trắng như tàn thuốc (thường trong khoảng 5 – 6 giờ). Sau đó lấy chén sứ ra cho ngay vào bình hút ẩm, để nguôi sau đó đem cân. Lặp lại quá trình nung mẫu cho đến khi khối lượng không đổi. Sai số giữa hai lần phân tích liên tiếp không được quá 0,0005 g cho 1g mẫu thử. Xác định trọng lượng chén chứa nguyên liệu đã biến thành tro trắng sau khi nung đến trọng lượng không đổi (G 2 ). Tính kết quả Hàm lượng khoáng tổng số đượctính theo công thức: % Khoáng tổng số = (G 2 – G) x 100/ (G 1 – G) Trong đó: G: Trọng lượng của chén nung (g) G 1 : Trọng lượng mẫu và chén trước khi nung (g) G 2 : Trọng lượng mẫu và chén sau khi nung (g) 3.2.1.3 Xác định hàm lƣợng lipid Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet, theo tiêu chuẩn TCVN 4331 – 86. Nguyên tắc Dùng ether nóng để hòa tan tất cả chất béo tự do trong nguyên liệu, sau đó để bay hơi hết ether, cân chính xác mẫu còn lại và tính ra hàm lượng lipid. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị và dụng cụ - Hệ thống Soxhlet - Máy xay hạt - Cân phân tích có độ chính xác ± 0,002 mg - Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ ± 1 0 C - Giấy gói, lam kính và bình hút ẩm 35 + Hóa chất: Ether petrolium Cách tiến hành Cắt giấy lọc có kích thước 8 x 9 cm, đem sấy ở nhiệt độ 105 0 C trong 3 giờ, sau đó cho vào bình hút ẩm và mang đi cân trọng lượng bì (Gb). Cân 1 g bột mẫu khô tuyệt đối, chuyển sang bao giấy đã chuẩn bị sẵn như trên, gấp miệng bao để tránh cho mẫu bị rơi vãi, sấy lại bao đã đựng mẫu ở nhiệt độ 105 0 C đến trọng lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm, đem cân, xác định được khối lượng bao và mẫu (Gm). Cho gói mẫu vào bình trích ly của hệ thống Soxhlet. Lắp các ống dẫn dung môi theo nguyên tắc bình thông nhau, khởi động hệ thống sinh hàn. Rót dung môi (Ether petrolium) vào bình trích ly cho đến miệng ống xiphông để dung môi trào xuống bình hứng, rót thêm cho đến 2/3 bình hứng thì dừng lại. Bình hứng được đặt trên bếp điện điều chỉnh được nhiệt độ. Bật bếp điện ở nhiệt độ 45 – 50 0 C để đun sôi dung môi, khởi động hệ thống Soxhlet. Quá trình trích ly kết thúc sau 10 – 12 giờ. Kiểm tra xem đã trích ly hết lipid bằng cách: nhấc ống làm lạnh ra, lấy vài giọt dung môi trong bình trích ly nhỏ lên lam kính và để cho dung môi bay hết, nếu thấy không còn vết mờ do lipid bám trên lam kính thì việc trích ly xem như kết thúc. Sau cùng, lấy gói mẫu ra để cho bay hơi hết dung môi, đem sấy khô gói mẫu ở nhiệt độ 105 0 C đến trọng lượng không đổi (khoảng 2 – 3 giờ), để nguội gói mẫu trong bình hút ẩm khoảng 30 phút, sau đó cân gói mẫu trên cân phân tích và xác định được khối lượng gói mẫu đã chiết rút mở ở độ khô tuyệt đối (Gc). Tính kết quả Hàm lượng lipid được tính theo công thức: X = (Gm – Gc)*100/ G Trong đó: X: Hàm lượng lipid trong nguyên liệu ở độ khô tuyệt đối (%) Gm: Khối lượng gói mẫu ở độ khô tuyệt đối Gc: Khối lượng gói mẫu đã chiết rút mở ở độ khô tuyệt đối G: Khối lượng mẫu đem phân tích 36 3.2.1.4 Xác định hàm lƣợng canxi [4] Nguyên tắc Dùng Trilon B xác định canxi trong dung dịch mẫu với chất chỉ thị là Murexid (C 8 H 5 O 6 N 5 ) trong môi trường có pH = 12. Ký hiệu của chất chỉ thị Murexid là H 3 I - trong môi trường pH = 12, H 3 I - có màu tím và khi kết hợp với canxi tạo thành chất phức tạp có màu hồng: H 3 I - + Ca 2+ CaH 3 I + Tím Hồng Phức chất của Ca với Murexid không bền bằng phức chất tạo bởi Ca và Trilon B. Vì vậy Trilon B đẩy chất chỉ thị Murexid ra khỏi phức chất dưới dạng tự do có màu tím: CaH 3 I + + H 2 Y 2- CaY 2- + H 3 I - + 2H + Hồng Tím Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị và dụng cụ - Bình tam giác 100 ml - Bình chuẩn độ bán tự động. - Pipet + Hóa chất - Dung dịch NaOH 10% - Dung dịch KCN 3% - Dung dịch Trilon B 0,02N - Chỉ thị Murexid: cân 0,1 g Murexid + 50 g NaCl tinh khiêt. Nghiền nhuyễn bằng cối, cho vào chai thủy tinh có đậy nút kín. Cách tiến hành Hút 20 ml dung dịch mẫu, cho vào bình tam giác 100 ml. Cho thêm 2 ml dung dịch NaOH 10%, 5 giọt KCN 3% (để ngăn chặn một số ion như Fe 3+ , Fe 2+ , Cu 2+ ,…tác dụng với Trilon B) và thêm vào một ít chất chỉ thị Murexid. Chuẩn độ bằng dung dịch Trilon B 0,02N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím, cần thực hiện song song một mẫu thử không. 37 Tính kết quả Lượng Calcium (mg) trong 100 g mẫu khô được tính theo công thức: m = (V x C x 20,04 x 100)/ a Trong đó: m: Lượng canxi có trong 100 g mẫu khô (mg). V: Thể tích Trilon B 0,02N dùng để chuẩn độ. C: Độ nguyên chuẩn của dung dịch Trilon B. 20,04: Đương lượng của canxi. a: Trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu đã chuẩn độ. 3.2.1.5 Xác định hàm lƣợng phốt - pho Phương pháp Quang phổ kế (AOAC 965.17 – 1990). Xác định hàm lượng phốt - pho trong giới hạn nồng độ từ 1 – 20 mg/ cm 3. Nguyên tắc Phương pháp dựa vào khả năng của ion Orthophosphate phản ứng với Ammonium Molybdate tạo thành Phosphormolybdate, phức chất có màu xanh lơ. 2(M o O 2 .4M o O 3 ) + H 3 PO 4 + 4 H 2 O (M o O 2 .4M o O 3 ) 2 H 3 PO 4 .4 H 2 O Hàm lượng phốt - pho phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu, đo ở bước sóng hấp thụ cực đại 650 nm với cuvet có chiều dày 10 mm. Dung dịch đối chứng là dung dịch không. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến có bước sóng 650 nm - Cuvet có chiều dày 10 mm - Bình định mức - Ống nghiệm + Hóa chất - Acid chlohydric đậm đặc (HCl) - Acid nitric đậm đặc (HNO 3 ) - Hydroquinone [C 6 H 4 (OH) 2 ] pha khi sử dụng. - Amoni Molybdate - Kali dihydrophosphate (KH 2 PO 4 ) - Sodium sulphite (NaSO 3 ) 38 Cách tiến hành Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 4325 – 86 + Chuẩn bị dung dịch thuốc thử: - Dung dịch 1: là dung dịch chuẩn gốc (có chứa 100 g Phosphor/ml): Hòa tan 0,4394g KH 2 PO 4 trong bình định mức 1000 ml bằng nước cất và định mức đúng 1000 ml. Chuẩn bị dung dịch chuẩn để lập thang chuẩn (có chứa 25 g Phosphor/ml): Lấy 25 ml dung dịch 1 vào trong bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất đến đúng 100 ml, ta có dung dịch 1A. - Dung dịch 2: là dung dịch Sodium sulphite (Na 2 SO 3 ) 20%: Hòa tan 20g Na 2 SO 3 trong ít nước, thêm tiếp nước cho đủ 100 ml. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng. - Dung dịch 3: là dung dịch Hydroquinone [C 6 H 4 (OH) 2 ] 0,5%: Hòa tan 0,5g hydroquinone trong một ít nước và 3 giọt H 2 SO 4 , thêm tiếp nước cho đủ 100 ml. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng. - Dung dịch 4: là thuốc thử Briggs (hay dung dịch Amoni Molybdate 5%): Hòa tan 50g amoni molybdate trong 600 ml nước. Cho 150 ml H 2 SO 4 đậm đặc vào trong 400 ml nước, để nguội, thêm tiếp dung dịch amoni molybdate 5% đã chuẩn bị và hỗn hợp, để nguội, thêm nước cho đủ 1000 ml. - Dung dịch acid chlohydric (HCl) 10% (pha loãng theo tỷ lệ 1:3): 250 ml acid HCl đậm đặc thêm 750 ml nước cất. - Hỗn hợp thuốc thử chuẩn bị khi sử dụng: Trôn lẫn các dung dịch 2, 3, 4 theo tỷ lệ 1 : 1 : 1 + Chuẩn bị dung dịch tro phân tích (Theo TCVN 4327 – 93) - Cân chính xác 1 – 5g mẫu (tùy theo loại mẫu có phosphor nhiều hay ít). - Vô cơ mẫu ở 550 0 C trong 4 giờ, để nguội. Thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất, thêm vào 10 ml dung dịch HCl 10% và 0,5 ml HNO 3 đậm đặc. - Đun nhẹ trong 5 phút (đến bay hơi). Để nguội đến nhiệt độ phòng. Rửa sạch chén nung và định mức thể tích dung dịch tro đến 250 ml. + Phản ứng lên màu - Lấy 10 ml dung dịch tro cho vào bình nón dung tích 100 ml, định mức bằng nước đến 100 ml được dung dịch thứ 2. 39 - Lấy 1 ml dung dịch thứ 2 cho vào ống nghiệm. - Thêm 3 ml hỗn hợp thuốc thử, cho nước đủ 10 ml. Trộn đều, để 30 phút. Đo ở bước sóng 650 nm. + Chuẩn bị thang dung dịch P chuẩn Thành phần dd O 1 O 2 O 3 O 4 O 5 O 6 O 7 O 8 O 9 O 10 O 11 Dd 1A (ml) 0 0,3 0,5 0,8 1,0 1,3 1,5 1,8 2,0 2,3 2,5 Nước (ml) 5 4,7 4,5 4,2 4,0 3,7 3,5 3,2 3,0 2,7 2,5 Hỗn hợp thử (ml) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Nước (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Nồng độ Dd (mg/l) 0 15 25 40 50 65 75 90 100 115 125 Độ hấp thu (650nm) 0 0,158 0,279 0,432 0,555 0,735 0,817 0,982 1,096 1,243 1,365 + Tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn Nồng độ phốt - pho của dịch thử được ước tính theo phương trình: X ( g P) = (y * 0,0057)/ 0,0109 y: Mật độ quang của dịch thử đo ở bước sóng 650 nm. Tính kết quả Hàm lượng phốt - pho được tính theo công thức: %P = X x V dd tro x 100 x Hệ số pha loãng/ 10 6 x m x V thử Trong đó: %P: Hàm lượng phốt - pho có trong mẫu 40 X: Nồng độ phốt - pho của dịch thử ( g P). m: Khối lượng mẫu thử tính bằng gram. 10 6 : Hệ số chuyển đổi từ g ra g. 100: Hệ số phần trăm Sai số giữa hai lần phân tích song song với độ tin cậy P = 0,95 không vượt quá d = 28 (0,05 + 0,031X)%. 3.2.1.6 Xác định hàm lƣợng xơ thô Hàm lượng xơ thô được xác định theo tiêu chuẩn TCVN 4329 – 1993 Nguyên tắc Phương pháp định lượng xơ thô dựa vào tính chất bền của xơ đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị và dụng cụ - Cân phân tích với đọ chính xác ± 0,002g - Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ 550 0 C ± 10 0 C - Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ ± 2 0 C - Bình định mức 1000 ml - Cốc thủy tinh 500 ml, Cốc lọc + Hóa chất - Dung dịch H 2 SO 4 1,25% - Dung dịch KOH 1,25% - Rượu etylic - Ete etylic Cách thực hiện Cân chính xác 1 g mẫu đã nghiền nhỏ (sấy khô đến trọng lượng không đổi) cho vào bình nón dung tích 250 ml. Hòa tan hết các chất tan trong dung dịch H 2 SO 4 1,25%. Sau đó đem hòa tan tiếp các chất tan trong dung dịch KOH 1,25%.Rửa sạch chất béo, lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng. Rửa kết tủa nhiều lần bằng nước cất nóng (mỗi lần 10 – 15 ml). Rửa lại bằng cồn 96 0 từ 1 – 2 lần Rửa tiếp với ete etylic tỷ lệ 1:1 . đổi) cho vào bình nón dung tích 250 ml. H a tan hết các chất tan trong dung dịch H 2 SO 4 1, 25% . Sau đó đem h a tan tiếp các chất tan trong dung dịch KOH 1, 25% .R a sạch chất béo, lọc qua giấy. lập thang chuẩn (có ch a 25 g Phosphor/ml ): Lấy 25 ml dung dịch 1 vào trong bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất đến đúng 100 ml, ta có dung dịch 1A. - Dung dịch 2: là dung dịch Sodium. 2 Nồng độ Dd (mg/l) 0 15 25 40 50 65 75 90 100 1 15 1 25 Độ hấp thu ( 650 nm) 0 0, 158 0,279 0,432 0 ,55 5 0,7 35 0,817 0,982 1,096 1,243 1,3 65 + Tiến hành xây dựng đồ