21 (Ban hành theo quyết định số 104/2001 QD-BNN của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn ngày 31-10-2001). 2.2 Các phương pháp phân tích aflatoxin 2.2.1 Phương pháp sinh vật học Phương pháp này đã được sử dụng đầu tiên, chủ yếu dựa vào tính mẫn cảm của một số loài sinh vật được thử nghiệm với aflatoxin. Đây là phương pháp định tính hay bán định lượng, không chuyên biệt đối với từng độc tố nhưng đơn giản và dễ thực hiện. Thử nghiệm độc tính trên phôi gà (Chicken Embryo Bioassay): Chiết mẫu bằng chloroform cô đặc có nồng độ khoảng 200-300 ng/ml, sau đó tiêm vào buồng khí hoặc lòng đỏ của trứng gà Leghorn trắng đã thụ tính và ấp trong 5 ngày, phôi gà sẽ chết trong vòng 2 ngày nếu có aflatoxin. Thử nghiệm này đã được đưa vào tiêu chuẩn AOAC [10]. Ngoài ra, độc tính của aflatoxin còn được thử nghiệm trên vịt con mới sinh, ấu trùng của loài giáp xác, tế bào động thực vật nuôi cấy, trên vi khuẩn Bacillus megaterium, trên cá hồi…[10] 2.2.2 Phương pháp phân tích hóa lí Các phương pháp này dùng phát hiện và định lượng aflatoxin nhanh, chính xác và có tính chuyên biệt cao hơn so với phương pháp sinh học; hiện nay được dùng chủ yếu trong các phòng thí nghiệm. Các giai đoạn cơ bản: Lấy mẫu Chi ế t aflatoxin Tinh chế aflatoxin Cô đặc mẫu Phát hiện và định lượng aflatoxin 22 2.2.2.1 Lấy mẫu Mục đích: Lấy mẫu đại diện cho lô hàng hay đối tượng khảo sát. Thông thường, tuỳ theo loại thực phẩm và khối lượng thực phẩm cần phân tích, việc lấy mẫu được thực hiện từ nhiều vị trí khác nhau với những lượng khác nhau. Các mẫu này được tiến hành đồng nhất và từ mẫu đồng nhất này, một lượng thích hợp sẽ được trích ra để tiến hành phân tích aflatoxin, thường từ 20-100g tuỳ thuộc vào loại thực phẩm và hàm lượng aflatoxin cao hay thấp trong mẫu. 2.2.2.2 Chiết aflatoxin Mục đích: Tách aflatoxin cần tìm từ khối mẫu gồm nhiều chất phức tạp. Sự lựa chọn dung môi cho việc chiết mẫu tuỳ thuộc vào tính chất hóa học của aflatoxin cũng như tính chất của các thành phần khác. Đối với mẫu có thành phần béo từ 5% trở lên, sử dụng các dung môi: hexane, petrolium ether, ethyl dioxide, pentane hoặc isooctane nhằm tách chất béo trước khi tiến hành chiết aflatoxin. Chiết aflatoxin: do aflatoxin tan được trong các dung môi hơi phân cực và không tan trong những dung môi phân cực cao, nên chúng thường được chiết với các dung môi hữu cơ như dichloromethane, benzene, acetonitril, acetone, chloroform, hay methanol. Thông thường, hỗn hợp dung môi hoặc những dung môi với một lượng nhỏ nước và acid được thấy là hữu hiệu nhất. Trong khi độ hoà tan của aflatoxin trong nước thấp, dung môi có nước có thể thấm vào các mô ưa nước làm cho sự chiết tách hữu hiệu hơn. Quá trình này có thể thực hiện ở nhiệt độ phòng bằng cách lắc thông thường trong 30 phút hoặc dùng máy xay tốc độ cao trong 1-3 phút. Một số phương pháp chiết:  Chiết bằng dung môi chloroform-Phương pháp EEC (European Economic Community)  Chiết bằng dung môi methanol - Phương pháp BF (Best Food) - Phương pháp VICAM 23 2.2.2.3 Làm sạch mẫu Mục đích: Loại bỏ các hợp chất khác có thể hiện diện cùng aflatoxin trong dịch chiết mẫu để tránh ảnh hưởng đến việc xác định aflatoxin cũng như việc tạp chất sẽ làm bẩn cột, mất thời gian rửa cột và làm giảm tuổi thọ của cột. Các kĩ thuật làm sạch  Tủa các tạp chất không mong muốn: thường dùng để làm sạch các dịch chiết có nguồn gốc thực vật. Các hoạt chất dùng là các muối kim loại nặng, ví dụ Pb(CH 3 COO) 2 , AgNO 3 , Zn(CH 3 COO) 2 , CuCO 3 …  Phương pháp chiết pha lỏng-lỏng: thực hiện trong phễu chiết bằng cách chuyển aflatoxin từ dung môi chiết (acetone hay methanol) vào dung môi khác (ví dụ như chloroform).  Loại tạp bằng sắc kí hấp phụ: Kĩ thuật này hiện nay đã được phát triển và dùng rất nhiều do ưu điểm dễ sử dụng và hiệu quả loại tạp rất tốt trên nhiều loại mẫu khác nhau. Ví dụ, cột chiết xuất pha rắn SPE (solid-phase extraction) được chế tạo sẵn chứa các chất nhồi LC-CN có khả năng bắt tốt các aflatoxin ở hàm lượng thấp. Thể tích đưa vào cột rất ít (1-3ml), khả năng loại tạp rất cao, thích hợp cho phân tích bằng HPLC [12]. Tuy vậy, với những giá rắn từ các chất không phân cực như: C 18 , C 8 , C 2 , cyclohexyl, phenyl, florisil…liên kết với aflatoxin hoặc với các tạp chất theo cơ chế kỵ nước không có tính chọn lọc, phân giải kém trong nhiều trường hợp, và không lý tưởng khi aflatoxin chiếm tỉ lệ nhỏ so với tạp chất [14]. 2.2.2.4 Cô đặc mẫu Chất chiết sau khi được làm sạch thường được cô đặc bằng cách cho bốc hơi trong máy cô quay (Rotary Evaporator) dưới áp suất thấp hoặc dùng nồi chưng cách thủy dưới luồng khí nitơ nhẹ. Cặn được hòa tan vào một lượng thể tích nhỏ trước khi qua giai đọan xác định. 2.2.2.5 Phát hiện và xác định hàm lượng Các phương pháp sắc kí thường được sử dụng, dựa trên nguyên tắc phân tách giữa 2 pha: pha tĩnh và pha động (lỏng hoặc khí) khi cho chất cần tách qua lớp sắc kí. Pha tĩnh có tính liên kết với aflatoxin làm chậm sự di chuyển của các chất (do các đặc điểm lí hóa khác nhau) nên tạo ra sự phân biệt giữa chúng. 24 Bảng 2.5: Các phương pháp sắc kí trong phân tích aflatoxin. Phương pháp sắc kí Nguyên tắc Ưu điểm Nhược điểm Sắc kí cột nhỏ (Minicolumn) Cột thủy tinh hay PE có Ø= 5-6 mm, dài khoảng 20 cm được nhồi các lớp chất có tính hấp phụ độc tố: alumina, silicagel và florisil. Calcium sunphate có tính giữ nước được nhồi ở hai phía đầu. Cho mẫu chiết vào cột, chảy qua cột nhờ trọng lực. Lớp chất hấp phụ sẽ giữ AFT lại và ta phát hiện được khi cho cột chiếu dưới đèn UV λ= 365 nm, có vết huỳnh quang màu xanh tím ở lớp florisil. So sánh với một cột chuẩn chứa lượng AFT đã biết, ta có thể đánh giá mẫu chứa AFT ít hay nhiều hơn so với chuẩn. - tốn ít thời gian: 15-30 phút. - không cần thiết bị phức tạp, đắt tiền. - có thể dùng tiện lợi trên hiện trường - thích hợp ở các nước đang phát triển - là phương pháp bán định lượng nhanh nhằm đánh giá sơ bộ. - kém nhạy, mức phát hiện khá cao: 20 ppb. - Không phân biệt các AFT khác nhau. Sắc kí lớp mỏng (TLC) (TLC Pha tĩnh là một lớp mỏng chất có tính hấp phụ, thường là silicagel, được phết lên một bản mỏng (nhôm hoặc nhựa). Pha động là dung môi chứa chất cần khảo sát được cho chạy qua lớp mỏng chất hấp phụ nhờ lực mao quản. Dịch chiết được chấm lên bản mỏng thành các đốm với thể tích thường là 2, 5, 10 µl; đốm chuẩn cũng được nhỏ lên cùng bản mỏng. Sau đó, bản mỏng được cho vào dung môi khai triển để các đơn chất trong hỗn hợp có thể tách rời nhau khi di chuyển bằng lực mao quản. Việc phát hiện và định lượng tiến hành dưới tia UV có λ= 365nm. Dùng máy densitometer hay mắt để so sánh - tương đối đơn giản - thường sử dụng nhất ở các nước đang phát triển và trong các phòng thí nghiệm. - khá rẻ tiền so với HPLC. - Độ nhạy khá cao: 0,5-5 ppb. - kĩ thuật TLC 2 chiều cho kết quả rất tốt và mức phát hiện cũng thấp, có thể so sánh với HPLC. - mang tính bán định lượng. - kết quả phụ thuộc vào người phân tích. - độ chính xác không cao do lệ thuộc vào mắt người đọc. Densitometer cho độ chính xác cao hơn nhưng không thông dụng cho các phòng thí nghiệm địa phương. - sai số khoảng 30%. 25 2.2.3 Phương pháp miễn dịch học Phương pháp này dựa trên nguyên lí kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Vì aflatoxin là một phân tử nhỏ (hapten) nên nhiều phương pháp miễn dịch học thông thường (chẳng hạn “ELISA kẹp” (sandwich ELISA)) tỏ ra không hiệu quả. Để phát hiện aflatoxin, một phương pháp được sử dụng khá phổ biến hiện nay là phương pháp ELISA cạnh tranh (competitive ELISA), hoạt động theo quy tắc: AFT cần xác định cạnh tranh với một lượng cố định (AFT – enzyme) để liên kết đặc hiệu vào kháng thể đã được gắn trên pha rắn (polystyrene). Sau đó, các AFT - enzyme bị giữ lại được xác định bằng cách thêm vào một cơ chất có tính đổi màu khi phản ứng với enzyme. Cường độ màu tạo ra được đo bằng quang phổ kế, máy đọc (Elisa reader) hoặc bằng mắt. Nồng độ AFT - enzyme càng thấp thì nồng độ AFT trong mẫu càng cường độ sáng của các đốm mẫu và đốm chuẩn, từ đó suy ra nồng độ aflatoxin trong mẫu. Sắc kí lỏng cao áp (HPLC) Vì AFT có độ phân cực thấp nên thích hợp cho HPLC pha đảo. Cột sắc kí pha tĩnh có độ phân cực thấp sẽ có ái lực lớn với AFT, sẽ giữ hết AFT trên cột, dung môi pha động có độ phân cực cao sẽ tách lần lượt các AFT ra khỏi cột theo thứ tự độ phân cực của các AFT giảm dần. Việc tạo dẫn xuất trước qua cột với TFA hay sau qua cột với I 2 (hoặc Br 2 ) làm tăng khả năng phát hiện và định lượng. Sử dụng đầu dò hùynh quang với λ Exc. = 365 nm và λ Em. = 435 nm. Dựa vào thời gian lưu để định tính; dựa vào diện tích các peak của mẫu và chuẩn để xác định nồng độ AFT trong mẫu. - tự động hóa nhiều thao tác. - khả năng phân giải và phát hiện cao, độ nhạy: 0,1 ppb - cho kết quả định lượng tốt. - thiết bị đắt tiền. - tốn thời gian - dung môi, hợp chất chlor gây ô nhiễm môi trường. - cần dung môi siêu tinh khiết. 26 cao. Thông thường, người ta tạo một đường chuẩn (standard curve) và kết quả tính toán dựa trên kết quả đo lường cường độ màu của mẫu. Phương pháp này nhằm sàng lọc cùng một lúc nhiều mẫu. Ưu điểm của phương pháp là thực hiện dễ dàng; việc phân tích nhiều mẫu cùng lúc sẽ làm giảm chi phí cho xét nghiệm. Tuy nhiên, độ nhạy và khả năng lặp lại của phương pháp còn kém. Do đó, một phương pháp khác ra đời: phương pháp dùng sắc kí ái lực miễn dịch (Immunoaffinity Chromatography) để đồng thời cô đặc và tinh chế aflatoxin của mẫu cần thử nghiệm. 2.3 Sắc kí ái lực miễn dịch Qui trình phân tích aflatoxin của các phương pháp đề cập trên phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch và cô đặc. Việc định tính và định lượng aflatoxin dễ bị sai số do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn. Hơn nữa, với nhu cầu ngày càng lớn của công nghệ thực phẩm, yêu cầu về chất lượng cuộc sống ngày càng tăng, qui định về tiêu chuẩn an toàn thực phẩm ngày càng trở nên nghiêm ngặt; đặc biệt, trong giao dịch quốc tế, với nhu cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích, thì một kĩ thuật sắc kí mới ra đời, đó là sắc kí ái lực miễn dịch (IAC), sử dụng kháng thể đặc hiệu với aflatoxin(s) mang nhiều ưu điểm mà các phương pháp hóa lí không có được:  Mang tính chọn lọc, có khả năng loại trừ các tạp chất để đạt kết quả xét nghiệm đáng tin cậy. Ưu điểm này được xem là tiến bộ nhất.  Tỉ lệ thu hồi aflatoxin có tính thuyết phục rất cao.  Rất đơn giản  Thời gian phân tích nhanh  Sử dụng ít dung môi hữu cơ (chloroform ) nên thân thiện với môi trường.  Việc cô đặc và tinh chế aflatoxin xảy ra đồng thời. Aflatoxin tinh chế không kèm theo tạp chất như với các cột hoạt động theo qui tắc lí hóa.  Giá ái lực miễn dịch giữ hoạt tính ổn định ít nhất là 1 năm.  Việc đọc kết quả dễ dàng, ít bị nhầm lẫn cho kết quả dương tính giả. Bên cạnh đó, AFB1 là aflatoxin phổ biến nhất, có tính độc cao nhất và luôn xuất hiện trong bất kì quy định về mức nhiễm aflatoxin trong thực phẩm nào. Do vậy, kháng thể dùng trong sắc kí ái lực cần có tính đặc hiệu cao nhất đối với AFB1 . 27 Tạo huyết thanh thỏ kháng aflatoxin B 1 Tinh chế kháng thể Cộng hợp kháng thể lên giá thể Từ những cơ sở trên, việc sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt AFB1 đã được thực hiện và hoàn thành tại Viện Pasteur Tp.Hồ Chí Minh gồm những bước: (Xem chi tiết ở phụ lục 3).  Tạo huyết thanh thỏ kháng AFB1 Với bản chất là hapten, không có đặc tính sinh đáp ứng miễn dịch, không tạo kháng thể được nên aflatoxin phải cộng hợp với một protein giá, là albumin huyết thanh bò (BSA). Sự cộng hợp có thể là:  Dạng (H 2 N – protein): vị trí cộng hợp ở phía vòng dihydrofuran. Khi đó, kháng thể sẽ đặc hiệu với cấu trúc phía vòng cyclopentenone của AFB1.  Dạng (AFB1 – O – carboxymethyl oxim – protein): vị trí cộng hợp ở phía vòng cyclopentenone. Khi đó, kháng thể sẽ đặc hiệu với cấu trúc phía vòng dihydrofuran của AFB1, và chính ở vị trí này xảy ra phản ứng tạo độc. Do đó, sử dụng dạng cộng hợp này để tạo kháng thể. AFB1 - BSA conjugate được tiêm vào thỏ để gây miễn dịch trên thỏ. Khi đó, kháng thể tạo thành sẽ là  Kháng thể chống AFB1-BSA  Kháng thể chống AFB1 (IgG AFB1 )  Kháng thể chống BSA.  Kháng thể khác.  Tinh chế kháng thể chống AFB1 Cho huyết thanh thỏ chứa hỗn hợp các kháng thể thu được qua cột sắc kí ái lực miễn dịch với thành phần như sau: 28  Giá thể rắn (solid support hay matrix, chromatographic bed material): gel CNBr-activated Sepharose 4B.  Ligand: BSA. Khi đó, chỉ có các kháng thể chống AFB1 đi qua cột còn các loại kháng thể còn lại bị giữ lại do tương tác kháng nguyên – kháng thể của BSA.  Cộng hợp IgG AFB1 lên polymer CNBr-activated Sepharose 4B. Cột được qua thử nghiệm trên AFB1 đã cho kết quả 100% về khả năng thu hồi, tính lặp lại cao…cho thấy: sử dụng cột ái lực miễn dịch sản xuất tại Việt nam với tính hiệu quả cao và giá thành thấp hơn so với nhập ngoại sẽ đầy hứa hẹn trong tương lai. Sự đơn giản của quy trình chiết và tinh chế aflatoxin, sử dụng cột IAC: Chiết mẫu với dung môi MeOH/H 2 O, lọc qua giấy lọc. Dịch lọc được hòa loãng với nước rồi cho qua cột IAC, rửa cột với nước. Khi đó chỉ còn aflatoxin gắn vào kháng thể trên cột để sau đó được rửa giải bằng dung môi MeOH. AFT trong dịch rửa giải có thể được định lượng bằng phương pháp huỳnh quang hay TLC, hay được khẳng định trên HPLC. Tuy nhiên, việc phân tích AFB1 bằng IAC cũng không thể bỏ qua AFG1, một aflatoxin mà có lẽ độc tính và tác hại cúa nó chỉ đứng sau AFB1 mà thôi. Vì AFB1 và AFG1 có sự giống nhau về cấu trúc ở vòng dihydrofuran nên phản ứng chéo có thể xảy ra là điều dễ hiểu khi dùng IAC bắt AFG1. Hình 2.7: Nguyên lí hoạt động của cột ái lực miễn dịch (IAC). 29 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian: Từ 1/3/2005 – 1/8/2005 3.1.2 Địa điểm: Phòng Hoá miễn dịch - Viện Pasteur – Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu Cột IAC 2,5 (nồng độ kháng thể kháng AFB1 gắn lên cột bằng 2,5mg/ml gel) có khả năng bắt giữ AFB1 do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất. Cột: cột nhựa có kích thước 0,4 x 10cm. Gel: CN-Br activated sepharose 4B gắn kháng thể kháng AFB1 đặc hiệu (IgG-BSA). Lượng gel đóng trong cột là 0,1-0,15ml, được giữ trong đệm Tris-HCl 1M, pH = 7,4. Cột được bảo quản trong tủ lạnh (4 - 8 oC ). 3.2.1 Hoá chất Aflatoxin G 1 chuẩn (A0138 – Sigma). Methanol (CH 3 OH - MeOH) Chloroform (CHCl 3 ) Dung dịch Br 2 0.003% NaCl Tween 20 Hóa chất tẩy rửa Nước cất 2 lần khử ion 3.2.2 Dụng cụ Ống nghiệm Pipetman Eppendorf Bình Erlen Giấy lọc thường Lọc thuỷ tinh 30 3.2.3 Thiết bị sử dụng Máy quang phổ (U – 3310 Spectrophotometer – Hitachi). Máy đo huỳnh quang (Vicam – Series – 4 Fluorometer, USA) được thiết kế đặc biệt cho việc sử dụng cột IAC. Máy khuấy từ đứng (Stuart Scientific Stirrer SS10 – Made in UK). Máy lắc (Vortex), cân điện tử, tủ lạnh, thiết bị làm khô dưới luồng N 2 nhẹ. Tủ hút 3.3 Phương pháp nghiên cứu Aflatoxin là chất độc. Do đó, trong suốt quà trình thao tác, dù với dạng bột hay dung môi, người thao tác cần lưu ý:  Mang găng tay, áo blouse, khấu trang khi tiếp xúc với aflatoxin.  Bề mặt nơi làm việc phải được che phủ bằng các vật liệu chỉ dùng một lần.  Các dụng cụ thủy tinh sau khi thao tác xong phải rửa bằng các chất oxi hóa mạnh (chất tẩy hay hỗn hợp sulfochromic).  Phải luôn pha mới dung môi vì nó không ổn định.  Dung môi phải được giữ trong những thiết bị không thấm nước, đục, tránh ánh sáng và để trong tủ lạnh.  Để tránh thất thoát aflatoxin do bị hấp thu, tất cả thiết bị thủy tinh dùng trong thao tác phải được ngâm trong dung dịch acid loãng (HCl-1N) vài giờ, sau đó rửa và làm khô. 3.3.1 Các phương pháp phục vụ cho nghiên cứu 3.3.1.1 Quy trình tạo giá ái lực miễn dịch Dung dịch (1) H 2 O, NaN 3 0,05% (2) PBS, NaN 3 0,05% (3) Đệm carbonate: -NaHCO 3 0,1 M -NaCl 0,5 M -Thimerosal 0,01% (4) Tris – HCl 0,1 M NaCl 0,5 M pH = 8 (5) CH 3 COONa 0,1 M . IAC bắt AFG1. Hình 2. 7: Nguyên lí hoạt động của cột ái lực miễn dịch (IAC). 29 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3. 1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3. 1.1 Thời gian: Từ 1 /3/ 2005. kháng AFB1 gắn lên cột bằng 2,5mg/ml gel) có khả năng bắt giữ AFB1 do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất. Cột: cột nhựa có kích thước 0,4 x 10cm. Gel: CN-Br activated sepharose 4B gắn kháng thể kháng. kháng aflatoxin B 1 Tinh chế kháng thể Cộng hợp kháng thể lên giá thể Từ những cơ sở trên, việc sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt AFB1 đã được thực hiện và hoàn thành tại Viện Pasteur Tp. Hồ