37 mẫu của thỏ 4 và thỏ 5, không xuất hiện đường tủa ở mẫu của thỏ 3. Kết quả: mũi nhắc lại 1 của thỏ 4, thỏ 5 dương tính; mũi nhắc lại 1 của thỏ 3 âm tính. Tái kiểm tra mẫu kháng huyết thanh của thỏ 3 thu sau mũi nhắc lại 2, kết quả cho thấy có sự tạo thành kháng thể (hình 4.8). Tiếp tục thực hiện phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch với mẫu huyết thanh đối chứng và mẫu kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 3 của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 để xác nhận sự hiện diện của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB của các xét nghiệm ở trên, kết quả được minh hoạ qua hình 4.9, 4.10, 4.11. Hình 4.6: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 1) Hình 4.7: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (mũi nhắc lại 1) Đường tủa Hình 4.9: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (đối chứng + kháng huyết thanh) Hình 4.10: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (đối chứng + kháng huyết thanh) Đường tủa Hình 4.8: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 2) Đường tủa 38 Với kết quả trên, chúng tôi có thể kết luận quy trình gây miễn dịch dài ngày có hiệu quả. 4.1.3. Nhận xét Khi quan sát các kết quả phản ứng kết tủa khuếch tán kép trong thạch, chúng tôi nhận thấy rằng các đường kết tủa nằm gần về phía giếng chứa kháng huyết thanh hơn các giếng chứa protein MBP-VT2eB, điều đó cho thấy kháng thể được tạo ra không mạnh bằng kháng nguyên. Và khi quan sát sơ bộ các đường k ết tủa của hai quy trình, chúng tôi nhận thấy quy trình dài ngày tạo đáp ứng miễn dịch mạnh hơn quy trình ngắn ngày. Ở từng cá thể thỏ ghi nhận được trong:  Quy trình ngắn ngày: - Thỏ 1: có kết quả dương tính ở mũi nhắc lại lần 2. - Thỏ 2: có kết quả dương tính ở mũi nhắc lại lần 1.  Quy trình dài ngày: - Thỏ 3: có kết quả dương tính ở mũi nhắc lại l ần 2. - Thỏ 4: có kết quả dương tính ở mũi nhắc lại lần 1. - Thỏ 5: có kết quả dương tính ở mũi nhắc lại lần 1. Từ kết quả trên có thể kết luận cả hai quy trình gây miễn dịch ngắn và dài ngày đều tạo đáp ứng miễn dịch, kích thích cơ thể thỏ tạo kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Mặt khác, khả năng đáp ứng miễn dị ch của các cá thể là không như nhau đối với cùng một yếu tố kháng nguyên. Tóm lại cả hai quy trình đều gây miễn dịch có hiệu quả ở trên thỏ. • Giếng 1 chứa 50 µl kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 2. • Giếng 2 chứa 50 µl huyết thanh đối chứng thu trước khi tiêm kháng nguyên. • Giếng 3 chứa 10 µl protein MBP-VT2eB ở nồng độ pha loãng 1/8. Hình 4.11: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (đối chứng + kháng huyết thanh) Đường tủa 39 Quy trình Thỏ Đối chứng Mũi nhắc lại 1 Mũi nhắc lại 2 Ngắn ngày 1 2 - - - + + + Dài ngày 3 4 5 - - - - + + + + + Ở cả hai quy trình dài ngày và ngắn ngày, phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch đều cho phản ứng dương tính với kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 2. Bảng 4.1: Kết quả phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của 2 quy trình gây miễn dịch 40 Quy trình ngắn ngày (Thỏ 2 ) Quy trình dài ngày (Thỏ 5) a d b e c f Hình 4.12: Kết quả phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch của 2 quy trình gây miễn dịch a: Mẫu thỏ 2 mũi nhắc lại 1. b: Mẫu thỏ 2 mũi nhắc lại 2. c: Mẫu thỏ 2 mũi nhắc lại 3. d: Mẫu thỏ 5 mũi nhắc lại 1. e: Mẫu thỏ 5 mũi nhắc lại 2. f: Mẫu thỏ 5 mũi nhắc lại 3. • Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6 chứa 10 µ l protein MBP-VT2eB pha loãng từ nồng độ ban đầu đến nồng độ 1/32. • Giếng 7 chứa 10 µl kháng huyết thanh. 41 4.2. XÁC ĐỊNH LIỀU TCID 50 Trong các thí nghiệm nghiên cứu hoạt lực của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB, đầu tiên cần xác định liều TCID 50 trên môi trường tế bào vero. Độc tố VT2e được thu nhận từ huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn E. coli H28 trong 24g. Huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH5α trong 24g được sử dụng làm đối chứng (-)2. Độc tố VT2e được pha loãng bậc 10 từ nồng độ ½ đến nồng độ 1/2.10 5 trong môi trường DMEM. Sau đó tiến hành ủ độc tố đã pha loãng với tế bào vero trong 24 – 48g ở 37 o C, 5% CO 2 . Chúng tôi thực hiện phản ứng trung hoà độc tố với dịch độc tố VT2e và dịch canh khuẩn DH5α đã được lọc bằng màng lọc 0.45 µm. Sau 48g, quan sát dưới kính hiển vi soi ngược, chúng tôi thấy tế bào vero bị độc tố VT2e huỷ hoại. Những giếng dương tính là những giếng có sự phân tách tế bào. Tế bào bị huỷ hoại có hình tròn nhỏ, sậm màu hơn so với tế bào vero bình thường tuy nhiên với các giế ng có độ pha loãng độc tố thấp, chúng tôi quan sát thấy dưới đáy giếng vẫn còn nền tế bào bên dưới. Tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả bằng máy spectrophotometer ở bước sóng 620 nm. Nồng độ OD 620 nm % tế bào sống ½ 0,1228 11,187 1/20 0,1563 14,239 1/2x10 2 0,4185 38,139 1/2x10 3 0,9838 89,652 1/2x10 4 1,052 95,872 1/2x10 5 1,056 96,236 Đối chứng tế bào 1,0973 Bảng 4.2: Kết quả đo OD 620 mẫu nuôi cấy tế bào với dịch độc tố VT2e 42 Từ các kết quả đo OD 620 , chúng tôi xác định được liều TCID 50 dựa vào phương pháp Reed – Muench. =−× − − −= ))2/1log(( 139.38652.89 139.3850 )102log( 2 50 xTCID 0.25314 Nồng độ của độc tố VT2e gây chết 50% tế bào = 340/1 10 1 25314.0 = Chuẩn độ độc tố 0 50 100 150 1/2 1/200 1 /20000 Nồng độ độc tố pha loãng % tế bào sống Vậy liều TCID 50 của dịch lọc vi khuẩn E. coli 0139: K82 nuôi cấy trong môi trường LB trong 24g là ở nồng 1/340. Vậy liều 3TCID 50 là 3/340, chúng tôi sử dụng liều 3TCID 50 trong phản ứng trung hoà độc tố verotoxin trên môi trường tế bào vero. 4.3. PHẢN ỨNG TRUNG HOÀ ĐỘC TỐ VT2e TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO VERO Dựa vào kết quả của phản ứng chuẩn độ độc tố VT2e, chúng tôi thực hiện phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero. 4.3.1. Kiểm tra độ an toàn của kháng huyết thanh đối với tế bào vero Kháng huyết thanh sau khi thu hoạch phải được giữ ở -20 o C mới giữ được sự ổn định của kháng thể trong một thời gian dài, để bảo quản kháng huyết thanh ở điều kiện đơn giản hơn, ở 4 o C cần bổ sung NaN 3 vào kháng huyết thanh với nồng độ 0,05%. Tuy nhiên cần phải kiểm tra khả năng gây độc của NaN 3 đối với tế bào vero để tránh kết quả sai trong phản ứng trung hoà độc tố VT2e. Biểu đồ 4.1: Đồ thị chuẩn độ độc tố VT2e 43 4.3.1.1. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN 3 và tế bào vero Tiến hành thực hiện phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero với mẫu kháng huyết thanh có chứa NaN 3 với nồng độ 0,05%. Ghi nhận kết quả tại các thời điểm 24g và 48g.  Thời điểm 24g Các giếng đối chúng tế bào phát triển bình thường, tế bào trải đều thành một lớp dưới đáy giếng. Các giếng đối chứng độc tố: tế bào chết với hình thái chết do độc tố, một số tế bào chết với hình dạng co tròn, chuyển màu sậm hơn so vớ i thảm tế bào bên dưới. Các giếng chứa kháng huyết thanh pha loãng với liều 3TCID 50 : kết quả chưa rõ ràng, tế bào chết nhiều, co tròn và tụ thành cụm, vẫn còn thảm tế bào bên dưới.  Thời điểm 48g Các giếng đối chứng tế bào: tế bào phát triển bình thường, toàn bộ tế bào trải đều thành một lớp dưới đáy giếng. Các giếng đối chứng độc tố: tế bào chết hàng loạt với hình thái chết do độc tố. Các giếng chứa kháng huyế t thanh pha loãng: tế bào trong tất cả các giếng chết hàng loạt, co tròn, có màu sậm, thảm tế bào bên dưới chết hoàn toàn. Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy có thể tế bào vero chết do các nguyên nhân sau: - Tác động của NaN 3 . - Kháng huyết thanh chưa bất hoạt. Để tìm ra nguyên nhân gây chết tế bào, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trung hoà độc tố với mẫu kháng huyết thanh này nhưng có bất hoạt ở 56 o C trong 30 phút. 4.3.1.2. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN 3 và có bất hoạt Tiến hành thực hiện phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero với mẫu kháng huyết thanh có chứa NaN 3 với nồng độ 0,05% và bất hoạt ở 56 o C trong 30 phút. Ghi nhận kết quả tại các thời điểm 24g và 48g. 44  Thời điểm 24g Các giếng đối chúng tế bào phát triển bình thường, tế bào trải đều thành một lớp dưới đáy giếng. Các giếng đối chứng độc tố: tế bào chết với hình thái chết do độc tố, một số tế bào chết với hình dạng co tròn, chuyển màu sậm hơn so với thảm tế bào bên dưới. Các giếng chứa kháng huyết thanh: có hiện tượng tế bào chế t hàng loạt, thảm tế bào dưới đáy giếng vẫn còn.  Thời điểm 48g Các giếng đối chứng tế bào: tế bào phát triển bình thường, toàn bộ tế bào trải đều thành một lớp dưới đáy giếng. Các giếng đối chứng độc tố: tế bào chết hàng loạt với hình thái chết do độc tố. Các giếng chứa kháng huyết thanh pha loãng: sau 48g nuôi cấy tế bào chết hàng loạt. Mặc dù kháng huyết thanh đã được bất hoạt nhưng tế bào vero vẫn chết, do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá tác động của NaN 3 . 4.3.1.3. Thí nghiệm đánh giá tác động của NaN 3 Tiến hành ủ kháng huyết thanh có bổ sung NaN 3 có nồng độ 0,05% với tế bào vero. Sau 24g, tế bào vero chết hàng loạt với các đặc điểm: tế bào co tròn nhưng có đường kính lớn hơn so với tế bào chết co tròn do độc tố, tụ thành từng cụm, thảm tế bào chết hoàn toàn. Qua những thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy tế bào vero chịu tác động của cả hai nguyên nhân: tác động của NaN 3 và kháng huyết thanh chưa bất hoạt. Từ những kết quả trên, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với mẫu kháng huyết thanh không bổ sung NaN 3 và có bất hoạt. 4.3.1.4. Kháng huyết thanh không bổ sung NaN 3 và có bất hoạt Tiến hành thực hiện phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero với mẫu kháng huyết thanh thỏ 4 (lấy vào ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) không bổ sung NaN 3 và có bất hoạt ở 56 o C trong 30 phút. Ghi nhận kết quả tại các thời điểm 24g và 48g. Sau 48g, tiến hành nhuộm tế bào và đọc kết quả bằng máy spectrophotometer ở bước sóng 620 nm. 45  Hình thái tế bào khi quan sát dưới kính hiển vi ở thời điểm 24 – 48g  Thời điểm 24g Ở các giếng đối chứng tế bào: tế bào phát triển tốt. Ở các giếng đối chứng độc tố (đối chứng (-)), tế bào chết co tròn, rải rác, sậm màu hơn so với thảm tế bào. Ở các giếng chứa kháng huyết thanh, tế bào có chết nhưng hình thái vẫn chưa rõ ràng.  Thời điểm 48g Ở các giếng đối chứng tế bào: tế bào phát triển tốt. Ở các giếng đối chứng độc tố: tế bào chết hàng loạt, co tròn, sậm màu hơn so với thảm tế bào còn ít bên dưới. Ở các giếng chứa kháng huyết thanh có hiện tượng tế bào chết giống như các giếng đối chứng (-). Ở các giếng có nồng độ pha loãng kháng huyết thanh cao, tế bào được bảo hộ chống lại tác động của độc tố nhiều hơn các giếng có độ pha loãng kháng huyết thanh thấp.  Chỉ số OD 620 nm Nồng độ OD 620 % tế bào sống ½ 1,118 88,24 ¼ 1,089 85,95 1/8 1,1 86,82 1/16 1,039 82 1/32 0,8685 68,55 1/64 0,6885 54,34 1/128 0,4675 36,89 Đối chứng tế bào 0,8697 Đối chứng huyết thanh 1,267 Đối chứng độc tố 0,1287 Bảng 4.3: Kết quả đo OD 620 của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) 46 Từ trên những chỉ số đo OD 620 trên, ta xác định được nồng độ kháng huyết thanh ở đó 50% tế bào được bảo vệ (TCID 50 ) là 8819.1))2/1log(( 0341.54 050 )128log( 50 =−× − − −=TICD Hiệu giá kháng thể trung hoà = 76/1 10 1 8819.1 = 0 20 40 60 80 100 1 / 2 1 / 4 1 / 8 1 / 1 6 1 / 3 2 1 / 6 4 1 / 1 2 8 Nồng độ kháng huyết thanh pha loãng % Tế bào sốn g 4.3.2. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero Tiến hành thực hiện phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero với các mẫu kháng huyết thanh không bổ sung NaN 3 và có bất hoạt. Do toàn bộ mẫu kháng huyết thanh thu nhận từ quy trình ngắn ngày đều có chứa NaN 3 nên chúng tôi dùng mẫu kháng thể đã qua thẩm tích trong dung dịch PBS - để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố VT2e. Đối với quy trình dài ngày, chúng tôi sử dụng mẫu kháng huyết thanh thu nhận sau mũi nhắc lại 3 và nhắc lại 4 để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố VT2e. Sử dụng liều độc tố VT2e là 3 TCID 50 . Trong quá trình tiếp tục tiến hành thí nghiệm, mặc dù các mẫu thí nghiệm đã được lọc bằng màng lọc 0,45µm nhưng các kết quả thu nhận được mẫu bị nhiễm. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm lại với những mẫu đã bị nhiễm hoàn toàn, các mẫu này đuợc lọc qua màng lọc 0,2µm. Sau 48g thì nhận thấy các mẫu không bị nhiễm, đo OD 620 và đánh giá kết quả. Biểu đồ 4. 2: Đồ thị trung hoà độc tố VT2e của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) trên môi trường tế bào vero . thể kết luận cả hai quy trình gây miễn dịch ngắn và dài ngày đều tạo đáp ứng miễn dịch, kích thích cơ thể thỏ tạo kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Mặt khác, khả năng đáp ứng miễn. 62 0 nm Nồng độ OD 62 0 % tế bào sống ½ 1,118 88,24 ¼ 1,089 85,95 1/8 1,1 86, 82 1/ 16 1,039 82 1/32 0, 868 5 68 ,55 1 /64 0 ,68 85 54,34 1/128 0, 467 5 36, 89 Đối chứng tế bào 0, 869 7 Đối. b: Mẫu thỏ 2 mũi nhắc lại 2. c: Mẫu thỏ 2 mũi nhắc lại 3. d: Mẫu thỏ 5 mũi nhắc lại 1. e: Mẫu thỏ 5 mũi nhắc lại 2. f: Mẫu thỏ 5 mũi nhắc lại 3. • Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6 chứa 10 µ l protein