19 Hình 3.3.3 – Cấu trúc hóa học của Coommassie Brilliant Blue G-250 Sự lựa chọn protein chuẩn cho phương pháp này cũng ảnh hưởng nhiều đến kết quả. Đối với mỗi protein được định lượng nên có một protein chuẩn thích hợp. BSA là một protein chuẩn thường được lựa chọn và kết quả là tương đối với BSA.  Cách thực hành: Xác định đường chuẩn theo nồng độ protein chuẩn (BSA). Dung dịch BSA có nồng độ 200 µg/ ml. Thực hiện đường chuẩn độ protein tương đối với BSA. Chuẩn bị mẫu protein tinh chế. Pha loãng mẫu sao cho sự quan sát có đựơc nằm trong giới hạn cho phép của đường chuẩn. Thứ tự các chất cho vào giếng: nước cất, BSA chuẩn (hoặc mẫu protein), dung dịch Bradford 4X. Trộn đều các chất trong giếng (tránh tạo bọt), để phản ứng trong 5 phút. Đo bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 595 nm. Xử lý số liệu bằng phần mềm KC4 và Microsoft Excel 2003. 20 Bảng 3.3.3 – Tổ chức thực hiện đƣờng chuẩn protein theo nồng độ BSA. Giếng Lƣợng BSA(µg) V ( BSA) (200µg/ml)(µl) Nƣớc cất hai lần (µl) Dung dịch Bradford 4X (µl) A 1 0 0 180 60 A 2 0 0 180 60 B 1 1 5 175 - B 2 1 5 175 - C 1 2 10 170 - C 2 2 10 170 - D 1 4 20 160 - D 2 4 20 160 - E 1 6 30 150 - E 2 6 30 150 - F 1 8 40 140 - F 2 8 40 140 - 21 3.3.4 Điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn [9,16] Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) được Laemmli (1970) phát triển từ sự hiệu chỉnh bằng cách thêm 0,1% SDS (chất tẩy mang điện tích âm) vào hệ PAGE của Ornstein- Davis (1964) nhằm xác định trọng lượng phân tử các loại protein trong phổ điện di; xác định thành phần và độ sạch của chế phẩm protein trong quá trình được tinh chế (Davis E.Garfin 1995) [16]. Trong kỹ thuật này, protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfide là mercaptoethanol hoặc dithiolthretol (DTT). Với các tác nhân này, protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả protein đều được tích điện âm. Tỷ lệ lượng SDS bám được vào protein là không thay đổi: SDS/ protein (g/g) =1,4 Tổ chức của phức hợp protein-SDS cấu tạo thành một hình bầu dục dài (ellipsoid) với các cực âm của các nhóm sulfate ở phía ngoài. Protein càng lớn, bầu dục càng dài. Do đó, có sự liên quan giữa trọng lượng phân tử của protein với tốc độ di chuyển của các protein trong môi trường có SDS cho đường biễu diễn tuyến tính log.(M.W.) = ax + b (chiều dài đường di). Công thức này cho thấy trọng lượng phân tử (M.W) càng lớn, đường đi càng ngắn, tức a < 0 và cắt các cầu nối S-S là cần thiết để đảm bảo quy luật trên. Tốc độ di chuyển của một protein trong phương pháp điện di dựa trên sự khác nhau về điện tích, kích thước lỗ gel, trọng lượng phân tử, cường độ điện trường, thời gian điện di, nhiệt độ… Các thành phần được sử dụng để xây dựng nên giá thể đa phân (polymer) là acrylamide, N,N’-methylene-bis (acrylamide), tetramethylenediamine (TEMED) và ammonium persulfate. 22 Hình 3.3.4.1 – Các thành phần đƣợc sử dụng để tạo gel polyacrylamide Khi ammonium persulfate bị phân ly trong nước, nó hình thành nên các gốc tự do: S 2 O 8 2- → 2SO 4 2- Nếu các gốc tự do này được tiếp xúc với acrylamide, gốc tự do trong phân tử acrylamide được hình thành. Sau đó acrylamide được hoạt hóa này sẽ phản ứng với các phân tử acrylamide khác để tạo ra một chuỗi đa phân dài. Hình 3.3.4.2 – Phản ứng chuỗi đa phân hóa acrylamide 23 Sự hình thành gel đòi hỏi các chuỗi đa phân này liên kết chéo với nhau. Hợp chất N,N’-methylene-bis (acrylamide) sẽ giúp tạo phản ứng đa phân hóa các chuỗi acrylamide. Hình 3.3.4.3 – Phản ứng tạo liên kết chéo nối hai sợi đa phân acrylamide Kích thước lỗ gel được xác định bởi hai thông số: (1) nồng độ acrylmide( C%) ; (2) mức độ liên kết chéo (T%). C%= Nồng độ Bis, (g) / Nồng độ acrylamide, (g) T%= Nồng độ acrylamide (g)– Bis, (g) / Thể tích, (ml) Thông thường C% ít được quan tâm, người ta quan tâm đến thông số T% nhiều hơn. Sự thay đổi T% làm cho khoảng trống của gel thay đổi, T% càng tăng lưới sàng lọc phân tử càng dày đặc, các phân tử lớn khó hoặc không chuyển qua được. Sự có mặt của SDS sẽ làm cho các phân tử protein khi đi qua gel được bọc bởi một lớp điện tích âm. Khi điện di các phân tử protein được di chuyển từ cực âm sang cực dương và đồng thời cũng là di chuyển từ lớp gel có khoảng trống của lưới phân tử to đến lớp có khoảng trống của lưới phân tử nhỏ. Những phân tử có kích thước lớn sẽ di 24 chuyển chậm hơn phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Với sự di chuyển này, các phân tử protein sẽ được phân tách trên băng điện di hoàn toàn theo trọng lượng phân tử. Trong thực tế để xác định trọng lượng phân tử của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã được biết. Với mục đích đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di gel không liên tục. Ở phương pháp này, gel thường có hai lớp: lớp trên (gel tập trung), lớp dưới (gel phân tách). Hai lớp gel này khác nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide.  Cách tiến hành: Chuẩn bị tấm kính để đổ gel Chuẩn bị một gel polyacrylamide có nồng độ acrylamide là 12 % theo bảng sau: Bảng 3.3.4 – Cách chuẩn bị một gel polyacrylamide 12%T Separating gel Stacking gel 2,64 ml H 2 O 1,5 ml dung dịch 3 60µl dung dịch 5 1,8 dung dịch 1 TEMED 100 µl APS 130 µl 2 ml dung dịch 2 1 ml dung dịch 4 40 µl dung dịch 5 0,96 ml H 2 O 50 µl TEMED 100 µl APS Bề mặt gel phân giải: + Isobutanol hoặc 0,5 ml dung dịch 3 + 20 µl dung dịch 5 + 1,48 ml H 2 O 25 Sau khi đổ gel phân tách (separating gel) trước, ta cho bultanol vào để nén bằng mặt gel. Lưu ý không để tạo bọt khí. Sau khi gel đông, ta rửa lớp butanol bằng nước cất. Sau đó tiếp tục đổ gel tụ chùm (stacking gel). Các giếng được đặt ở lớp gel tụ chùm nhờ lược. Sau khi gel trùng ngưng xong, tiến hành lấy lược ra và lắp gel vào bình điện di. Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thử sau khi xác định được nồng độ sẽ được trộn với dung dịch pha mẫu theo tỷ lệ 1:1 và xử lý mẫu bằng cách đun cách thủy trong vòng năm phút. Chuẩn bị máy điện di: pha dung dịch đệm bình điện di. Mẫu được nạp vào giếng, tiến hành chạy điện di (80V; 40 mA; 2giờ 45 phút). Sau khi điện di, nhuộm Coomassive trong 10 phút. Sau đó tiến hành tẩy bằng cách ngâm gel trong dung dịch tẩy cho đến khi nền gel trở nên trong suốt. Thay mới dung dịch thuốc tẩy khi dung dịch này có màu tương đương với màu trong nền gel. Xem kết quả.  Trường hợp điện di để xác định hoạt tính protease trong dịch tiết của sán lá gan ta tiến hành tương tự chỉ khác là thêm cơ chất gelatine 0,1% vào gel phân tách và không có xử lý mẫu để tránh làm biến tính protease trong mẫu. Sau khi điện di ngâm trong Triton 2,5% hai lần mỗi lần 30 phút. Ngâm trong dung dịch hoạt hóa EDTA 1mM, glycine 0,1 M, L-cystein 10mM pH = 8 trong 30 phút. Thay nước ngâm tiếp bằng dung dịch trên để qua đêm. Sau đó tiến hành nhuộm và tẩy tương tự như điện di thường. 26 3.3.5 Phƣơng pháp miễn dịch khuếch tán kép (Immunodiffusion) Đây là kỹ thuật đơn giản nhất nhằm phát hiện khả năng ngưng kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Ta sử dụng protein tiết từ sán làm kháng nguyên, phát hiện kháng thể đặc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân bị nhiễm bệnh. Sau đó so sánh với kháng nguyên thân của F. gigantica xem loại kháng nguyên nào đặc hiệu hơn với kháng thể của Fasciola sp. Kháng nguyên thân của F. gigantica được chuẩn bị như sau: 1,288 g sán cho vào thêm 2 ml đệm PBS 1X rồi dùng máy sonicator nghiền. Sán sau khi nghiền, ta đem ly tâm 3500 vòng/50 phút/ 4 0 C. Rồi thu lấy dịch nổi được xem như kháng nguyên thân. Kỹ thuật thường được thực hiện trên đĩa thạch agar hoặc trên phiến kính chứa agar, trong đó kháng nguyên và kháng thể khuếch tán tự do về phía nhau và tạo ra các đường cong kết tủa: Nếu chỉ có một đường kết tủa xuất hiện sẽ cho biết các loại kháng nguyên giống nhau hoặc đồng nhất. Nếu có hai đường kết tủa xuất hiện bắt chéo nhau và cách biệt, chỉ rõ không có phản ứng chéo, hai kháng nguyên khác nhau. Nếu tạo thành một đường kết tủa dạng “cựa gà” cho thấy hai loại kháng nguyên có chung một quyết định kháng nguyên nhưng cũng có những quyết định kháng nguyên khác nhau, nghĩa là giống nhau chỉ một phần. Hình 3.3.5 – Phân tích kết quả từ các miễn dịch khuếch tán kép trên thạch agarose (Ouchterlony) [9] 27  Cách tiến hành: 1g agarose được làm tan trong 100 ml đệm PBS 1X, pH = 7,2. Đun đến khi agarose tan hoàn toàn. Đổ thạch 6,5 cm x 6 cm, dày 3 mm trên tấm phim trong, tạo các giếng trên thạch. Sau đó cho kháng nguyên và kháng thể vào giếng tương ứng. Đặt thạch vào buồng ẩm ở 4 0 C. Khoảng 24 – 48 giờ sau quan sát đường tủa, ép khô thạch và nhuộm với đỏ Ponceau S 0,2%. Sau đó rửa nước và để khô tự nhiên. 3.3.6 Quy trình tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch để tinh chế kháng thể đặc hiệu với protein tiết của sán lá gan lớn  Chuẩn bị kháng thể (IgG): Kháng thể kháng Fasciola sp dưới dạng tủa trong (NH 4 ) 2 SO 4 45%S được thẩm tích trong dung dịch NaN 3 0,05% một lần và trong dung dịch đệm PBS hai lần nhằm loại hết ammonium sunfate. Đo OD 280 để xác định nồng độ kháng thể thu được.  Chuẩn bị gel: CN-Br activated Sepharose 4B ( 1g gel khô trương nở thành 3,5 ml gel) được rửa trong dung dịch HCl 1 mM, pH = 3 (200 ml/ g gel) nhằm làm tan dextran, lactose bảo vệ nhóm –CN + .  Cộng hợp kháng nguyên tiết – Sepharose 4B: Cho dung dịch kháng nguyên tiết pha trong đệm carbonate vào gel đã trương nở (theo thể tích là 1: 1), lắc 2 giờ ở nhiệt độ phòng để qua đêm, tiến hành ly tâm thu dịch nổi đem đo OD 280 nhằm kiểm tra hiệu suất gắn vào gel của kháng nguyên tiết. Rửa tủa với đệm carbonate (dd3) ba lần, sau đó rửa với Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,5 M (đệm Tris – dd4) và NaCl 0,5M, CH 3 COONa 0,1 M (dd5) ba lần để loại bỏ hết các kháng nguyên tiết không bám vào gel và loại các amin của Tris phản ứng với –CN + còn thừa trong gel, rửa lại lần cuối với Tris-HCl 0,1 M, NaN 3 0,05%, NaCl 0,5M (dd6).  Nén cột: Xử lý cột: Cho đệm Tris vào đầy cột. Xử lý frit với ethanol 100% trong 2 – 3 phút, nén frit vào cột, rửa lại cột đã có frit nhiều lần bằng đệm Tris. Nén cộng hợp kháng nguyên tiết – Sepharose 4B vào cột: Cho hỗn dịch gel vào becher sạch, khuấy đều hỗn dịch rồi dùng pipet hút lên cho vào . kháng nguyên và kháng thể. Ta sử dụng protein tiết từ sán làm kháng nguyên, phát hiện kháng thể đặc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân bị nhiễm bệnh. Sau đó so sánh với kháng nguyên thân của F. gigantica. gan lớn  Chuẩn bị kháng thể (IgG ): Kháng thể kháng Fasciola sp dưới dạng tủa trong (NH 4 ) 2 SO 4 45%S được thẩm tích trong dung dịch NaN 3 0,05% một lần và trong dung dịch đệm PBS hai. 35 00 vòng/50 phút/ 4 0 C. Rồi thu lấy dịch nổi được xem như kháng nguyên thân. Kỹ thu t thường được thực hiện trên đĩa thạch agar hoặc trên phiến kính chứa agar, trong đó kháng nguyên và kháng