BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN QUANG TÙNG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH THU GOM, XỬ LÝ, BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU DÙNG CHO GHÉP ĐỒNG LOẠI LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Hà Nội - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN QUANG TÙNG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH THU GOM, XỬ LÝ, BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU DÙNG CHO GHÉP ĐỒNG LOẠI LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Chuyên ngành: Huyết học Mã số : 62.72.25.01 Hướng dẫn khoa học: GS. TSKH. Đỗ Trung Phấn Hà Nội - 201 1 Luận án là sản phẩm đào tạo của Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu gom, xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép tủy đồng loại” do GS.TSKH. Đỗ Trung Phấn làm chủ nhiệm. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những số liệu trong luận án này là công trình nghiên cứu của tôi, thuộc đề tài cấp Bộ Y tế. Các số liệu được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ bản luận án nào. Tác giả luận án Nguyễn Quang Tùng Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ to lớn, nhiệt tâm, đầy trách nhiệm và tình cảm của các Thày, Cô, các bạn đồng nghiệp, bạn bè và gia đình, đặc biệt là những người tình nguyện tham gia nghiên cứu, những bà mẹ tình nguyện hiến mẫu máu dây rốn của con mình trong nghiên cứu này. Với tình cảm và sự biết ơn sâu sắc, tôi xin kính gửi những lời cảm ơn chân thành nhất đến: Đảng ủy, Ban giám hiệu Trường đại học Y Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. Vụ Khoa học-Đào tạo Bộ Y tế và tập thể các nhà khoa học tham gia đề tài NCKH cấp Bộ “Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu gom, xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép tủy đồng loại” đã không quản vất vả, hỗ trợ và cùng tôi triển khai các công việc của đề tài đạt kết quả tốt. Phòng Quản lý đào tạo sau đại học, Quản lý nghiên cứu khoa học đã luôn tạo điều kiện thuận lợi, nhắc nhở, động viên tôi trong quá học tập, nghiên cứu. Bộ môn Huyết học-Truyền máu trường Đại học Y Hà Nội, những Thày, Cô, bạn bè đồng nghiệp luôn dành cho tôi sự hỗ trợ tuyệt vời, những động viên, chia xẻ giúp tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành công việc. Tập thể Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương, các Thày, Cô, anh chị em trong các khoa Miễn dịch-Di truyền, Thu gom, Sản xuất, Sàng lọc, Tế bào, Đông máu và các khoa Lâm sàng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện tốt các quy trình kỹ thuật của nghiên cứu. Tập thể khoa Huyết học, khoa Truyền máu bệnh viện trung ương quân đội 108 đã tạo điều kiện và trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nhiều quy trình kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu. Tập thể khoa Sản-bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi trong việc thu gom các mẫu máu dây rốn. Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc nhất đến GS.TSKH. Đỗ Trung Phấn, người Thày kính mến đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu học tập theo chuyên ngành Huyết học-Truyền máu, đã dành cho tôi những tình cảm tốt đẹp, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. PGS.TS. Phạm Quang Vinh, PGS.TS. Nguyễn Anh Trí – những người Thày, người Anh đã luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất, khuyến khích và chỉ bảo cho tôi trong công việc, học tập và nghiên cứu. Xin cám ơn các Thày, Cô, các anh chị em đã dành cho tôi những đóng góp quý báu trong quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận án này. Cám ơn gia đình, Cha Mẹ, vợ con thân yêu, anh em ruột thịt, đã luôn tin tưởng, hy sinh và hỗ trợ không mệt mỏi để tôi có thể tập trung và cố gắng hoàn thành tốt công việc và nghiên cứu khoa học. Một lần nữa, xin gửi lời cám ơn sâu sắc nhất tới những người bạn đã tình nguyện tham gia nghiên cứu, vượt qua cảm giác đau đớn để hiến các mẫu tế bào gốc từ máu ngoại vi, hiến những mẫu dịch tủy quý giá. Xin cảm ơn các bà mẹ đã tình nguyện hiến những mẫu máu rốn của đứa con mình với hy vọng sẽ góp phần nhỏ bé để nâng cao chất lượng điều trị cho người bệnh. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm Tác giả luận án Nguyễn Quang Tùng Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Bảng chữ viết tắt Danh sách các bảng Danh sách các đồ thị, biểu đồ và sơ đồ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Khái niệm và xếp loại tế bào gốc 3 1.1.1. Khái niệm về tế bào gốc 3 1.1.2. Xếp loại tế bào gốc 3 1.2. Tế bào gốc trong quá trình tạo máu 9 1.2.1. Đặc điểm tế bào gốc tạo máu 9 1.2.2. Nguồn gốc tế bào gốc tạo máu 10 1.2.3. Các phương pháp xác định tế bào gốc tạo máu 11 1.2.4. Ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc tạo máu 14 1.3. Nguồn cung cấp và thu gom tế bào gốc tạo máu 16 1.3.1. Tế bào gốc tạo máu sau huy động ra máu ngoại vi 17 1.3.2. Tế bào gốc tạo máu từ tủy xương 24 1.3.3. Tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn 25 1.3.4. Ứng dụng và lựa chọn các nguồn tế bào gốc tạo máu 26 1.4. Xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu 28 1.4.1. Xử lý tế bào gốc tạo máu sau thu gom 29 1.4.2. Bảo quản tế bào gốc tạo máu 32 1.4.3. Đánh giá và kiểm tra chất lượng chế phẩm tế bào gốc 34 1.4.4. Ngân hàng tế bào gốc tạo máu 35 1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam 36 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Đối tượng nghiên cứu 39 2.1.1. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu ngoại vi 39 2.1.2. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ tủy xương 40 2.1.3. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu dây rốn 41 2.2. Phương pháp nghiên cứu 43 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu và trang thiết bị, sinh phẩm 43 2.2.2. Tiến hành nghiên cứu 47 2.2.3. Các biến số nghiên cứu 53 2.3. Địa điểm tiến hành nghiên cứu 54 2.4. Xử lý số liệu 54 2.5. Khía cạnh đạo đức của nghiên cứu 55 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3 .1. Kết quả thu gom tế bào gốc tạo máu từ các nguồn khác nhau 56 3.1.1. Kết quả thu gom từ máu ngoại vi 56 3.1.2. Kết quả thu gom từ dịch hút tủy xương 71 3.1.3. Kết quả thu gom từ máu dây rốn 74 3.2. Kết quả xử lý các mẫu sản phẩm tế bào gốc tạo máu 80 3.2.1. Kết quả loại bỏ hồng cầu 80 3.2.2. Kết quả thu hồi tế bào CD34 sau xử lý 84 3.3. Kết quả nghiên cứu bảo quản tế bào gốc tạo máu ở - 196 0 C 87 3.3.1. Số lượng tế bào có nhân sau rã đông 87 3.3.2. Tỷ lệ tế bào sống theo thời gian sau khi rã đông 87 3.4. Đặc điểm tế bào huyết học-miễn dịch và tế bào gốc tạo máu của các sản phẩm từ các nguồn cung cấp khác nhau 89 3.4.1. Đặc điểm tế bào máu của các sản phẩm 89 3.4.2. Đặc điểm tế bào miễn dịch của các sản phẩm 91 3.4.3. Đặc điểm về tế bào gốc tạo máu của các sản phẩm 92 Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Về quy trình và kết quả thu gom tế bào gốc tạo máu 95 4.1.1. Thu gom tế bào gốc từ máu ngoại vi không huy động 95 4.1.2. Thu gom tế bào gốc từ máu ngoại vi huy động bằng G-CSF 99 4.1.3. Thu gom tế bào gốc từ tủy xương 105 4.1.4. Thu gom tế bào gốc từ máu dây rốn 109 4.2. Về quy trình và kết quả xử lý các mẫu tế bào gốc tạo máu 115 4.2.1. Loại hồng cầu bằng phương pháp ly tâm đơn thuần 116 4.2.2. Loại hồng cầu có sử dụng dung dịch cao phân tử 117 4.2.3. Hiệu quả giảm thể tích mẫu và thu hồi tế bào gốc 120 4.3. Về quy trình và kết quả bảo quản tế bào gốc tạo máu 122 4.3.1. Quy trình bảo quản 122 4.3.2. Kết quả bảo quản và những biến đổi tế bào 123 4.4. Về đặc điểm huyết học, miễn dịch và khả năng tạo máu 125 4.4.1. Một số đặc điểm tế bào máu của các mẫu tế bào gốc 126 4.4.2. Một số đặc điểm tế bào miễn dịch của các mẫu tế bào gốc 128 4.4.3. Tế bào gốc và khả năng tạo máu của các mẫu tế bào gốc 131 KẾT LUẬN 136 KIẾN NGHỊ 138 ĐÓNG GÓP CỦA LUẬN ÁN Danh mục các bài báo và công trình nghiên cứu Tài liệu tham khảo Phụ lục CHỮ VIẾT TẮT ACD Adenosin citrate dextrose Activated partial thromboplastin time (thời gian hoạt hóa thromboplastin từng phần) APTT ASC adult stem cells (tế bào gốc người trưởng thành) BCRP breast cancer-resistance protein (protein chống ung thư phế quản) BFU-E Burst forming unit-erythrocyte (đơn vị tạo ồ ạt hồng cầu) BMSC Bone marrow stem cells (tế bào gốc tủy xương) CBSC Cord blood stem cells (tế bào gốc máu dây rốn) CD Cluster of differenciation (cụm kháng nguyên biệt hóa) CFC colony-forming cells (kỹ thuật tạo cụm tế bào) CFU-G Colony forming unit-granulocyte (đơn vị tạo cụm dòng bạch cầu hạt) CFU- GEMM Colony forming unit-granulocyte, erythrocyte, monocyte and marcophage (đơn vị tạo cụm đa dòng) CFU-S colony forming unit-spleen (đơn vị tạo cụm lách) CPD Citrat-phosphat-dextrose (thành phần của dung dịch bảo quản hồng cầu) CSC cancer stem cell (tế bào gốc ung thư) DLI Donor lymphocyte infusion (truyền lympho của người cho) DMSO Dimethylsulfoxide E-LTC-IC Extended-long-term culture-initiating cell (kỹ thuật nuôi cấy tế bào dài hạn cải tiến) EPC endothelial stem/progenitor cell (tế bào gốc/định hướng nội mạc) ES embryonic stem cell (tế bào gốc phôi) FSC fetal stem cells (tế bào gốc bào thai) G-CSF Granulocyte-colony stimulating factor (yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu hạt) GM-CFU Granulocyte, Monocyte-colony forming unit (đơn vị tạo cụm dòng bạch cầu hạt và bạch cầu mono) GM-CSF Granulocyte, Monocyte-colony stimulating factor (yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu hạt và bạch cầu mono) GMP granulocyte-monocyte precursors (tế bào đầu dòng hạt-mono). GVHD Graft versus host disease (bệnh ghép chống chủ) HGF hepatocyte growth factor (yếu tố kích thích tế bào gan) [...]... công trình nghiên cứu công bố về quy trình thu gom, xử lý và bảo quản dài hạn các mẫu tế bào gốc tạo máu từ các nguồn cung cấp chủ yếu còn ít và chưa hệ thống Xuất phát từ thực tế này, đề tài Nghiên cứu ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý, bảo quản tế bào gốc tạo máu dùng cho ghép đồng loại được tiến hành với các mục tiêu: 1 Ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý và bảo quản. .. tế bào gốc tạo máu từ máu ngoại vi, dịch tủy xương và máu dây rốn 2 Đánh giá khả năng tạo cụm của tế bào gốc tạo máu và đặc điểm tế bào miễn dịch của các mẫu tế bào gốc từ máu ngoại vi, dịch tủy xương và máu dây rốn 3 Chương 1 1.1 TỔNG QUAN KHÁI NIỆM VÀ XẾP LOẠI TẾ BÀO GỐC 1.1.1 Khái niệm về tế bào gốc Đặc điểm cơ bản của tế bào gốc là khả năng tự tái tạo (self-renewal) và biệt hoá thành các dòng tế. .. lượng và số lượng tế bào gốc cũng khác nhau và điều đó ảnh hưởng đến động học của quá trình phục hồi khả năng tạo máu Nói chung, sử dụng tế bào gốc từ máu ngoại vi sau huy động cho thấy thời gian hồi phục bạch cầu hạt và tiểu cầu sớm nhất, sau đó là tế bào gốc tủy xương, chậm nhất là khi sử dụng tế bào gốc máu dây rốn [85] 1.3.1 Tế bào gốc tạo máu sau huy động ra máu ngoại vi Đây là nguồn tế bào định... cung cấp tế bào gốc rất phong phú và thực sự mang nhiều hứa hẹn cho ngành y học tái tạo [1],[96],[100] Được nghiên cứu đầu tiên và nhiều nhất trong nhóm này chính là các tế bào gốc tạo máu thu gom từ máu rốn Các tế bào này thể hiện khả năng biệt hoá dài hạn thành tế bào trưởng thành của tất cả các dòng tế bào máu và trường hợp ghép tế bào gốc máu rốn đầu tiên đã được tiến hành thành công vào năm 1988... ĐỀ Ghép tế bào gốc tạo máu là phương pháp điều trị hiện đại, có hiệu quả đối với các bệnh lý cơ quan tạo máu và một số bệnh lý khác Nguồn tế bào để sử dụng cho ghép chủ yếu được thu gom từ tuỷ xương, từ máu ngoại vi sau khi kích thích và từ máu dây rốn Ghép tế bào gốc đồng loại (allograft) là quá trình truyền tế bào gốc từ người cho (có hoặc không có mối quan hệ huyết thống) nhằm tái lập khả năng tạo. .. thể thu được những quần thể tế bào gốc sau: Màng ối Dịch ối R 5 + Tế bào gốc từ máu dây rốn (CBSC): Được thu gom từ nguồn máu dây rốn Bên cạnh quần thể tế bào gốc tạo máu còn có nhiều loại tế bào gốc khác như tế bào định hướng nội mạc (EPC), tế bào gốc trung mô (MSC) [33],[126] + Tế bào gốc từ mô dây rốn (UCSC): Được thu thập từ những vùng giải phẫu khác nhau của dây rốn, đều thể hiện khả năng của tế. .. nhận tế bào gốc từ tuỷ xương [30] Trường hợp ghép tế bào gốc từ máu dây rốn đầu tiên được tiến hành năm 1988 [từ 33] và từ đó trở đi, đây là nguồn tế bào gốc chủ yếu được sử dụng cho ghép ở người trưởng thành khi không tìm được người cho phù hợp Tuy nhiên, thành công của ghép tế bào gốc từ máu dây rốn thường bị hạn chế do số lượng tế bào gốc thu được thấp Về phương diện sinh học, ghép tế bào gốc từ... thêm không bệnh của người nhận ghép Từ những nguồn cung cấp chủ yếu, quá trình thu gom, xử lý và bảo quản các tế bào gốc đòi hỏi những quy trình kỹ thu t khác nhau Hiệu quả thu được những chế phẩm tế bào gốc mang những đặc điểm sinh học cũng khác nhau không những về mặt thành phần, số lượng tế bào gốc tạo máu mà còn 2 Hiện tại ở Việt Nam, phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu đã được triển khai từ nhiều... nhiều phương pháp để xác định và phân lập tế bào gốc, bao gồm: xác định dấu ấn màng tế bào, nhuộm loại trừ, nuôi cấy in vitro, đếm tế bào gốc trong ghép và phương pháp thực nghiệm trên linh trưởng a Phương pháp xác định dấu ấn màng tế bào Cho đến nay, chưa có một dấu ấn nào được cho là đặc trưng để xác định chính xác tế bào gốc tạo máu ở người Các tế bào gốc tạo máu là những tế bào mang dấu ấn CD34+ hay... về quá trình tự tái tạo, biệt hoá và chết theo chương trình Những kiến thức về chu trình tế bào giúp hoàn thiện ứng dụng ghép tế bào gốc tạo máu trên lâm sàng – một phương pháp điều trị rất hiệu quả nhiều bệnh lý ác tính và không ác tính cơ quan tạo máu cũng như các bệnh lý cơ quan khác [5],[71],[74],[101], [104],[108],[172] Có hai hình thức ghép: Ghép đồng loại: Tế bào gốc “lành lặn” của người cho sẽ . ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý, bảo quản tế bào gốc tạo máu dùng cho ghép đồng loại được tiến hành với các mục tiêu: 1. Ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý và. chọn các nguồn tế bào gốc tạo máu 26 1.4. Xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu 28 1.4.1. Xử lý tế bào gốc tạo máu sau thu gom 29 1.4.2. Bảo quản tế bào gốc tạo máu 32 1.4.3. Đánh giá và kiểm tra. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN QUANG TÙNG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH THU GOM, XỬ LÝ, BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU DÙNG CHO GHÉP ĐỒNG